hIGF1基因轉(zhuǎn)染促進退變椎間盤Ⅱ型膠原的表達

1、hIGF-1基因轉(zhuǎn)染促進退變椎間盤型膠原的表達 作者：黃宗強，劉尚禮，鄭召民【摘要】 目的探討人胰島素樣生長因子（human insulin-like growth factor-1,hIGF-1)基因在退變椎間盤中的表達及對椎間盤中型膠原表達的影響。方法參考文獻1制備出腰椎間盤退變（intervertebral disk degeneration,IVDD)動物模型24只，隨機分為攜帶hIGF-1基因重組腺病毒（Ad/CMV-hIGF-1)、hIGF-1生長因子及PBS組。L4、5、L5、6椎間盤中分別注射25 l第2代Ad/CMV-hIGF-1(8×108 PFU)、hIGF-1

2、生長因子（100 g/L)、PBS。注射后1、2、4、8周，Western blot檢測hIGF-1蛋白表達；半定量RT-PCR檢測型膠原mRNA的表達。結(jié)果hIGF-1蛋白帶出現(xiàn)在7 540.00 u。Ad/CMV-hIGF-1組hIGF-1蛋白表達持續(xù)達4周以上，hIGF-1組表達持續(xù)約2周；PBS注射組無hIGF-1蛋白表達。型膠原電泳條帶出現(xiàn)在200300 bp；在注射后14周，Ad/CMV-hIGF-1組內(nèi)型膠原mRNA相對表達量進行性增加，8周輕度下降，4個時期比較（F=12.18，P0.001)；注射后18周，hIGF-1注射組、PBS注射組型膠原mRNA相對表達量進行性下降（F

3、=27.38、21.56，P0.001)。相同時間點3組比較，型膠原mRNA相對表達量Ad/CMV-hIGF-1組最高，PBS組最低（F=27.3139.85，P0.001）。結(jié)論hIGF-1基因在退變椎間盤中的表達能夠促進合成2 / 20型膠原。 【關(guān)鍵詞】 椎間盤； 退變；表達； hIGF-1 AbstractObjectiveTo study the role of hIGF-1 gene on collagen type expression of degenerative intervertebral disk.MethodTwenty-four male New-Zealand r

4、abbits intervertebral disk degenerontion (IVDD) models were done according to reference and randomly divided into Ad-CMV-hIGF-1,hIGF-1 growth factor and PBS group.Twenty five microlitre the second generation Ad/CMV-hIGF-1(T=80×109 PFU/L),hIGF-1 growth factor(100 g/L)and PBS were respectively in

5、jected into L4、5,L5、6 intervertebral disk under fluoroscopic guidance.One,two,four and eight weeks post-operation,rabbits were sacrificed,intervertebral disk samples were harvested.Total proteins of equal mass intervertebral disks were extracted,isolated in SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis(SDS

6、-PAGE)and transferred to polyvinylidene difluoride(PVDF)Millipore.The hIGF-1 growth factor expression were indentified with Western blot.Collagen type gene fragments were amplified with RT-PCR,and relative expression was done with GAPDH as intern control.ResultThe hIGF-1 interest protein existed at

7、7.6 Kilo-Dalton.At one week after injection,its expression quantities were almost equal between Ad/CMV-hIGF-1 and hIGF-1 growth factor group.At two week after injection,it obviously declined in hIGF-1 growth factor group.At four week after injection,it still expressed in Ad/CMV-hIGF-1 group.At eight

8、 week after injection,it did not express in theree groups.Collagen type mRNA relative expressions increased significantly from one to four weeks after injection,declined slightly at the end of eight weeks in Ad/CMV-hIGF-1 group.However,they appeared to decrease continuously in the other two groups w

9、ith time.At the corresponding phases,those in PBS group were the lowest.ConclusionAd/CMV-hIGF-1 could successfully infect degenerative intervertebral disk.The hIGF-1gene expression could last four weeks and could stimulate collagen type synthesis in Ad/CMV-hIGF-1 group. Key words：intervertebral disk

