黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的實驗報告

1、黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的實驗報告1.總黃酮的測定1.1 實驗儀器電子天平AR2140;紫外可見分光光度計UV2754;型數(shù)控超聲波清洗器KQ3200DB;超級恒溫槽;Rotavapor R200 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 ; FD21C250 冷凍干燥機2 1.2 試劑及藥品蘆丁 標(biāo)準(zhǔn)品硝酸鋁 國產(chǎn)分析純（配成5 %）亞硝酸鈉 國產(chǎn)分析純（配成10 %）氫氧化鈉 國產(chǎn)分析純配成（配成1mol/L）95%乙醇，無水乙醇 國產(chǎn)分析純（配成60%乙醇 50%乙醇）DPPH·（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯代苦味肼基自由基）Vc（Ascrobic acid，維生素 C，抗壞血酸

2、）沒食子酸對照品：基準(zhǔn)純。大青葉子 采摘于海南大學(xué)東坡湖畔 1.3實驗步驟： 1.3.1準(zhǔn)備工作及波長的確定樣品60烘干粉碎機粉碎，過20目篩，裝入試劑瓶中備用。根據(jù)查閱文獻總黃酮在波長為510nm處吸收值最大。 1.3.2參照品蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精密稱取120 干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品37.5mg置于100mL燒杯中,用60%乙醇溶解后定容至25mL 容量瓶中,搖勻，即可得1.5mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。 1.3.3標(biāo)準(zhǔn)品的測量及繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL ,分別置于10mL 容量瓶中，并定容至刻度線。得到0.0mg/ml、0.

3、15mg/ml、0.3mg/ml、0.45mg/ml、0.6mg/ml、0.75mg/ml、0.9mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取1ml到試管中各加5 %亞硝酸鈉溶液0.3mL 搖勻,放置6min ,加10%硝酸鋁溶液0.3mL 搖勻,放置6min ,加1mol /L氫氧化鈉溶液4mL ,再用60%乙醇溶液稀釋至刻度,放置15min 后,分別在510nm 處測定其吸光度（Tai,Cai&Dai,2011）。（以試劑空白做參比）以吸光度A 為縱坐標(biāo),濃度c為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用最小二乘法進行線性擬合,得c與A 的線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)R2。序號濃度（ug/ml）吸光度1002150.

4、180 3300.349 4450.546 5600.727 6750.884 7901.063 表1-1： 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線測定數(shù)據(jù)圖1-2：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線1.3.5樣品的測試根據(jù)查閱文獻總黃酮在波長為510nm處吸收值最大。取黃酮提取液， 取提液2ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度線則稀釋5倍。取稀釋好的溶液4份1ml置入10ml的比色管中，其中一份用60%的乙醇定容，作為參比溶液。其余各份各加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL 搖勻,放置6min ,加10%硝酸鋁溶液0.3mL 搖勻,放置6min ,加1mol 氫氧化鈉溶液4mL ,再用60%乙醇溶液稀釋至刻度,放置15min后,分別在

5、510nm處測定其吸光度。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程可得濃度數(shù)據(jù)（以蘆丁為參比）,三次結(jié)果取平均值。經(jīng)換算后得樣品中總黃酮含量。樣品總黃酮含量(mg/g)=X*n*V1/( V *W)式中：X測出的濃度，mg/ mL;（直接代入，不用換算。）n稀釋倍數(shù)，量綱為1;VI樣液總體積，mL;V測定時取樣體積，mL;W樣品質(zhì)量，g。2.總分含量的測定 2.1 實驗儀器ALZO4型電子分析天平:上海梅特勒一托利多儀器有限公司;DELA犯O型pH計:上海梅特勒一托利多儀器有限公司;723可見分光光度計:上海菩華科技儀器有限公司;DK一512型電熱恒溫水浴鍋:上海森信實驗儀器有限公司;容量瓶(250mL，10Om

6、L，25mL)、比色管管(10mL);燒杯、移液管、吸耳球。2.2試劑及藥品沒食子酸對照品：基準(zhǔn)純，購于上海分析試劑廠，置50真空干燥箱真空中干燥4 h。乙醇為工業(yè)級，蒸餾水，其他試劑均為分析純。2.3 FolinCiocalteu比色法測定總酚酸含量 3.3.1 FolinCiocalteu試劑的配制稱取20 g鎢酸鈉和5 g鉬酸鈉于圓底燒瓶中，用140 ml蒸餾水溶解，加入10ml 85的磷酸溶液和20 ml濃鹽酸，文火回流10 h，然后加入3 g硫酸鋰及15 ml雙氧水，加熱沸騰15 min至亮黃色，不得帶微藍和綠色。冷卻，移入250 ml容量瓶中，定容，貯于棕色瓶中，4冰箱保存。 2.

