大鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)模型的研究

1、大鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)模型的研究摘要摘要 目的目的: 為肝細(xì)胞功能及相關(guān)的研究提供一種客觀的、簡(jiǎn)便的大鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)模型, 并鑒定肝細(xì)胞的功能。方法方法: 在傳統(tǒng)的兩步灌流法的基礎(chǔ)上代肝細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果結(jié)果: 分離得到的肝細(xì)胞成活率可達(dá)90% 以上, 純度可達(dá)95%以上; 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明原代肝細(xì)胞大多處于G0、G1 期, 且基本無(wú)凋亡 。結(jié)論結(jié)論: 體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞活力和純度均較高, 體外培養(yǎng)后細(xì)胞功能正常, 是一種實(shí)用的體外研究肝細(xì)胞良好的細(xì)胞學(xué)模型。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞 ：大鼠; 肝細(xì)胞; 原代培養(yǎng); 細(xì)胞模型; 中圖分類號(hào): R965. 1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A文章編號(hào): 100

2、9-2501( 2005) 07-0743-01 材料與方法材料與方法 1. 1 主要材料 SPF( special pathogen free) 級(jí)雄性Sprague-Dawley 大鼠, 體重150 200 g。1. 2 大鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞純度及活率鑒定 以0. 6% 戊巴比妥鈉麻醉大鼠, 開(kāi)腹, 分離肝門(mén)靜脈, 經(jīng)門(mén)靜脈插管, 開(kāi)放下腔靜脈, 以流速5mlmin- 1灌流500 ml 37 的前灌流液( 142 mmolNaCl、6. 7mmol KCl、10 mmol HEPES、pH 7. 4) , 沖洗肝臟中的血液。將肝臟完整分離下來(lái), 轉(zhuǎn)入自制的循環(huán)灌流杯中, 以37 預(yù)熱

3、的0. 1% IV 膠原酶循環(huán)灌流10 min, 流速4 ml#min- 1。當(dāng)肝包膜下肝組織呈龜背狀裂隙、膠原酶灌流液充滿肝包膜下時(shí)停止。去除肝包膜, 分離肝細(xì)胞, 置于37 e度低速振蕩10 min 過(guò)150 目篩, 以清洗液清洗細(xì)胞, 50 g 離心5 min 3 次獲取肝細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù), 臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞活率。將細(xì)胞以105 個(gè)Pml 濃度接種于96孔板中, 37 、5 % CO2、100% 濕度條件下培養(yǎng)24 h,換液去掉未貼壁的細(xì)胞, 以后每24 h 換液1 次。取部分細(xì)胞離心收集, 20% 甲醛固定, 常規(guī)HE 染色后, 鏡下計(jì)數(shù)每視野的肝細(xì)胞來(lái)計(jì)算細(xì)胞純度。1. 3 流式細(xì)胞

4、術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期 將分離下來(lái)的肝細(xì)胞以800 rmin離心5 min, 收集細(xì)胞, PBS 洗2次。冰浴下加入- 20 度預(yù)冷的70% 的乙醇( PBS 稀釋) , 放置4 過(guò)夜。14 000 g , 短時(shí)離心, 棄上清, 去除乙醇, PBS 洗2 次。以500 Ll PBS 重懸細(xì)胞, 加RNase A 至終濃度為20 mgL, 于37 e孵育30 min。置于冰上, 加PI( Potassium iodide) 至終濃度為50 mgL,冰浴30 min, 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞熒光, CellQuest軟件包分析數(shù)據(jù), 計(jì)算原代大肝細(xì)胞細(xì)胞周期的比率。1. 4 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡 根據(jù)Ann

5、exin VPPI雙標(biāo)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作, 將分離下來(lái)的肝細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為 105 106 個(gè)Pml; 取1 ml 細(xì)胞液,4 度, 1 000 rmin 離心10 min, 棄上清; 加入1 ml 預(yù)冷的PBS, 輕輕震蕩, 重懸細(xì)胞; 4 度 , 1 000 rmin離心10 min, 棄上清; 重復(fù)步驟離心2 次; 將細(xì)胞重懸于200 Binding Buffer 中; 加入10 Ll Annexin VFITC和5 Ll PI, 輕混勻, 避光室溫反應(yīng)15 min; 加入300 Ll Binding Buffer, 在1 h 內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)“加減 ”標(biāo)準(zhǔn)

6、差( x s ) 表示, 應(yīng)用SPSS 11. 0軟件分析, 各組之間顯著性比較采用單因素方差分析( one-way ANOVA)。2 結(jié)果結(jié)果 2. 1 原代肝細(xì)胞培養(yǎng)存活率和純度 所分離的肝細(xì)胞以臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞成活率平均達(dá)90%以上; 將肝細(xì)胞1 000 rmin離心沉淀, 20% 甲醛固定, 常規(guī)HE 染色觀察。肝細(xì)胞純度鑒定的結(jié)果顯示, 本實(shí)驗(yàn)中分離的肝細(xì)胞純度可達(dá)95% 以上, 細(xì)胞核藍(lán)染, 細(xì)胞外形呈多角形, 胞體較大, 大部分是單核, 也有雙核的細(xì)胞, 適合用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。( 圖1) 圖1 大鼠肝細(xì)胞( HE染色) 2. 2 原代肝細(xì)胞細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡 PI 染色,

7、 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定結(jié)果表明, 處于G0、G1 期的肝細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的90. 62%, 說(shuō)明原代肝細(xì)胞大部分處于非增殖狀態(tài); 采用Annexin V 和PI 雙標(biāo)記、流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光強(qiáng)度的方法, 進(jìn)一步確定原代肝細(xì)胞凋亡率。一般情況下, 凋亡細(xì)胞應(yīng)出現(xiàn)在象限圖的右上( UR) 和右下( LR) 象限, 呈高密度團(tuán)塊狀, 如圖可見(jiàn)原代肝細(xì)胞基本無(wú)凋亡( 圖2) 。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明原代肝細(xì)胞的凋亡率為( 0. 120. 11)%,基本無(wú)細(xì)胞凋亡。參考文獻(xiàn) 1 白文啟. 大腸癌診治進(jìn)展中的哲學(xué)思考 J . 臨床醫(yī)藥實(shí)踐雜志, 2003; 12: 875- 7 2 Marc I, Brand, S

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