細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)入門(mén)

1、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)入門(mén)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)入門(mén) 在細(xì)胞培養(yǎng)中注意的一些問(wèn)題在細(xì)胞培養(yǎng)中注意的一些問(wèn)題 細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)程序細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)程序 細(xì)胞的復(fù)蘇細(xì)胞的復(fù)蘇 細(xì)胞的計(jì)數(shù)細(xì)胞的計(jì)數(shù) 細(xì)胞細(xì)胞( (貼壁貼壁) )的傳代培養(yǎng)的傳代培養(yǎng) 細(xì)胞的凍存細(xì)胞的凍存 懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)方法懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)方法 在細(xì)胞培養(yǎng)中注意的一些問(wèn)題在細(xì)胞培養(yǎng)中注意的一些問(wèn)題 環(huán)環(huán) 境境 由于體外培養(yǎng)細(xì)胞沒(méi)有抗感染能力，若由于體外培養(yǎng)細(xì)胞沒(méi)有抗感染能力，若實(shí)驗(yàn)者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范，也會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范，也會(huì)導(dǎo)致污染。因而，每一項(xiàng)工作都必須做到有條不紊污染。因而，每一項(xiàng)工作都必須做到有條不紊和完全可靠，特別是實(shí)驗(yàn)環(huán)境

2、更為重要。和完全可靠，特別是實(shí)驗(yàn)環(huán)境更為重要。 1.1.培養(yǎng)室和超凈臺(tái)的消毒培養(yǎng)室和超凈臺(tái)的消毒 培養(yǎng)室培養(yǎng)室 無(wú)菌培養(yǎng)室每天都要用速消凈或無(wú)菌培養(yǎng)室每天都要用速消凈或0.20.2的的新潔而滅（苯扎溴銨）拖洗地面一次（拖布要新潔而滅（苯扎溴銨）拖洗地面一次（拖布要專(zhuān)用），紫外線照射消毒專(zhuān)用），紫外線照射消毒303050min50min。 超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái) 臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用 75酒精酒精擦洗，然后紫外線消毒擦洗，然后紫外線消毒30 min。消毒時(shí)工作臺(tái)。消毒時(shí)工作臺(tái)面上用品不要過(guò)多或重疊放置，否則會(huì)遮擋射面上用品不要過(guò)多或重疊放置，否則會(huì)遮擋射線，降低消毒效果。一些操作用

3、具如移液器、線，降低消毒效果。一些操作用具如移液器、廢液缸。污物盒、試管架等用廢液缸。污物盒、試管架等用75酒精擦洗后酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線照射消毒。在工作臺(tái)面消置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線照射消毒。在工作臺(tái)面消毒時(shí)切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時(shí)照射紫外毒時(shí)切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時(shí)照射紫外線。線。2. 2. 培養(yǎng)前準(zhǔn)備培養(yǎng)前準(zhǔn)備 在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前要制定好詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前要制定好詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序，有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。和操作程序，有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點(diǎn)無(wú)誤后將其放置到培養(yǎng)室、超凈臺(tái)內(nèi)，清點(diǎn)無(wú)誤后將

4、其放置到培養(yǎng)室、超凈臺(tái)內(nèi)，然后開(kāi)始消毒。這樣可以避免開(kāi)始實(shí)驗(yàn)后，然后開(kāi)始消毒。這樣可以避免開(kāi)始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會(huì)。因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會(huì)。3. 3. 培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件 氣體環(huán)境：氣體環(huán)境：9595空氣加空氣加5 5COCO2 2混和氣體混和氣體環(huán)境中。環(huán)境中。 PHPH值：值：7.27.27.47.4 溫度：溫度：37 培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品的前期處理培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品的前期處理1.1.清洗和浸泡清洗和浸泡: :(1)玻璃器皿玻璃器皿: :新的玻璃器皿在生產(chǎn)過(guò)程中常新的玻璃器皿在生產(chǎn)過(guò)程中常使玻璃表面呈堿性，并帶有一些如鉛和砷等對(duì)使玻璃表面呈堿性，并帶有一些如鉛和砷等對(duì)細(xì)胞有毒

5、的物質(zhì)，使用前必須徹底清洗。首先細(xì)胞有毒的物質(zhì)，使用前必須徹底清洗。首先用自來(lái)水初步刷洗，用自來(lái)水初步刷洗，5 5稀鹽酸溶液中浸泡過(guò)夜。稀鹽酸溶液中浸泡過(guò)夜。然后用流水徹底沖洗然后用流水徹底沖洗3-53-5遍，單蒸餾水漂洗遍，單蒸餾水漂洗3 3遍，遍，三（雙）蒸水漂洗三（雙）蒸水漂洗2 2遍，烘干備用。遍，烘干備用。 （2)2)塑料器皿塑料器皿: :塑料器皿經(jīng)沖凈后，晾干，塑料器皿經(jīng)沖凈后，晾干，用用2 2NaOHNaOH浸泡過(guò)夜，自來(lái)水沖洗，浸泡過(guò)夜，自來(lái)水沖洗，5 5鹽酸浸鹽酸浸泡泡30min30min，流水徹底沖洗，流水徹底沖洗3-53-5遍，單蒸餾水漂洗遍，單蒸餾水漂洗3 3遍，三（雙

