第11章 生物芯片

1、第十一章第十一章 生物芯片生物芯片 生物芯片是20世紀90年代才發(fā)展起來的一項新技術，是綜合運用生物、微電子、微加工和計算機等知識制造的高科技杰作。 本質是在玻片等載體上的微型生化分析系統(tǒng)：每平方厘米可密集排列成千上萬個生物分子，能快速準確地檢測細胞、蛋白質、DNA及其它生物分子，并獲取樣品中的有關信息。何為生物芯片？何為生物芯片？l生物芯片生物芯片生物芯片的分類生物芯片的分類 根據(jù)用途還可以把生物芯片分為兩類：根據(jù)用途還可以把生物芯片分為兩類： 信息生物芯片信息生物芯片（information-biochip） 功能生物芯片功能生物芯片（function-biochip）生物芯片分析過程生物

2、芯片分析過程試樣處理試樣處理點陣固定點陣固定反應或雜交反應或雜交芯片制作芯片制作標記標記洗滌洗滌檢測掃描檢測掃描光刻合成光刻合成微量點樣微量點樣噴墨噴墨純化、標記純化、標記光化學檢測光化學檢測電化學檢測電化學檢測計算處理計算處理內容提要內容提要第一節(jié)第一節(jié)基因芯片基因芯片第二節(jié)第二節(jié)蛋白質芯片蛋白質芯片第三節(jié)第三節(jié)芯片實驗室芯片實驗室第一節(jié)第一節(jié) 基因芯片基因芯片基因研究的前沿技術基因研究的前沿技術-基因芯片技術基因芯片技術測序類測序類 基因芯片類基因芯片類 PCRPCR類類基因芯片技術的概念基因芯片技術的概念 基因芯片基因芯片(Gene chip)技術是指通過技術是指通過微陣列微陣列(Mic

3、roarray)技術將高密度技術將高密度DNA片段陣列通過高片段陣列通過高速機器人或原位合成方式以一定的順序或排列方速機器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如玻片等固相表面，以熒光標記的式使其附著在如玻片等固相表面，以熒光標記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量的探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監(jiān)測等方面研究的最新革命性技術?；虮磉_及監(jiān)測等方面研究的最新革命性技術?；蛐酒址Q基因芯片又稱DNA芯片或芯片或DNA微陣列微陣列?；蛐酒l(fā)展歷史基因芯片發(fā)展歷史DNADNA芯片的主要類型芯片的主要類型 按制備方式分：按制備方式分：原位合成芯片原位合成芯片：采

4、用顯微光蝕刻等技術在特定部：采用顯微光蝕刻等技術在特定部位原位合成寡核苷酸位原位合成寡核苷酸(ONA)(ONA)而制備的芯片。而制備的芯片。合成合成的序列較短的序列較短cDNAcDNA微集陣列微集陣列：將通過：將通過mRNAmRNA制備的（制備的（cDNA) cDNA) 片段片段以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面而以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片制成的芯片(CDA)(CDA)。固定基因的來源較靈活固定基因的來源較靈活按探針分類：按探針分類：DNADNA芯片芯片寡核苷酸陣列（芯片）寡核苷酸陣列（芯片）基因組芯片基因組芯片cDNAcDNA芯片芯片一、基本原理一、基本原理l基因

5、芯片的工作原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法基因芯片的工作原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法（southernsouthern、northernnorthern）相似。）相似。核酸印跡：核酸印跡：將將待測樣品待測樣品DNADNA（靶基因）（靶基因）固定固定于支持物上，于支持物上，用已知序列用已知序列DNADNA片段制作探針，二者按堿基互補配對原片段制作探針，二者按堿基互補配對原理雜交，檢測出欲鑒定的基因。理雜交，檢測出欲鑒定的基因?；蛐酒夯蛐酒簩⒋罅繉⒋罅恳阎蚱我阎蚱我晕㈥嚵蟹绞揭晕㈥嚵蟹绞焦潭ü潭ㄔ谥С衷谥С治锷希郎y樣品用熒光標記成探針，當探針與芯片上的物上，待測樣品用熒光標記成探