10、; degeneration; expression; insulin-like growth factor-1 椎間盤退變（intervertebral disk degeneration,IVDD）的確切分子生物學機制尚不明確。多數(shù)學者認為IVDD為多因素協(xié)同作用的結(jié)果，與椎間盤中細胞營養(yǎng)下降、力學及遺傳等因素有關(guān)，但細胞因子減少及致炎因子增多等分子生物學改變在發(fā)病中起主要作用2。1991年，Thompson等3檢測了多種細胞因子能夠促進犬椎間盤細胞分泌細胞外基質(zhì)，開始了生長因子應用于椎間盤的體外實驗研究，而后相繼出現(xiàn)了多篇文獻報道4。但椎間盤細胞的體外培養(yǎng)條件與體內(nèi)椎間盤細胞所處的內(nèi)環(huán)境

11、有明顯差異：生長因子維持作用短暫；發(fā)揮作用需要多次或者連續(xù)給藥，造成給藥途徑引發(fā)感染等；另外生長因子的費用亦不菲。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展為解決生長因子持續(xù)作用于椎間盤帶來便捷之道。Nishida等5以腺病毒為載體，將Lac Z基因、TGF-1基因轉(zhuǎn)染到正常成年兔椎間盤獲得成功。但與正常椎間盤有明顯區(qū)別的是，椎間盤發(fā)生退變后，其細胞數(shù)量減少功能不活躍，在生物學特性方面與正常細胞存在明顯差異。退變的椎間盤細胞在椎間盤退變的生物學環(huán)境中能否被轉(zhuǎn)染仍是未知。即便能夠轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后基因表達水平如何，能否起到修復IVDD的作用，均需進一步研究。本研究將自行構(gòu)建的Ad/CMV-hIGF-1載體6直接注入新西蘭大白兔

12、IVDD模型1，觀察hIGF-1表達水平及表達后對退變椎間盤細胞合成型膠原的影響，旨在通過體內(nèi)實驗，為IVDD的基因治療提供直接實驗依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 主要實驗材料、儀器及設備 TRIzol試劑（GIBCO BRL，美國）；DEPC、PCR引物及Tween 20（上海生物工程有限公司，中國）；RNA酶抑制劑（華美公司，中國）；蛋白質(zhì)檢測試劑盒（Bio-Rad公司，美國）；鼠抗人IGF-I單克隆抗體（R&D Systems Inc,美國）；辣根過氧化物酶結(jié)合的抗鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology,英國）；預染蛋白質(zhì)分子量Marker(New E

13、ngland BioLabs Inc,英國）；PVDF膜（Millipore,美國）；丙烯酰胺，抑蛋白酶肽，苯甲基磺酰氟及N，N-亞甲雙丙烯酰胺（Amresco,美國）；N，N，N，N-四甲基乙二胺（Sigma,美國）；DNA Marker及RT-PCR試劑盒（Takara公司，中國）；PCR儀（PE公司，美國）；Hettich 32R臺式低溫高速離心機（Heraeus,德國）；臺式常溫高速離心機（Eppendorf 5415c,德國）；恒壓恒流水平電泳儀及垂直電泳電轉(zhuǎn)移槽（Bio-Rad，美國）；-80 低溫冰箱，立式大型水平離心機及Biofuge 22R臺式低溫離心機（Heraeus,德國

14、）;凝膠攝像系統(tǒng)（Polaroid,美國）；XW-80漩渦振蕩器及振動搖床（上海躍進醫(yī)療器械廠，中國）。 1.2 動物實驗 1.2.1 hIGF-1生長因子、第2代Ad/CMV-hIGF-1載體溶液的配制 將hIGF-1生長因子用PBS溶液稀釋，分裝入EP管中，每管2.5×10-3 g，-70 保持，使用前加PBS至25 l，每個椎間盤注入的劑量為2.5×10-3 g。參考文獻7合成的第2代Ad/CMV-hIGF-1載體稀釋到每25 l含有2×106 PFU。每個椎間盤注入的腺病毒總量為2×106 PFU。 1.2.2 腰IVDD動物模型制備、給藥及標本