6、）蒸水漂洗遍，三（雙）蒸水漂洗2 2遍，烘干備用。針頭式遍，烘干備用。針頭式濾器不能泡酸液濾器不能泡酸液, ,用用2 2NaOHNaOH泡泡6 61212小時(shí)小時(shí), ,或者或者煮沸煮沸2020分鐘分鐘, ,常規(guī)沖洗干凈，烘干（常規(guī)沖洗干凈，烘干（6060以下）以下）備用。使用前要包裝，首先要裝好濾膜，安裝備用。使用前要包裝，首先要裝好濾膜，安裝時(shí)注意光面朝上時(shí)注意光面朝上( (凹向上凹向上) )，然后用注射器回抽，然后用注射器回抽注入檢查膜是否破損，安裝好膜后將螺旋稍微注入檢查膜是否破損，安裝好膜后將螺旋稍微 擰松一些，放入鋁盒內(nèi)（或用牛皮紙包裝）外擰松一些，放入鋁盒內(nèi)（或用牛皮紙包裝）外層用

7、紙包裝備用。注意在超凈臺(tái)內(nèi)取出使用時(shí)層用紙包裝備用。注意在超凈臺(tái)內(nèi)取出使用時(shí)應(yīng)該立即將螺旋旋緊；膠塞的處理：按常規(guī)沖應(yīng)該立即將螺旋旋緊；膠塞的處理：按常規(guī)沖洗干凈烘干后，用洗干凈烘干后，用2 2氫氧化鈉溶液煮沸氫氧化鈉溶液煮沸3030分鐘分鐘（用過(guò)的膠塞要置入單蒸水中浸泡，再用沸水（用過(guò)的膠塞要置入單蒸水中浸泡，再用沸水處理處理3030鐘），自來(lái)水洗凈，烘干然后再泡入鐘），自來(lái)水洗凈，烘干然后再泡入1 1稀鹽酸液中稀鹽酸液中3030分鐘，用自來(lái)水徹底沖洗分鐘，用自來(lái)水徹底沖洗3-53-5遍，遍，蒸餾水漂洗蒸餾水漂洗3 3遍，三（雙）蒸漂洗遍，三（雙）蒸漂洗2 2遍，烘干備遍，烘干備用。用。2.

8、2.包裝：包裝： 在消毒前必須進(jìn)行嚴(yán)格包裝，以便消毒及在消毒前必須進(jìn)行嚴(yán)格包裝，以便消毒及儲(chǔ)存，防止落入灰塵及消毒后再次被污染。包儲(chǔ)存，防止落入灰塵及消毒后再次被污染。包裝紙（盒）表面用油性記號(hào)筆標(biāo)明物品名稱、裝紙（盒）表面用油性記號(hào)筆標(biāo)明物品名稱、消毒日期等。消毒日期等。 3.3.消毒消毒: : 在組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，務(wù)必保證組織細(xì)在組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，務(wù)必保證組織細(xì)胞在無(wú)微生物的條件下生長(zhǎng)。防止培養(yǎng)物污染胞在無(wú)微生物的條件下生長(zhǎng)。防止培養(yǎng)物污染可通過(guò)消毒滅菌（將已存在的微生物去除）和可通過(guò)消毒滅菌（將已存在的微生物去除）和無(wú)菌操作技術(shù)（防止已經(jīng)消毒滅菌的用品被污無(wú)菌操作技術(shù)（防止已經(jīng)消毒滅

9、菌的用品被污染）來(lái)完成。染）來(lái)完成。（1 1）消毒滅菌的方法）消毒滅菌的方法 : 物理方法物理方法: : 濕熱（高壓蒸汽）、干熱、濕熱（高壓蒸汽）、干熱、紫外線照射線、過(guò)濾、離心沉淀等方法殺滅或紫外線照射線、過(guò)濾、離心沉淀等方法殺滅或去除微生物去除微生物. . 化學(xué)方法化學(xué)方法: :使用化學(xué)消毒劑、抗菌素等使用化學(xué)消毒劑、抗菌素等殺滅微生物。殺滅微生物。 (2)(2)消毒滅菌的時(shí)間：消毒滅菌的時(shí)間： 干熱消毒：一般在烤箱中進(jìn)行，需加溫到干熱消毒：一般在烤箱中進(jìn)行，需加溫到 160160，保持，保持9090120 min120 min方能殺死芽孢。消毒方能殺死芽孢。消毒完畢后不可馬上將烤箱門(mén)打開(kāi)