6、針，當探針與芯片上的靶基因雜交后，通過信號檢測進行定性定量分析。靶基因雜交后，通過信號檢測進行定性定量分析。 基因芯片在一微小的基片表面集成了大量的基因芯片在一微小的基片表面集成了大量的DNADNA分分子，能夠在同一時間內平行分析大量的基因，進行大信子，能夠在同一時間內平行分析大量的基因，進行大信息量的篩選與檢測分析。息量的篩選與檢測分析。二二 、基因芯片的制作、基因芯片的制作DNADNA芯片技術流程圖芯片技術流程圖芯片制作芯片制作樣品的制備樣品的制備顯微光蝕刻顯微光蝕刻壓電打印壓電打印分子打印分子打印原位合成芯片原位合成芯片固定基因設計制備固定基因設計制備支持物預處理支持物預處理打印打印固化

7、固化DNADNA微集陣列微集陣列樣品核酸的樣品核酸的提取與純化提取與純化擴增與標記擴增與標記 標記樣品標記樣品 的純化的純化雜交、清洗雜交、清洗掃描與分析掃描與分析基因芯片技術流程基因芯片技術流程1. 1. 芯片制備芯片制備- -目前制備芯片主要以玻璃片或硅片為載體，目前制備芯片主要以玻璃片或硅片為載體，采用原位合成和微矩陣的方法將寡核苷酸片段或采用原位合成和微矩陣的方法將寡核苷酸片段或cDNAcDNA按順序排列在載體上。芯片的制備除了用到微加工工按順序排列在載體上。芯片的制備除了用到微加工工藝外，還需要使用機器人技術。以便能快速、準確地藝外，還需要使用機器人技術。以便能快速、準確地將探針放置

8、到芯片上的指定位置。將探針放置到芯片上的指定位置。 2. 2. 樣品制備樣品制備- -生物樣品往往是復雜的生物分子混合體，除生物樣品往往是復雜的生物分子混合體，除少數(shù)特殊樣品外，一般不能直接與芯片反應，有時樣少數(shù)特殊樣品外，一般不能直接與芯片反應，有時樣品的量很小。所以，必須將樣品進行提取、擴增，獲品的量很小。所以，必須將樣品進行提取、擴增，獲取其中的蛋白質或取其中的蛋白質或DNADNA、RNARNA，然后用熒光標記，以，然后用熒光標記，以提高檢測的靈敏度和使用者的安全性。提高檢測的靈敏度和使用者的安全性。3. 3. 雜交反應雜交反應- -雜交反應是熒光標記的樣品與芯片上的雜交反應是熒光標記的

9、樣品與芯片上的DNADNA片段進行的反應片段進行的反應, ,產(chǎn)生一系列信息的過程。選擇產(chǎn)生一系列信息的過程。選擇合適的反應條件能使生物分子間反應處于最佳狀況合適的反應條件能使生物分子間反應處于最佳狀況中，減少生物分子之間的錯配率。中，減少生物分子之間的錯配率。 4. 4. 信號檢測和結果分析信號檢測和結果分析- - -雜交反應后的芯片上各個反雜交反應后的芯片上各個反應點的熒光位置、熒光強弱經(jīng)過芯片掃描儀和相關應點的熒光位置、熒光強弱經(jīng)過芯片掃描儀和相關軟件可以分析圖像，將熒光轉換成數(shù)據(jù)，即可以獲軟件可以分析圖像，將熒光轉換成數(shù)據(jù)，即可以獲得有關生物信息。得有關生物信息。 基因芯片的基本要素基因