15、制備 參考文獻1制備出腰IVDD動物模型24只，隨機分為Ad/CMV-hIGF-1、hIGF-1生長因子及PBS組，每組有新西蘭大白兔8只。實驗動物用氯氨酮針3550 mg/kg、氯丙嗪針1025 mg/kg聯(lián)合肌肉注射，動物麻醉成功后，右側(cè)臥位于手術(shù)臺（本研究組設計定做）。在X線透視下，用硬脊膜穿刺針穿刺L4、5、L5、6椎間盤，穿刺成功后，拔出硬脊膜穿刺針內(nèi)塞，放入腰麻針。用100 l微量移液器依動物分組各注射攜帶hIGF-1基因的腺病毒載體（滴度為80×109 PFU/L）、hIGF-1生長因子（100 g/L)、PBS，注入容量為25 l。分別于注射后1、2、4、8周，各組實

16、驗動物均取2只，動物麻醉后，穿刺耳緣靜脈注入10 ml空氣致死。迅速切取腰椎全段，切除椎板及附著肌肉，分別切取L4、5、L5、6椎間盤，去除上下軟骨終板，僅保留完整的纖維環(huán)、髓核組織。 1.2.3 Western blot檢測hIGF-1蛋白表達 1.2.3.1 組織總蛋白質(zhì)提取及濃度測定 （1）組織剪碎：于0 以PBS充分洗滌組織碎片，4 3 000 r/min離心5 min，估算離心管底部沉淀物體積；吸出上清液。（2）以5倍體積預冷的懸浮緩沖液分散組織碎片，盡快加入等體積的2×SDS凝膠加樣緩沖液。（3）將樣品置于沸水浴中加熱10 min，采用帶有浸入尖頭或能在冷卻杯中同時處理多

17、個樣品的超聲處理儀對DNA進行剪切。（4）于室溫以10 000r/min將樣品離心10 min，將上清液移于另一管中，棄去沉淀物。（5）按Bio-Rad蛋白質(zhì)檢測試劑盒說明檢測樣品蛋白濃度。 1.2.3.2 Western blot檢測hIGF-1蛋白表達 （1）制備SDS聚丙烯酰胺分離膠（8 ml)、12%的SDS聚丙烯酰胺濃縮膠（3 ml)。（2）加樣：每樣本各取總蛋白50 g,加等體積2×SDS上樣緩沖液（約10 l），混勻，另一管加預染蛋白Marker(用于考馬斯亮藍染色）或辣根過氧化物酶結(jié)合的生物素化蛋白Marker(用于Western-blot)20 l，瞬時離心使溶液沉

18、于管底，標本和蛋白Marker均于沸水中煮沸35 min，按順序用微量加樣品將每管樣本中的全部溶液或蛋白Marker加入樣品孔中。（3）電泳：于120 V恒壓條件下電泳，當溴芬藍染料進入分離膠后，電泳條件改為恒壓220 V，繼續(xù)電泳直至染料達到膠底。（4）考馬斯亮藍染色：取出電泳玻板，小心取出凝膠，將凝膠放入一培養(yǎng)皿中，倒入0.25%考馬斯亮藍染色液，放在搖動的脫色搖床上于室溫染色40 min。然后倒出并回收染色液，加入脫色液，平緩搖動，直到出現(xiàn)明顯的藍色的蛋白條帶。（5）半干式電印跡轉(zhuǎn)膜，Western blot檢測hIGF-1生長因子表達：用封閉液封閉PVDF膜；用0.1 mol/L PB

19、ST洗滌PVDF膜5 min×1次；用一抗孵育PVDF膜，4 過夜；用0.1 mol/L PBST振蕩洗滌PVDF膜5 min×2次;37 用1200二抗孵育PVDF膜1 h；用0.1 mol/L PBST振蕩洗滌PVDF膜5 min×4次；DAB顯色。 1.2.4 半定量RT-PCR監(jiān)測型膠原mRNA的表達 參照文獻8半定量RT-PCR監(jiān)測型膠原mRNA的表達。 2 結(jié) 果 2.1 hIGF-1基因在椎間盤中的表達 注射后1、2、4及8周，SDS-PAGE顯示3組實驗動物的椎間盤組織均有不同分子量的蛋白條帶，肉眼觀察在蛋白表達量上無明顯差異。Western bl