10、，以免冷空氣突完畢后不可馬上將烤箱門(mén)打開(kāi)，以免冷空氣突然進(jìn)入，影響消毒效果和損壞玻璃器皿或發(fā)生然進(jìn)入，影響消毒效果和損壞玻璃器皿或發(fā)生意外事故。意外事故。 濕熱消毒：一般使用高壓蒸汽滅菌器進(jìn)行濕熱消毒：一般使用高壓蒸汽滅菌器進(jìn)行消毒，要求是：消毒，要求是： 不能裝太滿，保持消毒器內(nèi)氣體流通。不能裝太滿，保持消毒器內(nèi)氣體流通。 在加熱升壓之前，打開(kāi)排氣閥門(mén)，使加在加熱升壓之前，打開(kāi)排氣閥門(mén)，使加熱后消毒器內(nèi)的殘留冷空氣排出。熱后消毒器內(nèi)的殘留冷空氣排出。 關(guān)閉排氣關(guān)閉排氣閥門(mén)，開(kāi)始升壓，待達(dá)到所需要的壓力時(shí)，開(kāi)閥門(mén)，開(kāi)始升壓，待達(dá)到所需要的壓力時(shí)，開(kāi)始記錄時(shí)間，并控制壓力恒定。始記錄時(shí)間，并控制

11、壓力恒定。 一般物品：布類(lèi)、金屬器械、玻璃器一般物品：布類(lèi)、金屬器械、玻璃器皿等消毒的要求是皿等消毒的要求是 1515磅磅20 min20 min；常規(guī)使用；常規(guī)使用液體：消毒液體：消毒 1515磅磅 15 min 15 min 。橡膠和塑料用。橡膠和塑料用品品 ：如濾器、：如濾器、EPEP管、離心管等高壓管、離心管等高壓1010磅磅15 15 minmin。 紫外線消毒：紫外線消毒：主要用于實(shí)驗(yàn)室房間里的空主要用于實(shí)驗(yàn)室房間里的空氣、操作氣、操作 臺(tái)表面及桌椅等消毒。時(shí)間為臺(tái)表面及桌椅等消毒。時(shí)間為30min30min2h2h左右。左右。 過(guò)濾除菌消毒：過(guò)濾除菌消毒：適用于組織細(xì)胞培養(yǎng)使用適

12、用于組織細(xì)胞培養(yǎng)使用的液體的液體 如血清、合成培養(yǎng)液、酶及含有蛋白如血清、合成培養(yǎng)液、酶及含有蛋白質(zhì)具有生物活性的液體等。質(zhì)具有生物活性的液體等。 4.4.細(xì)胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基（液）細(xì)胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基（液）: : （1 1）水：）水：雙蒸水、三蒸水，可高壓除菌。雙蒸水、三蒸水，可高壓除菌。 （2 2）平衡鹽溶液（）平衡鹽溶液（PBS)PBS)：PHPH為為7.27.27.47.4，不，不含鈣鎂離子含鈣鎂離子 ，可高壓除菌。，可高壓除菌。（3 3）消化液）消化液 ： 胰蛋白酶液：胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的濃度為常用胰蛋白酶的濃度為0 025 25 ，pHpH值值7.27.2左右。需過(guò)濾除菌。左

13、右。需過(guò)濾除菌。 EDTAEDTA液：液：常用濃度為常用濃度為 0 00202，配制時(shí)，配制時(shí)采用無(wú)采用無(wú)CaCa2+2+、MgMg2+2+平衡鹽液溶解，高壓滅菌平衡鹽液溶解，高壓滅菌后即可使用。后即可使用。 胰蛋白酶胰蛋白酶EDTAEDTANa2:Na2:需過(guò)濾除菌。胰需過(guò)濾除菌。胰蛋白酶和蛋白酶和EDTANaEDTANa2 2聯(lián)合使用可提高消化率，聯(lián)合使用可提高消化率，但需注意但需注意EDTAEDTA不能被血清中和，消化后要不能被血清中和，消化后要徹底清洗，否則細(xì)胞易脫壁。徹底清洗，否則細(xì)胞易脫壁。 膠原酶：膠原酶：適于消化分離纖維性組織、適于消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，可使上皮細(xì)胞

14、與膠原成上皮及癌組織，可使上皮細(xì)胞與膠原成分分離而不受損害?？捎梅址蛛x而不受損害?？捎肂SSBSS或含血清或含血清的培養(yǎng)液配制，這樣實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便同時(shí)的培養(yǎng)液配制，這樣實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便同時(shí)提高細(xì)胞成活率。提高細(xì)胞成活率。 但膠原酶價(jià)格較高，大量使用將增加實(shí)驗(yàn)但膠原酶價(jià)格較高，大量使用將增加實(shí)驗(yàn)成本。膠原酶的常用劑量為成本。膠原酶的常用劑量為 200 U200 Umlml（約為（約為 lmglmgmlml）或）或 0 003030 03 3。(4)(4)培養(yǎng)基（液）過(guò)濾除菌培養(yǎng)基（液）過(guò)濾除菌 常用常用0 022pm22pm微孔濾膜。微孔濾膜。（4 4）l640l640培養(yǎng)液培養(yǎng)液( (常用常用) )

