第三章細胞生物學(xué)研究方法

1、 顯微鏡之于生物學(xué)，猶如望遠鏡之于天文學(xué)，細顯微鏡之于生物學(xué)，猶如望遠鏡之于天文學(xué)，細胞生物學(xué)的變革無不和顯微技術(shù)的改進息息相關(guān)。胞生物學(xué)的變革無不和顯微技術(shù)的改進息息相關(guān)。 1590年年J. 和和Z. Janssen父子制作第一臺復(fù)式顯微父子制作第一臺復(fù)式顯微鏡，放大倍數(shù)不超過鏡，放大倍數(shù)不超過10倍。倍。 1932年德國學(xué)者年德國學(xué)者Max Knolls 和和Ernst Ruska發(fā)發(fā)明了第一臺電子顯微鏡明了第一臺電子顯微鏡1、普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)、普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)2、相差顯微鏡技術(shù)、相差顯微鏡技術(shù)3、熒光顯微鏡技術(shù)、熒光顯微鏡技術(shù)4、激光共焦點掃描顯微鏡技術(shù)、激光共焦點掃描顯微鏡

2、技術(shù)人眼人眼100um1cm1mm100um10um1um100nm10nm1nm0.1nm光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡電子顯微鏡電子顯微鏡掃描掃描 隧道顯微鏡隧道顯微鏡細菌細菌病毒病毒核糖體核糖體球蛋白球蛋白原子原子植物、植物、動物細胞動物細胞可見范圍可見范圍1）光學(xué)顯微鏡的組成）光學(xué)顯微鏡的組成光學(xué)放大系統(tǒng)光學(xué)放大系統(tǒng)照明系統(tǒng)照明系統(tǒng)機械和支持系統(tǒng)機械和支持系統(tǒng)目鏡目鏡物鏡物鏡光源光源折光鏡折光鏡聚光鏡聚光鏡（濾光片）（濾光片）指區(qū)分開兩個質(zhì)點間的最小距離。指區(qū)分開兩個質(zhì)點間的最小距離。D =0.61 N.Sin /2 ：光源波長：光源波長 ：物鏡鏡口角物鏡鏡口角（最大值可達（最大值可達140度）

3、度）N：介質(zhì)折射率介質(zhì)折射率 （空氣中為（空氣中為1） N.Sin /2 也稱也稱數(shù)值孔徑數(shù)值孔徑(鏡口率鏡口率)分辨率與光源的分辨率與光源的波長、波長、物鏡鏡口角物鏡鏡口角和和介質(zhì)折介質(zhì)折射率射率有關(guān)。有關(guān)。成像原理成像原理 樣品被放置在光的通路中，樣樣品被放置在光的通路中，樣品會對品會對光波光波產(chǎn)生干擾，這種干擾現(xiàn)產(chǎn)生干擾，這種干擾現(xiàn)象通過透鏡被肉眼觀察到象通過透鏡被肉眼觀察到。為什么為什么 照明系統(tǒng)的照明系統(tǒng)的波長波長是顯是顯微成像的一個重要因素，微成像的一個重要因素，波長決定能被檢測樣品波長決定能被檢測樣品的最小極限。的最小極限。 最大分辨率最大分辨率以可見光作光源，其最大的分辨率為：

4、以可見光作光源，其最大的分辨率為： 最好的玻璃透鏡的最好的玻璃透鏡的鏡口角鏡口角是是140140， sin sin /2的最大值為的最大值為0.940.94, ,空氣的折射率為空氣的折射率為1 1, , 最短的最短的可見光（藍色光）的波長為可見光（藍色光）的波長為450450nmnmD D292nm292nm用用油油作為光折射的介質(zhì)作為光折射的介質(zhì):D=0.2m (光學(xué)顯微鏡最大分辨率光學(xué)顯微鏡最大分辨率)用紫外光作光源可使用紫外光作光源可使D提高到約提高到約0.1m 。分辨極限與有效放大率分辨極限與有效放大率對可見光來說，能清楚地分辨出相鄰兩點之對可見光來說，能清楚地分辨出相鄰兩點之間的最小

5、間隔是間的最小間隔是0.2m，這是，這是分辨極限。分辨極限。有效放大率有效放大率：光學(xué)顯微鏡的分辨率約為：光學(xué)顯微鏡的分辨率約為0.2m，人眼的分辨率為，人眼的分辨率為0.2mm，因此顯，因此顯微鏡的最大有效倍數(shù)為微鏡的最大有效倍數(shù)為1000X。固定固定：殺死細胞，穩(wěn)定細胞的化學(xué)成分：殺死細胞，穩(wěn)定細胞的化學(xué)成分 固定劑：甲醛、戊二醛固定劑：甲醛、戊二醛包埋包埋：為了便于切片，防止樣品移位。：為了便于切片，防止樣品移位。 石蠟或樹脂石蠟或樹脂染色染色：給細胞的不同組分帶上可區(qū)別：給細胞的不同組分帶上可區(qū)別的顏色特征的顏色特征切片：切片：110m光線通過細胞后的變化v發(fā)明：發(fā)明： 1934193