20、ot顯示hIGF-1目的蛋白帶出現(xiàn)在7.54×103 u，與理論值相符（圖1）。注射后1周，Ad/CMV-hIGF-1注射組、hIGF-1注射組均出現(xiàn)hIGF-1蛋白帶，其表達量大致相同，PBS注射組無目的蛋白帶出現(xiàn)（圖2）；注射后2周，Ad/CMV-hIGF-1注射組、hIGF-1注射組仍出現(xiàn)hIGF-1蛋白帶，但hIGF-1注射組表達量明顯下降；注射后4周，Ad/CMV-hIGF-1注射組出現(xiàn)hIGF-1蛋白帶，但表達量已經(jīng)開始下降，hIGF-1注射組未出現(xiàn)hIGF-1蛋白帶（圖3）；注射后8周，3組實驗動物的椎間盤組織均未出現(xiàn)hIGF-1蛋白帶。 圖1注射后不同時期，Ad/CM

21、V-hIGF-1組hIGF-1表達的Western blot鑒定 M：蛋白marker;Lane 1:注射后1周；Lane 2:注射后2周；Lane 3:注射后4周；Lane:注射后8周 圖2注射后1周，3組hIGF-1表達Western blot鑒定 M:蛋白marker;Lane 1:Ad-CMV-hIGF-1組；Lane 2:hIGF-1生長因子組；Lane 3:PBS組 圖3注射后4周，3組hIGF-1表達的Western blot鑒定 M：蛋白marker;Lane 1:Ad/CMV-hIGF-1組；Lane 2:hIGF-1生長因子組；Lane 3:PBS組 2.2 轉(zhuǎn)hIGF-1

22、基因?qū)π湍z原的影響 型膠原和GAPDH分別出現(xiàn)在200300 bp、500600 bp處，與引物設計預想得到的片段相同；在注射后14周，Ad/CMV-hIGF-1組內(nèi)型膠原mRNA相對表達量進行性增加，8周顯著下降，4個時期總的比較有統(tǒng)計學差異（F=12.18，P0.05),注射后4周和8周相比，有統(tǒng)計學差異（P0.05）；注射后18周，hIGF-1注射組、PBS注射組型膠原mRNA相對表達量進行性下降，組內(nèi)4個時期相比，有統(tǒng)計學差異（P0.05），hIGF-1注射組注射后4周和8周相比，無統(tǒng)計學差異（P0.05）；相同時間內(nèi)，PBS組的表達量最低（表1）。表1不同處理因素不同時期型膠原mRN

23、A相對表達量（略） 3 討 論 3.1 hIGF-1目的基因在兔椎間盤中的表達 Western blot是檢測目的基因在組織中表達的較常用且最靈敏的方法。本研究采用Western blot手段檢測注射到兔椎間盤中的hIGF-1生長因子等的表達，發(fā)現(xiàn)術(shù)后1周，2組中均有hIGF-1目的蛋白的表達，且表達量基本相同；術(shù)后2周，在2組中仍能檢測到hIGF-1的表達，但生長因子組表達量明顯下降；術(shù)后4周，僅能在hIGF-1目的基因組檢測到hIGF-1的表達，但生長因子組表達量明顯下降。PBS組無hIGF-1的表達。實驗結(jié)果表明：hIGF-1目的基因在兔椎間盤中的表達至少持續(xù)4周以上，而hIGF-1生長