7、3.2對照品溶液制備準(zhǔn)確稱取1500 mg干燥的沒食子酸，加蒸餾水適量，超聲溶解，放冷，以蒸餾水定容至50ml，制成0.3mg/mL沒食子酸的溶液，作為對照品溶液。將0.3mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制成0.0mg/mL，0.03mg/mL，0.06mg/mL，0.09mg/mL，0.12mg/mL，0.15mg/mL、0.18mg/mL、0.21mg/mL的溶液，分別取1mL置于10mL的容量瓶中，加入2 ml福林試劑，充分搖勻，加入075ml 7.5碳酸鈉溶液混勻，以蒸餾水稀釋至刻度。振蕩一下，靜置2h(Guo&Wei,2011)。同時制作空白管。為消除供試品溶液本身顏色的干

8、擾，同時制作不加顯色劑的對照管。于765 nm波長處測定吸光度值。 2.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備以吸光度A 為縱坐標(biāo),濃度c為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用最小二乘法進行線性擬合,得c與A 的線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)R2。序號濃度（ug/ml）吸光度（WL765.0）000130.132260.284390.4114120.5825150.7126180.8437211.013 表3-1：沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測定數(shù)據(jù)圖3-1：沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 2.3.4樣品的測定 取提液2ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度線則稀釋5倍。取稀釋后溶液1ml四份,分別置于10mL比色管中，加入2 ml福林試劑，充

9、分搖勻，加入075ml 7.5碳酸鈉溶液混勻，以蒸餾水稀釋至刻度。振蕩一下，靜置2h。同時制作空白管。為消除供試品溶液本身顏色的干擾，同時制作不加顯色劑的對照管。于765 nm波長處測定吸光度值?？偡铀岷坑嬎悖憾喾雍浚╩g/100g）= 3.清除 DPPH·的能力的測定3.1.實驗儀器、藥品及試劑 2.1.1 實驗儀器ALZO4型電子分析天平:上海梅特勒一托利多儀器有限公司;DELA犯O型pH計:上海梅特勒一托利多儀器有限公司;723可見分光光度計:上海菩華科技儀器有限公司;DK一512型電熱恒溫水浴鍋:上海森信實驗儀器有限公司;容量瓶(250mL，10OmL，25mL)、比色管

10、(10mL);燒杯、移液管、吸耳球。 3.1.2試劑及藥品DPPH·（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯代苦味肼基自由基）；Vc（Ascrobic acid，維生素 C，抗壞血酸）為分析純；無水乙醇，蒸餾水 3.2.1配制DPPH溶液 配制0.06mMDPPH試劑，放入冰箱4進行冷藏，以備用。 3.2.2參照品Vc標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 準(zhǔn)確稱取17.6mgVc到100mL的燒杯中用無水乙醇溶解后，置于50mL的容量瓶中定容至刻度線及可以得到2mmol/L的母液，分別量1、2、3、4、5、6ml至10ml的比色管中用無水乙醇定容至刻度線，則可以得到0.2mmol

11、/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、1.2mmol/L的溶液。從以上比色管中分別取0.1ml溶液置于試管中再加入3.9ml的DPPH，反應(yīng)30min,在517nm測出吸光值(Thoo&Ho,2010)，用無水乙醇代替待測液作為對照，用無水乙醇作空白，重復(fù)三組。 清除率=(Ac-Ai)/Ac×100%式中，Ac：0.1 mL 無水乙醇加 3.9mL DPPH 溶液的吸光度；Ai：0.1 mL 待測液加 3.9mLDPPH 溶液的吸光度。 3.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制3.2.2測試數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制序號C（mmol/L）吸光度清除率/%

12、00010.20.52914.92 20.40.42430.90 30.60.3246.73 40.80.20963.62 510.1178.69 61.20.0292.39 表3-1：VC標(biāo)準(zhǔn)曲線測定數(shù)據(jù)以吸光度A 為縱坐標(biāo),濃度c為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用最小二乘法進行線性擬合,得c與A 的線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)R2。圖3-1：VC含量與吸光度的關(guān)系圖3-1：VC含量與清除率的關(guān)系 3.2.4樣品的測定 取提液4ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度線則稀釋2.5倍。取稀釋后溶液0.1mL三份,分別置于10mL 試管中，再分別加入配置好的DPPH溶液3.9mL,搖勻，反應(yīng)30m

13、in后，分別在517nm處測定其吸光度。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程可得濃度數(shù)據(jù)（以Vc為參比）,三次結(jié)果取平均值。經(jīng)換算后得樣品自由基清除率。4. 清除ABTS+自由基能力的測定4.1ABTS+自由基的配制準(zhǔn)確稱取0.19215gABTS于50mL的容量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻，濃度7mmol/L；7mmol/LABTS+.與2.45mmol/L的高硫酸鉀等體積混合，在室溫、避光黑暗的條件下靜置過夜反應(yīng)1216h，形成 ABTS+ 自由基儲備液。該儲備液在室溫，避光的條件下穩(wěn)定。用前用無水乙醇稀釋成工作液，于波長734nm處測得其吸光度為0.7000（±0.02），再裝入棕色試劑瓶中，放