15、（5 5）DMEMDMEM、F12F12培養(yǎng)液培養(yǎng)液 （6 6）HamHam培養(yǎng)液培養(yǎng)液 ( (無(wú)血清培養(yǎng)中常用的無(wú)血清培養(yǎng)中常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基) )（7 7）HepesHepes：具有較強(qiáng)的緩沖能力，能具有較強(qiáng)的緩沖能力，能常時(shí)間恒定緩沖液的常時(shí)間恒定緩沖液的PHPH值。使用濃度可根值。使用濃度可根據(jù)緩沖要求而定。據(jù)緩沖要求而定。（8 8）3% L-3% L-谷氨酰胺：谷氨酰胺：可作為細(xì)胞能量來(lái)源，可作為細(xì)胞能量來(lái)源，使用量使用量1 1。但其在溶液中極不穩(wěn)定，需重新加。但其在溶液中極不穩(wěn)定，需重新加入。入。（9 9）丙酮酸鈉、葡萄糖：）丙酮酸鈉、葡萄糖：是屬碳水化合物的是屬碳水化合物

16、的成分，是細(xì)胞生命的能量來(lái)源。成分，是細(xì)胞生命的能量來(lái)源。（1010）抗生素：）抗生素：最終濃度為青霉素最終濃度為青霉素 100 U100 Umlml，鏈霉素鏈霉素100U100Umlml（青霉素為（青霉素為8080萬(wàn)萬(wàn)U U瓶，將其溶瓶，將其溶解于解于4ml4ml三蒸水中，每升培養(yǎng)液中加入三蒸水中，每升培養(yǎng)液中加入0.5ml0.5ml；鏈霉素為鏈霉素為100100萬(wàn)萬(wàn)U U瓶，將其溶解在瓶，將其溶解在5ml5ml三蒸水中，三蒸水中，每升培養(yǎng)液加每升培養(yǎng)液加0.5ml0.5ml）。）。 （1111）細(xì)胞生長(zhǎng)液：）細(xì)胞生長(zhǎng)液：是用以維持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖是用以維持細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的液體。其是配方：的液體。

17、其是配方：基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80809090 血清血清 10102020 雙抗雙抗 100u/ml 100u/ml （1212）細(xì)胞維持液：）細(xì)胞維持液：用以維持細(xì)胞緩慢生長(zhǎng)或用以維持細(xì)胞緩慢生長(zhǎng)或不死的培養(yǎng)液。其是配方：不死的培養(yǎng)液。其是配方：基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基 9595 血清血清 2 25 5 雙抗雙抗100u/ml 100u/ml （1313）凍存液：）凍存液：其是配方：其是配方： 1010DMSO DMSO 40 40小牛血清（小牛血清（3030FBSFBS） 1 1的的5.65.6NaHCONaHCO3 3 1 1雙抗雙抗 4848（5858）基礎(chǔ)培養(yǎng)液。）基礎(chǔ)培養(yǎng)液。（141

18、4）MEMMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)液: :其是配方：其是配方： 63%MEM63%MEM液液 2020的乳蛋白水解物的乳蛋白水解物 1010的小牛血清的小牛血清 1 1的雙抗（的雙抗（P P、S S） 用用5.65.6NaHCONaHCO3 3溶液調(diào)溶液調(diào)pHpH至至7.27.27.47.4。細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)程序細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)程序細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 動(dòng)物組織原代培養(yǎng)動(dòng)物組織原代培養(yǎng) 細(xì)胞株的體外培養(yǎng)細(xì)胞株的體外培養(yǎng)血管、骨髓、羊水、胸水、腹水內(nèi)血管、骨髓、羊水、胸水、腹水內(nèi) 細(xì)胞株貯存在液氮灌或細(xì)胞株貯存在液氮灌或8080細(xì)胞及皮膚、粘膜、神經(jīng)、胚胎、細(xì)胞及皮膚、粘膜、神經(jīng)、胚胎、 以下的低溫冰箱中以下的

19、低溫冰箱中 腫瘤等組織腫瘤等組織 分離分離 復(fù)蘇復(fù)蘇組織切成組織切成1cm1cm3 3小塊，方法根據(jù)樣本而異。小塊，方法根據(jù)樣本而異。 細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，立即放入細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，立即放入有機(jī)械分散法、剪切分離法、消化分離法有機(jī)械分散法、剪切分離法、消化分離法 37 37 水浴箱中充分溶解，立即水浴箱中充分溶解，立即（胰酶消化分離法、膠原酶法（胰酶消化分離法、膠原酶法 ） 離心離心500500 1000r/min1000r/min1 1 2min2min，棄掉上清液。棄掉上清液。獲得細(xì)胞懸液種入獲得細(xì)胞懸液種入 接種入瓶中培養(yǎng)接種入瓶中培養(yǎng)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng) 3737培養(yǎng)箱（或培養(yǎng)箱