24、因子在兔椎間盤中存在僅2周左右。hIGF-1生長因子持續(xù)時間較短可能與生長因子的半衰期有關(guān)。 Nishida等9將Lac Z標志基因直接注射兔椎間盤，結(jié)果顯示標志基因的表達至少持續(xù)12周左右。Paul等10將Sox 9基因用腺病毒攜帶直接注射兔椎間盤，發(fā)現(xiàn)其表達持續(xù)5周以上。季愛玉等11研究發(fā)現(xiàn)hIGF-1基因表達對椎間盤蛋白多糖的影響持續(xù)達12周左右。本研究目的基因的表達與文獻報道存在差異，原因可能如下：（1）實驗動物不同，本實驗采用兔椎間盤退變模型，而文獻中采用正常的新西蘭大白兔，正常和退變的新西蘭大白兔椎間盤內(nèi)環(huán)境可能存在極大的差異；（2）腺病毒的純度存在差異，本研究由于實驗室無低溫超速

25、離心機，故對實驗所用的腺病毒未進行純化處理，文獻中可能采用的腺病毒純度較高；（3）實驗檢測手段差異；（4）腺病毒滴度差異。Paul等采用的病毒滴度為1×109 PFU。季愛玉等采用的為6×106 PFU。本研究采用的病毒滴度為2×106 PFU。 3.2 hIGF-1基因表達對兔椎間盤型膠原的影響 型膠原是兔椎間盤主要細胞外基質(zhì)，對穩(wěn)定椎間盤細胞內(nèi)環(huán)境至關(guān)重要。生長因子促細胞增殖作用被認為與濃度有關(guān)，有量-效關(guān)系，存在最佳濃度，100 g/L hIGF-1為刺激髓核細胞合成PG的最適濃度12。本研究采用該劑量的hIGF-1生長因子直接注射兔椎間盤，結(jié)果顯示型膠原m

26、RNA相對表達在注射后18周表達量持續(xù)下降，各時間點數(shù)值比較存在統(tǒng)計學差異（P0.05）。說明hIGF-1生長因子刺激兔椎間盤細胞合成型膠原的作用可能被兔持續(xù)存在的椎體間失穩(wěn)導致的椎間盤繼續(xù)退變所抵消。 1998年，Nishida等9用腺病毒將外源基因帶入實驗動物的椎間盤，相繼出現(xiàn)幾篇關(guān)于IVDD基因治療的報道4。本研究結(jié)果顯示腺病毒載體能夠?qū)⒂兄委熥饔玫膆IGF-1基因帶入退變的椎間盤，hIGF-1基因的表達具有時效性，但促進兔椎間盤分泌型膠原的作用弱于文獻報道5，其原因可能與多種因素有關(guān)。首先，采用的實驗動物模型仍然存在椎間失穩(wěn)，在接受轉(zhuǎn)基因治療同時，仍承受著椎間失穩(wěn)影響，椎間盤內(nèi)發(fā)生著修

27、復與破壞的交互作用。椎間失穩(wěn)勢必影響IVDD基因治療效果。其次，本研究采用IVDD的新西蘭大白兔動物模型，其軟骨終板已經(jīng)發(fā)生了明顯變化。軟骨終板是椎間盤營養(yǎng)通路，軟骨終板鈣化必然會引起椎間盤營養(yǎng)代謝障礙，并妨礙椎間盤修復活動1。再者，從轉(zhuǎn)染效應可見，型膠原mRNA相對表達量雖然有所增加，但增加幅度不明顯，顯示轉(zhuǎn)染生長因子的修復效應與退變椎間盤的修復要求可能還有相當距離?！緟⒖嘉墨I】 1 黃宗強，劉尚禮，鄭召民，等.雙側(cè)關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)切除致椎間盤退變的影像學觀察J.中國矯形外科雜志,2006,23:1810-1812.2 黃宗強，劉尚禮，鄭召民.椎間盤退變的分子生物學研究進展J.中國矯形外科雜志，2003,1:55-56.3 Thompson JP,Oegema TR,Bradford DS.Stimulation of mature canine intervertebral disc by growth factorsJ.Spine,1991,3:253-260.4 鄭召民，黃宗強，劉尚禮.椎間盤再生研究進展J.中國矯形外科雜志，2003,5:341-342.5 Nishida K,Kang JD,Gilbertson LG,et al.Modulation of the biologic activity o