10、芯片的基本要素固相介質：固相介質：硅片、二氧化硅、玻璃、尼龍膜、塑料等硅片、二氧化硅、玻璃、尼龍膜、塑料等靶片段：靶片段：DNADNA、寡核苷酸、寡核苷酸、RNARNA等等探探 針：針：mRNAmRNA，或是以，或是以mRNAmRNA為模板合成的為模板合成的cDNAcDNA標記物：標記物：熒光劑熒光劑( (如如Cy3Cy3、Cy5), Cy5), 同位素、地高辛等同位素、地高辛等1.1.支持物的預處理支持物的預處理（略）（略） (1) (1)原位合成芯片的制備原位合成芯片的制備 A.A.光介導原位合成法光介導原位合成法：先將載體：先將載體 優(yōu)點：優(yōu)點： 合成效率高，點陣密度高；合成效率高，點陣

11、密度高； 缺點：缺點： 設備昂貴，技術復雜，反應產(chǎn)率低。設備昂貴，技術復雜，反應產(chǎn)率低。( (一一) )芯片的制備芯片的制備原位合成原位合成(In Situ Synthesis)B.B.壓電打印法：壓電打印法：壓電毛細管噴射器壓電毛細管噴射器優(yōu)點：優(yōu)點：設備廉價，技術相設備廉價，技術相對簡單，反應產(chǎn)率高。對簡單，反應產(chǎn)率高。缺點：缺點：點陣密度低，易產(chǎn)點陣密度低，易產(chǎn)生交叉污染。生交叉污染。(2)DNA(2)DNA微集陣列的制備微集陣列的制備方式方式：預先合成寡聚核苷酸、預先合成寡聚核苷酸、cDNAcDNA或或DNADNA基基因組通過高速點樣打印到芯片上。因組通過高速點樣打印到芯片上。A.DN

12、AA.DNA片段的制備片段的制備已克隆的基因片段已克隆的基因片段PCRPCR，RT-PCRRT-PCR擴增的基因片段擴增的基因片段人工合成的人工合成的DNADNA片段片段 ( (單鏈、雙鏈、單鏈、雙鏈、DNADNA或或RNA RNA 均可均可) )B. B. 打印打印噴墨打?。ǚ墙佑|式點樣）噴墨打印（非接觸式點樣）針式打?。ń佑|式點樣）針式打?。ń佑|式點樣）點陣芯片的制作技術點陣芯片的制作技術DNADNA點陣芯片點陣芯片 C. C.固化固化 打印打印DNADNA片段后，需要將其固定在支持物片段后，需要將其固定在支持物表面，同時也要封閉支持物上未打印區(qū)域以表面，同時也要封閉支持物上未打印區(qū)域以防

13、止核酸樣品的非特異性固定。防止核酸樣品的非特異性固定。( (二二) )測定樣品的準備測定樣品的準備1.1.樣品的分離純化樣品的分離純化DNA ,mRNADNA ,mRNA2.2.擴增擴增PCR, RTPCR, RT-PCRPCR，固相，固相PCRPCR3.3.標記等過程標記等過程 熒光標記熒光標記( (常用常用Cy3Cy3、Cy5),Cy5),生物素生物素, ,放射性標記放射性標記4.4.標記后樣品的純化標記后樣品的純化多種熒光染料多種熒光染料16 economical and sensitivie fluorescent dye alternatives scanned with ScanA

14、rray 5000.( (三三) )分子雜交分子雜交樣品與樣品與DNADNA芯片上的陣列進行雜交。芯片上的陣列進行雜交。與經(jīng)典分子雜交的區(qū)別：與經(jīng)典分子雜交的區(qū)別：1.1.雜交時間短，雜交時間短，3030分鐘內完成；分鐘內完成；2.2.可同時平行檢測許多基因序列?？赏瑫r平行檢測許多基因序列。影響雜交反應的因素：影響雜交反應的因素：鹽濃度、溫度、反應時間、鹽濃度、溫度、反應時間、DNADNA二級結構二級結構分分子子雜雜交交( (四四) )檢測分析檢測分析1.1.激光激發(fā)使熒光標記激光激發(fā)使熒光標記DNADNA片段發(fā)射熒光片段發(fā)射熒光2.2.激光掃描儀或激光共聚焦顯微鏡采集各激光掃描儀或激光共聚焦