20、（或5%CO5%CO2 2培養(yǎng)箱）中培養(yǎng)培養(yǎng)箱）中培養(yǎng)2424小時(shí)后換液小時(shí)后換液去處對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有毒物質(zhì)，如去處對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有毒物質(zhì)，如DMSODMSO、細(xì)胞組織殘?jiān)?、?xì)胞代謝產(chǎn)物、細(xì)胞組織殘?jiān)?、?xì)胞代謝產(chǎn)物 貼壁細(xì)胞貼壁細(xì)胞 懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞直接去掉上清液直接去掉上清液 離心去掉上清液，必要時(shí)做細(xì)胞飼離心去掉上清液，必要時(shí)做細(xì)胞飼養(yǎng)層以凈化細(xì)胞養(yǎng)層以凈化細(xì)胞 傳代傳代 細(xì)胞生長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)8080以上覆蓋培養(yǎng)瓶底，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)周期不同而異，以上覆蓋培養(yǎng)瓶底，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)周期不同而異， 2 23 3天或天或1 1周左右一代周左右一代 貼壁細(xì)胞貼壁細(xì)胞 懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞. .消化法，用胰酶消化法，用胰

21、酶EDTANa2EDTANa2消化，消化， 直接吹打或離心法、自然沉淀法，直接吹打或離心法、自然沉淀法， 時(shí)間根據(jù)細(xì)胞而定時(shí)間根據(jù)細(xì)胞而定 吸一半液到另一瓶吸一半液到另一瓶?jī)龃鎯龃鎯龃娉绦騼龃娉绦?細(xì)胞凍存管寫(xiě)好標(biāo)簽：細(xì)胞名稱，時(shí)間及保存人。細(xì)胞凍存管寫(xiě)好標(biāo)簽：細(xì)胞名稱，時(shí)間及保存人。 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（2 25 5 1O1O5 5cellscellsmlml），收集細(xì)胞前），收集細(xì)胞前24h24h換液；換液； 吸出培養(yǎng)液，用吸出培養(yǎng)液，用PBSPBS洗細(xì)胞一次，除去，加入消化液胰蛋白酶洗細(xì)胞一次，除去，加入消化液胰蛋白酶EDTANaEDTANa2 2（消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞而

22、定），去掉消化液，加入培養(yǎng)液充（消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞而定），去掉消化液，加入培養(yǎng)液充分混勻，分混勻，1000rp1000rp離心離心1min ,1min ,去掉上清液；去掉上清液； 重懸浮于凍存液中，大約重懸浮于凍存液中，大約1 15 5 10106 6cellscellsmlml； 每個(gè)凍存管中加入每個(gè)凍存管中加入lmllml細(xì)胞懸浮液，擰緊蓋子。細(xì)胞懸浮液，擰緊蓋子。 冷凍細(xì)胞應(yīng)緩慢降溫，可用裝有異丙醇的冷凍盒冷凍細(xì)胞應(yīng)緩慢降溫，可用裝有異丙醇的冷凍盒30min 30min 1h1h后后, ,再放入再放入-20-200 0C C冰箱中冰箱中2h2h左右，然后轉(zhuǎn)至左右，然后轉(zhuǎn)至-80-800 0

23、C C冰箱，可保存數(shù)月，如冰箱，可保存數(shù)月，如需長(zhǎng)期保存，應(yīng)在需長(zhǎng)期保存，應(yīng)在-80-800 0C C冰箱中放冰箱中放3h 3h 8h8h后轉(zhuǎn)至液氮中。后轉(zhuǎn)至液氮中。 細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù) 一、原理一、原理 細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果以細(xì)胞數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果以細(xì)胞數(shù)/ /毫升表示。在細(xì)毫升表示。在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過(guò)程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的分離的過(guò)程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞

24、也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。 用臺(tái)盼（酚）蘭染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，用臺(tái)盼（酚）蘭染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯胞。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，也可測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力。色反應(yīng)，也可測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力。二、儀器、用品與試劑二、儀器、用品與試劑1 1、儀器與用品：、儀器與用品：普通顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、普通顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、EPEP管、毛細(xì)吸管等。管、毛細(xì)吸管等。2 2、試劑、試劑： SP20SP20細(xì)胞、細(xì)胞、 0.40.4