14、入冰箱4進行冷藏，以備用。4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制4.2.1參照品Vc標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備及測試 準(zhǔn)確稱取8.8.mgVc到100mL的燒杯中用無水乙醇溶解后，置于50mL的容量瓶中用無水乙醇定容至刻度線及可以得到1mmol/L的母液，分別量1、2、3、4、5、6、7、8ml至10ml的比色管中用無水乙醇定容至刻度線，則可以得到0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L的溶液。從以上比色管中分別取0.1ml溶液置于試管中再加入3.9ml的DPPH，反應(yīng)30min,在517nm測出吸光值，用

15、無水乙醇代替待測液作為對照(Zhu&Lian,2011)，用無水乙醇作空白，重復(fù)三組。 清除率=(Ac-Ai)/Ac×100%式中，Ac：0.1 mL 無水乙醇加 3.9mL ABTS+ 自由基溶液的吸光度；Ai：0.1 mL 待測液加 3.9mLABTS+ 自由基溶液的吸光度。4.2.2測試數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制序號C（mmol/l）吸光度清除率/%100.00 20.10.5712.04 30.20.49323.92 40.30.42234.88 50.40.35145.83 60.50.27657.41 70.60.269.14 80.70.11881.79 90.80.

16、03594.60 表4-1：Vc濃度與吸光值和清除率的數(shù)據(jù)圖4-1Vc濃度與其吸光值的關(guān)系圖4-2：Vc濃度與其清除ABTS能力的關(guān)系5. 還原能力的測定5.1實驗試劑磷酸鹽緩沖溶液（配成PH6.6 0.2mol/l）;K3Fe(CN)6溶液（配成1%）;三氯乙酸（配成10%）；FeCl3（配成0.1%）；沒食子酸無水乙醇5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制5.2.1試劑的配制 磷酸鹽緩沖溶液(pH6.6 0.2mol/L)：準(zhǔn)確稱取7.16g的磷酸氫二鈉至100mL的燒杯中用蒸餾水溶解后，置于100mL的容量瓶中用蒸餾水定容，即可得到0.2mol/L的磷酸氫二鈉，同樣的方法配制0.2mol/L的磷酸二氫鈉。

17、準(zhǔn)確量取37.5mL的0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液和62.5mL的0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液至燒杯中，用pH校正既可以得到磷酸鹽緩沖溶液(pH6.6 0.2mol/L)。5.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及測試用沒食子酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線其濃度范圍在50300ug/ml，準(zhǔn)確稱取50mg沒食子酸到100mL燒杯中用無水乙醇溶解后，置于容量瓶中用無水乙醇定容至刻度線，得到0.5mg/ml的母液，在分別取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL至10mL的容量瓶中用無水乙醇定容至刻度先，得到50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/ml、250ug/ml、300ug/ml的溶液，取

18、不同濃度的待測液或樣品1ml于試管中，依次加入PH6.6磷酸鹽緩沖溶液（0.2mol/l）2.5ml和1% K3Fe(CN)6溶液2.5ml后混合均勻，混合液于50水浴20min,再加入10%的三氯乙酸2.5ml。于（3000r/min）離心10min,取2.5ml的上清液再依次加2.5ml蒸餾水和0.1%的FeCl3 0.5ml混合均勻，靜置10min在700nm處測定吸光值，通過在700nm下的吸收值來測量提取物的還原能力，吸光值越高表明還原力越強，EC50的計算是吸光值為0.5時的濃度（Roy&Laskar,2011）。5.2.3測試數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制Test setgalli

19、c acid concentration ug/mlAbsorbency1002500.5931001.141501.52752002.07362502.57973003.1表5-1：沒食子酸的質(zhì)量濃度和吸光值的數(shù)據(jù)圖5-1：沒食子酸的質(zhì)量濃度與其吸光值的關(guān)系6. 超氧自由自測定6.1實驗試劑1實驗試劑Tris-Hcl緩沖液（配制PH8.20 50mmol/L）鄰苯三酚(配制3mmol/L)VC無水乙醇6.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制6.2.1試劑的配制Tris-HCl（pH8.2 50mmol/L）緩沖溶液：取0.6057g三羥甲基氨基甲烷（Tris），蒸餾水溶解定容至50mL容量瓶；取0.309mL分

20、析純鹽酸溶液至100mL的容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，即得0.1mol/L鹽酸溶液；分別取配置好的Tris50mL和0.1mol/L鹽酸溶液22.9mL于100mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，用pH計進行校正即可以得到Tris-HCl（pH8.2 50mmol/L）緩沖溶液。鄰苯三酚：配制10mmol/L的稀鹽酸，取0.310mL分析純鹽酸溶液至1000mL的容量瓶中用蒸餾水定容至刻度線；取焦性沒食子酸0.0095g，至25mL的容量瓶中用10mmol/L的稀鹽酸溶液定容至刻度線。6.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置及測試精密稱取Vc標(biāo)準(zhǔn)樣品0.0300g置于100mL燒杯中,用純凈水溶解后定容至100mL 容量瓶中,即可得0.3mg/mL的Vc