15、顯微鏡采集各雜交點的信號雜交點的信號3.3.軟件進行進行圖象分析和數(shù)據(jù)處理軟件進行進行圖象分析和數(shù)據(jù)處理芯片信息采集：芯片信息采集：熒光標記熒光標記雙波長掃描雙波長掃描激光激發(fā)光源激光激發(fā)光源共聚焦掃描共聚焦掃描計算機處理計算機處理ScanArray Lite 三、三、DNADNA芯片技術的應用芯片技術的應用（一）應用之一（一）應用之一基因表達譜基因表達譜（gene expression pattern)紅色紅色: : 上調上調黃色黃色: : 不變不變綠色綠色: : 下調下調 基因表達譜芯片基因表達譜芯片應用最為廣泛，技術上也最成熟。應用最為廣泛，技術上也最成熟。這種芯片可以檢測整個基因組范圍

16、的眾多基因這種芯片可以檢測整個基因組范圍的眾多基因在在mRNAmRNA表達水平的變化。表達水平的變化。它能對來源于不同個體、不同組織、不同細胞它能對來源于不同個體、不同組織、不同細胞周期、不同發(fā)育階段、不同分化階段、不同生周期、不同發(fā)育階段、不同分化階段、不同生理病理、不同刺激條件下的組織細胞內基因表理病理、不同刺激條件下的組織細胞內基因表達情況進行對比分析。從而對基因群在個體、達情況進行對比分析。從而對基因群在個體、組織、發(fā)育、分化、疾病、刺激等條件下的特組織、發(fā)育、分化、疾病、刺激等條件下的特異性的變化特征和規(guī)律進行描述。異性的變化特征和規(guī)律進行描述。應用舉例：應用舉例：檢測人正常肝細胞與

17、肝癌細胞中差別表達的基因檢測人正常肝細胞與肝癌細胞中差別表達的基因將將40964096條人條人cDNAcDNA制備成表達芯片。制備成表達芯片。 （1500條為已知基因，2548未知， 16個陰性對照基因，32個空白點。）提取人正常肝和肝癌組織提取人正常肝和肝癌組織mRNAmRNA，逆轉錄成，逆轉錄成cDNAcDNA。將將Cy3Cy3和和Cy5Cy5熒光分別標記到兩種來源的熒光分別標記到兩種來源的cDNAcDNA。與芯片雜交、掃描。與芯片雜交、掃描。計算機數(shù)據(jù)處理，判斷差別表達的基因。計算機數(shù)據(jù)處理，判斷差別表達的基因。 標準：標準：1 1、Cy3Cy3與與Cy5Cy5表達差別表達差別22。 2

18、 2、Cy3Cy3或或Cy5Cy5信號值信號值10001000。（二）（二）DNADNA測序：測序：雜交測序（雜交測序（SBHSBH）TCGGATCGTCGGATCG CGGATCGA GGATCGAC GATCGACT ATCGACTTTCGGATCGACTT6553665536個個八核苷酸陣列八核苷酸陣列CGGATCGAATCGACTTGATCGACTGGATCGACAGCCTAGCTGAA 生物芯片能為現(xiàn)代醫(yī)學科學及醫(yī)學診斷學的發(fā)展生物芯片能為現(xiàn)代醫(yī)學科學及醫(yī)學診斷學的發(fā)展提供強有力的手段，促進醫(yī)學從提供強有力的手段，促進醫(yī)學從“系統(tǒng)、血管、組系統(tǒng)、血管、組織和細胞層次織和細胞層次”(”