25、臺(tái)盼（酚）蘭其臺(tái)盼（酚）蘭其配方是：臺(tái)盼（酚）蘭配方是：臺(tái)盼（酚）蘭 0.4g0.4g加雙蒸水加雙蒸水100ml100ml等。等。 3 3、材料：、材料：細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液的制備：細(xì)胞懸液的制備： 用毛吸管吸用毛吸管吸5 5滴細(xì)胞懸液到滴細(xì)胞懸液到EPEP管中，加入管中，加入1 1滴滴0.40.4臺(tái)盼藍(lán)染液或苯胺黑，混勻，靜置臺(tái)盼藍(lán)染液或苯胺黑，混勻，靜置2 23min,3min,活細(xì)胞不會(huì)被染色，而死細(xì)胞著藍(lán)色，這樣加入活細(xì)胞不會(huì)被染色，而死細(xì)胞著藍(lán)色，這樣加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。三、操作步驟三、操作步驟 1 1、將血球計(jì)

26、數(shù)板及蓋片用軟紗布擦試干凈，、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用軟紗布擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。 2 2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。 3 3、靜置、靜置3 3分鐘。分鐘。 4 4、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四個(gè)大、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：方的。然后按下式計(jì)算：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml/ml （ 四個(gè)大格子四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)/4)/4)稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)10104 4 /ml

27、 /ml 四、細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：四、細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)： 1.1.要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于10104 4個(gè)個(gè)/ml/ml，如，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；液中； 2.2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。 3.3.取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更意每次取樣都要混勻，以時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確； 4.4.操作時(shí)，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓操作時(shí)，注意蓋片下不能

28、有氣泡，也不能讓?xiě)乙毫魅肱赃叢壑校駝t要重新計(jì)數(shù)。懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。 5.5.數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格集成團(tuán)時(shí)只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)左線，不線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)左線，不計(jì)右線。計(jì)右線。 體外細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)體外細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)概述概述 復(fù)蘇細(xì)胞與凍存的要求相反，應(yīng)采用快復(fù)蘇細(xì)胞與凍存的要求相反，應(yīng)采用快速融化的手段。這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在速融化的手段。這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化。避免由于緩慢融化使很短的時(shí)間內(nèi)

29、即融化。避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損害。損害。用品和試劑用品和試劑 培 養(yǎng) 液 、 吸 管 、 離 心 管 、 培 養(yǎng) 瓶 、培 養(yǎng) 液 、 吸 管 、 離 心 管 、 培 養(yǎng) 瓶 、CHO/HelaCHO/Hela細(xì)胞等。細(xì)胞等。操作步驟（圖）操作步驟（圖） 注注 意意 存取凍存管時(shí)都要佩戴防護(hù)眼鏡和手套，存取凍存管時(shí)都要佩戴防護(hù)眼鏡和手套，凍存管投入存放溫水的器皿中后應(yīng)立即把蓋子凍存管投入存放溫水的器皿中后應(yīng)立即把蓋子扣上，以防發(fā)生意外?？凵希苑腊l(fā)生意外。 離心后上清夜一定要吸干凈，以免因離心后上清夜一定要吸干凈，以免因

30、DSMODSMO的毒性造成細(xì)胞活力下降而難以復(fù)活。的毒性造成細(xì)胞活力下降而難以復(fù)活。 細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞傳代培養(yǎng)一、原理一、原理 在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，已基本上飽和在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，已基本上飽和（細(xì)胞增值達(dá)到一定密度后），為使細(xì)胞能繼（細(xì)胞增值達(dá)到一定密度后），為使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保傳代（再養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過(guò)程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過(guò)程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可

31、以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。二、材料和試劑二、材料和試劑 細(xì)胞：貼壁細(xì)胞株細(xì)胞：貼壁細(xì)胞株CHOCHO 試劑：試劑：0.250.25胰酶、胰酶、16401640培養(yǎng)基（含培養(yǎng)基（含1010小牛血清）。小牛血清）。 儀器和器材：倒置顯微鏡，培養(yǎng)箱、培養(yǎng)儀器和器材：倒置顯微鏡，培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等。瓶、吸管、廢液缸等。 三、操作步驟三、操作步驟 將長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中原來(lái)的培養(yǎng)液棄去。將長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中原來(lái)的培養(yǎng)液棄去。 加入加入0.50.51ml 0.251ml 0.25胰酶溶液，使瓶底細(xì)胰酶溶液，使瓶底細(xì)胞都浸入溶液中。胞都浸入溶液中。 瓶口塞

32、好橡皮塞，放在倒置鏡下觀察細(xì)胞。瓶口塞好橡皮塞，放在倒置鏡下觀察細(xì)胞。隨著時(shí)間的推移，原貼壁的細(xì)胞逐漸趨于圓形，隨著時(shí)間的推移，原貼壁的細(xì)胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時(shí)將胰酶棄去，加入在還未漂起時(shí)將胰酶棄去，加入10ml10ml培養(yǎng)液終培養(yǎng)液終止消化。觀察消化也可以用肉眼，當(dāng)見(jiàn)到瓶底止消化。觀察消化也可以用肉眼，當(dāng)見(jiàn)到瓶底發(fā)白并出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)終止消化。一般室發(fā)白并出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)終止消化。一般室溫消化時(shí)間約為溫消化時(shí)間約為1 13 3分鐘。分鐘。 用吸管將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液，分到另用吸管將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液，分到另外兩到三瓶中，塞好橡皮塞（或瓶蓋），置外兩到三瓶中，塞好橡皮塞（或瓶蓋），置

33、3737下繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長(zhǎng)情況。下繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長(zhǎng)情況。四、注意事項(xiàng)四、注意事項(xiàng) 形成的單層細(xì)胞相互匯合，整個(gè)瓶底逐漸形成的單層細(xì)胞相互匯合，整個(gè)瓶底逐漸被覆蓋時(shí)要立即進(jìn)行分離培養(yǎng)，否則細(xì)胞會(huì)因生被覆蓋時(shí)要立即進(jìn)行分離培養(yǎng)，否則細(xì)胞會(huì)因生存空間不足或密度過(guò)大，營(yíng)養(yǎng)障礙，影響細(xì)胞生存空間不足或密度過(guò)大，營(yíng)養(yǎng)障礙，影響細(xì)胞生長(zhǎng)。長(zhǎng)。 傳代時(shí)不同的細(xì)胞消化時(shí)間不同，因而要傳代時(shí)不同的細(xì)胞消化時(shí)間不同，因而要根據(jù)需要注意觀察及時(shí)進(jìn)行處理。以免因消化過(guò)根據(jù)需要注意觀察及時(shí)進(jìn)行處理。以免因消化過(guò)頭而產(chǎn)生過(guò)多的細(xì)胞碎片，影響細(xì)胞生長(zhǎng)。頭而產(chǎn)生過(guò)多的細(xì)胞碎片，影響細(xì)胞生長(zhǎng)。 吹打細(xì)胞時(shí)

34、動(dòng)作要輕巧盡可能減少對(duì)細(xì)胞的吹打細(xì)胞時(shí)動(dòng)作要輕巧盡可能減少對(duì)細(xì)胞的損傷。損傷。 防止由于培養(yǎng)細(xì)胞污染等因素造成細(xì)胞系的防止由于培養(yǎng)細(xì)胞污染等因素造成細(xì)胞系的絕種，要及時(shí)凍存細(xì)胞。絕種，要及時(shí)凍存細(xì)胞。 細(xì)胞檔案要記錄好，如組織來(lái)源，生物學(xué)特細(xì)胞檔案要記錄好，如組織來(lái)源，生物學(xué)特性，培養(yǎng)液要求、傳代、換液時(shí)間和規(guī)律，細(xì)胞性，培養(yǎng)液要求、傳代、換液時(shí)間和規(guī)律，細(xì)胞的遺傳學(xué)標(biāo)志，生長(zhǎng)形態(tài)，常規(guī)病理染色的標(biāo)本的遺傳學(xué)標(biāo)志，生長(zhǎng)形態(tài)，常規(guī)病理染色的標(biāo)本等。等。附附1 116401640基礎(chǔ)培養(yǎng)基配置方法基礎(chǔ)培養(yǎng)基配置方法: :16401640粉粉 10.4g 10.4g Hepes 2.38g Hepe

35、s 2.38g 葡萄糖葡萄糖 2.5g 2.5g 丙酮酸鈉丙酮酸鈉 110mg NaHCO110mg NaHCO3 3 2g 2g 雙（三）蒸水加至雙（三）蒸水加至1000ml1000ml附附2 2：消化液配制方法：消化液配制方法：稱取稱取0.25g0.25g胰酶蛋白酶（活力為胰酶蛋白酶（活力為1 1：250250），加），加100ml100ml無(wú)無(wú)CaCa2+2+、MgMg2+2+的的HanksHanks液液( (或或PBSPBS液液) )溶解，溶解，濾器過(guò)濾除用前可在濾器過(guò)濾除用前可在3737下回溫。胰酶溶液中下回溫。胰酶溶液中也可加入也可加入EDTAEDTANaNa2 2，使最終濃度達(dá)，

36、使最終濃度達(dá)0.020.02。 細(xì)胞的凍存細(xì)胞的凍存 一、概述一、概述 凍存細(xì)胞時(shí)要緩慢冷凍。因?yàn)榧?xì)胞在直凍存細(xì)胞時(shí)要緩慢冷凍。因?yàn)榧?xì)胞在直接冷凍時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)很快形成冰接冷凍時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)很快形成冰晶，冰晶的形成將引起一系列的不良反應(yīng)。晶，冰晶的形成將引起一系列的不良反應(yīng)。首先細(xì)胞脫水首先細(xì)胞脫水, ,部分蛋白質(zhì)由于上述因素而變部分蛋白質(zhì)由于上述因素而變性，引起細(xì)胞內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞內(nèi)冰性，引起細(xì)胞內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成和細(xì)胞膜系統(tǒng)上蛋白質(zhì)、酶的變性，晶的形成和細(xì)胞膜系統(tǒng)上蛋白質(zhì)、酶的變性，引起細(xì)胞能量代謝的障礙。引起細(xì)胞能量代謝的障礙。細(xì)胞膜上的類(lèi)脂蛋白復(fù)合