19、(通常稱之為通常稱之為“第二階段醫(yī)學第二階段醫(yī)學”)”)向向“DNADNA、RNARNA、蛋白質及其相互作用層次蛋白質及其相互作用層次”(”(第三第三階段醫(yī)學階段醫(yī)學) )過渡，使之快速進入實際應用過渡，使之快速進入實際應用。（三）臨（三）臨 床床 診診 斷斷（四）基因診斷：（四）基因診斷： 尋找和檢測與疾病相關的基因及在尋找和檢測與疾病相關的基因及在RNARNA水水平上檢測致病基因的表達平上檢測致病基因的表達（五）藥物研究與開發(fā)（五）藥物研究與開發(fā)： 1.1.藥物篩選藥物篩選 2.2.合理用藥合理用藥 3.3.中草藥鑒定中草藥鑒定（六）癌癥研究（六）癌癥研究基因芯片的優(yōu)點：基因芯片的優(yōu)點：1

20、.高通量高通量2.大規(guī)模大規(guī)模3.高度平行性高度平行性4.快速高效快速高效5.高靈敏度高靈敏度6.高度自動化高度自動化基因芯片的缺點基因芯片的缺點內容提要內容提要第一節(jié)第一節(jié)基因芯片基因芯片第二節(jié)第二節(jié)蛋白質芯片蛋白質芯片第三節(jié)第三節(jié)芯片實驗室芯片實驗室l固定于載體上的固定于載體上的蛋白質樣品蛋白質樣品（靶蛋白）以（靶蛋白）以陣列方陣列方式式構成，構成，待待測測樣品樣品用熒光染料或同位素標記用熒光染料或同位素標記制備制備成探針成探針與芯片與芯片雜交雜交，雜交信號用激光掃描儀或放，雜交信號用激光掃描儀或放射射自自顯影檢測及計算機分析檢測結果。顯影檢測及計算機分析檢測結果。l蛋白質芯片適合于蛋白質

21、蛋白質、蛋白質核蛋白質芯片適合于蛋白質蛋白質、蛋白質核酸（酸（DNADNA、RNARNA）、蛋白質小分子之間的相互作）、蛋白質小分子之間的相互作用分析；適合功能基因組、蛋白組研究。用分析；適合功能基因組、蛋白組研究。第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質芯片蛋白質芯片一、蛋白質芯片特點一、蛋白質芯片特點l蛋白質不能用擴增方法提高拷貝數(shù)來達到要求的蛋白質不能用擴增方法提高拷貝數(shù)來達到要求的靈敏度；靈敏度；l蛋白質與蛋白質間的特異作用主要是抗原抗體蛋白質與蛋白質間的特異作用主要是抗原抗體或配體受體的反應；或配體受體的反應；l反應的實質是專一性，而非序列的特異性。反應的實質是專一性，而非序列的特異性。二、蛋白組研究動

22、態(tài)二、蛋白組研究動態(tài)l雙向電泳雙向電泳l蛋白質芯片蛋白質芯片l雙鏈雙鏈DNADNA芯片與相關蛋白質的作用芯片與相關蛋白質的作用三、制備蛋白質芯片三、制備蛋白質芯片蛋白質分子以共價結蛋白質分子以共價結合方式固定于玻片合方式固定于玻片固定固定封阻封阻醛基化醛基化（適合蛋白質分子）（適合蛋白質分子）1、共價結合法：、共價結合法： BSA-BSA-羥基琥珀?；u基琥珀?；ㄟm合多肽、小分子蛋白）（適合多肽、小分子蛋白）三、制備蛋白質芯片三、制備蛋白質芯片2、凝膠墊結合法：、凝膠墊結合法：蛋白質樣品通過覆蓋于表面的微型蛋白質樣品通過覆蓋于表面的微型聚丙烯酰胺凝膠墊固定于玻片上聚丙烯酰胺凝膠墊固定于玻片上第一步：用光促聚合法制備微型聚丙烯酰胺凝膠墊；第二步：用戊二醛/水合肼活化凝膠，使之與蛋白質偶聯(lián)。四、制備蛋白質探針四、制備蛋白質探針l熒光試劑標記：熒光試劑標記：熒光素、羅丹明、德克薩斯紅等；熒光素、羅丹明、德克薩斯紅等；l生物素標記