37、體在冷凍中易發(fā)生破壞細(xì)胞膜上的類(lèi)脂蛋白復(fù)合體在冷凍中易發(fā)生破壞引起胞膜通透性的改變、使細(xì)胞內(nèi)容物喪失。細(xì)引起胞膜通透性的改變、使細(xì)胞內(nèi)容物喪失。細(xì)胞核內(nèi)胞核內(nèi)DNADNA也是冷凍時(shí)細(xì)胞易受損傷部分。如細(xì)也是冷凍時(shí)細(xì)胞易受損傷部分。如細(xì)胞內(nèi)冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體胞內(nèi)冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成積膨脹造成DNADNA的空間構(gòu)型發(fā)生不可逆的損傷性的空間構(gòu)型發(fā)生不可逆的損傷性變化，而引起細(xì)胞的死亡。因此在細(xì)胞凍存時(shí)要變化，而引起細(xì)胞的死亡。因此在細(xì)胞凍存時(shí)要盡可能的均勻地減少細(xì)胞內(nèi)水分，減少細(xì)胞內(nèi)冰盡可能的均勻地減少細(xì)胞內(nèi)水分，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成是減少細(xì)胞損傷的關(guān)

38、鍵。晶的形成是減少細(xì)胞損傷的關(guān)鍵。 目前多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑。這目前多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑。這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可以使冰點(diǎn)下降，提高胞膜對(duì)水的通透性；加可以使冰點(diǎn)下降，提高胞膜對(duì)水的通透性；加上緩慢冷凍方法可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，上緩慢冷凍方法可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從在胞外形成冰晶，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成所造成的細(xì)胞損傷。這樣而減少由于冰晶形成所造成的細(xì)胞損傷。這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。可以最大限度的保存細(xì)胞活力。二、用品和試劑二、用品和試劑

39、 0.25 0.25胰蛋白酶。胰蛋白酶。 含含10102020( (胎牛胎牛) )血清培養(yǎng)液。血清培養(yǎng)液。 吸管、離心管、吸管、離心管、2ml2ml凍存管（如質(zhì)量不好，凍存管（如質(zhì)量不好，有時(shí)密封不嚴(yán)，使用時(shí)炸裂；因而使用前要有時(shí)密封不嚴(yán)，使用時(shí)炸裂；因而使用前要仔細(xì)檢查）。仔細(xì)檢查）。 酒精燈（或其他安瓶封口設(shè)備）酒精燈（或其他安瓶封口設(shè)備） 、封口膠、封口膠等。等。 凍存液凍存液: : DMSODMSO液液 ： 1010DMSO 1DMSO 1雙抗（過(guò)濾）雙抗（過(guò)濾） 4040小牛血清（小牛血清（3030FBSFBS） 4848（5858）基礎(chǔ)培養(yǎng)液）基礎(chǔ)培養(yǎng)液( (無(wú)菌無(wú)菌) ) 1 1

40、的的5.65.6NaHCONaHCO3 3 ( (無(wú)菌無(wú)菌) ) 無(wú)色新鮮甘油（無(wú)色新鮮甘油（1 1磅蒸汽高壓消毒）磅蒸汽高壓消毒）三、操作步驟三、操作步驟 （圖）（1 1）取生長(zhǎng)狀態(tài)好的細(xì)胞即選擇對(duì)數(shù)）取生長(zhǎng)狀態(tài)好的細(xì)胞即選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，已經(jīng)長(zhǎng)滿的細(xì)胞凍存。生長(zhǎng)期細(xì)胞，已經(jīng)長(zhǎng)滿的細(xì)胞凍存。（2 2）離心洗滌）離心洗滌 用胰蛋白酶把單層生長(zhǎng)的細(xì)用胰蛋白酶把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái)，懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則不需處理。胞消化下來(lái)，懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則不需處理。依據(jù)傳代方法把消化好的細(xì)胞收集于離心管依據(jù)傳代方法把消化好的細(xì)胞收集于離心管加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液并計(jì)數(shù)，離心加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液并計(jì)數(shù)，離心 1000 rpm1000 rpmminmin2 min2 min。去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液。去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液。（3 3）加含）加含1010DMSODMSO凍存液凍存液 加入配制好加入配制好的凍存培養(yǎng)液（含的凍存培養(yǎng)液（含1010DMSODMSO或甘油），或甘