6、5 荷蘭物理學(xué)家荷蘭物理學(xué)家Zernike 設(shè)設(shè)計和發(fā)明相差顯微鏡，并獲得諾貝爾獎。計和發(fā)明相差顯微鏡，并獲得諾貝爾獎。優(yōu)點：優(yōu)點：樣品不需染色，可以觀察活細胞。樣品不需染色，可以觀察活細胞。原理原理：把透過標(biāo)本的可見光的把透過標(biāo)本的可見光的光程差光程差變成變成振振幅差幅差，表現(xiàn)為，表現(xiàn)為明與暗明與暗的對比，從而提高了各的對比，從而提高了各種結(jié)構(gòu)之間的對比度，使標(biāo)本的各種結(jié)構(gòu)變種結(jié)構(gòu)之間的對比度，使標(biāo)本的各種結(jié)構(gòu)變得更清晰。得更清晰。xy透明玻璃透明玻璃產(chǎn)生相位差產(chǎn)生相位差產(chǎn)生振幅差產(chǎn)生振幅差Z有明暗之分有明暗之分吸光物質(zhì)吸光物質(zhì) 聚光器或光源上增加一聚光器或光源上增加一環(huán)形環(huán)形光闌光闌，使透

7、過聚光器的光線，使透過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標(biāo)本形成空心光錐，焦聚到標(biāo)本上；上； 物鏡后裝有一塊物鏡后裝有一塊“相差板相差板”，相差板上涂有特殊吸光物質(zhì)；相差板上涂有特殊吸光物質(zhì)； 偏斜和未偏斜的兩組光線之偏斜和未偏斜的兩組光線之間增添了新的光程差，從而間增添了新的光程差，從而對樣品密度的不同造成的對樣品密度的不同造成的相相位差位差起起“夸大夸大”作用；作用；吸光區(qū)吸光區(qū)半透明半透明圓環(huán)圓環(huán)不透明的涂不透明的涂漆部分漆部分透明的環(huán)透明的環(huán)狀部分狀部分特點：光源為特點：光源為短波光短波光；有兩個特殊的濾光片有兩個特殊的濾光片： 第一：激發(fā)濾片第一：激發(fā)濾片 第二：阻斷濾片第二：阻斷濾片

8、熒光顯微鏡熒光顯微鏡Fluorescence image, DNA in blue and Microtubules in green 用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。 用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。熒光顯微鏡及其照片熒光顯微鏡及其照片 1）分為：）分為：免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)熒光素直接標(biāo)記技術(shù)熒光素直接標(biāo)記技術(shù)2）原理）原理 ：（以免疫熒光技術(shù)為例以免疫熒光技術(shù)為例）特定抗原特定抗原（細胞）（細胞）抗體抗體抗體抗原抗體抗原復(fù)合物復(fù)合物進行定位進行定位測定測定熒光素?zé)晒馑丶ぐl(fā)光激發(fā)光不同的熒光素不同的熒光素的激發(fā)光波長的

9、激發(fā)光波長范圍不同，所范圍不同，所以同一樣品可以同一樣品可以同時用兩種以同時用兩種以上的熒光素以上的熒光素（如：紫外線）（如：紫外線）3）局限性：）局限性：固定劑常會破壞抗原性；固定劑常會破壞抗原性； 包埋劑常會產(chǎn)生自發(fā)熒光。包埋劑常會產(chǎn)生自發(fā)熒光。原理：原理： 是由一個激光掃描顯微鏡在物鏡的成像面上加是由一個激光掃描顯微鏡在物鏡的成像面上加一個針孔組成，只有被照亮點發(fā)出的光才能通一個針孔組成，只有被照亮點發(fā)出的光才能通過共焦孔，偏離這一點的無用的熒光就被排除過共焦孔，偏離這一點的無用的熒光就被排除在最終的圖像之外；在最終的圖像之外； 物鏡和聚光鏡物鏡和聚光鏡同時同時聚焦聚焦到同一個小點，即它

10、們到同一個小點，即它們互相共焦點，極大的增加了對比度；互相共焦點，極大的增加了對比度； 逐點、逐行、逐面快速掃描，形成立體圖像，逐點、逐行、逐面快速掃描，形成立體圖像，能顯示細胞樣品的立體結(jié)構(gòu)；能顯示細胞樣品的立體結(jié)構(gòu)； 效果：效果：使觀察到的圖像反差和分辨率提高使觀察到的圖像反差和分辨率提高 分辨率比普通熒光學(xué)顯微鏡提高分辨率比普通熒光學(xué)顯微鏡提高1.41.7倍。倍。激光共焦點掃描顯微鏡的原理圖激光共焦點掃描顯微鏡的原理圖共聚焦顯微鏡及其顯微圖像共聚焦顯微鏡及其顯微圖像免疫熒光顯微鏡技術(shù)（免疫熒光顯微鏡技術(shù)（A）和激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)）和激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)(B)的比較的比較 倒置顯微鏡

11、倒置顯微鏡 其結(jié)構(gòu)組成與普通其結(jié)構(gòu)組成與普通顯微鏡一樣，所不同顯微鏡一樣，所不同的是它的物鏡與照明的是它的物鏡與照明系統(tǒng)的位置顛倒過來，系統(tǒng)的位置顛倒過來，物鏡在載物臺的下方，物鏡在載物臺的下方，可直接對培養(yǎng)的細胞可直接對培養(yǎng)的細胞進行照明和觀察。進行照明和觀察。 聚光鏡中央有擋光片，聚光鏡中央有擋光片，視視野背景是黑的野背景是黑的，只允許被，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進標(biāo)本反射和衍射的光線進入物鏡，物體邊緣是亮的。入物鏡，物體邊緣是亮的。 可觀察可觀察 4200nm的微粒的微粒子，分辨率比普通顯微鏡子，分辨率比普通顯微鏡高高50倍。倍。 采用組合方式，集采用組合方式，集普通光鏡、相差、普通

12、光鏡、相差、熒光、暗視野、攝熒光、暗視野、攝影裝置于一體；影裝置于一體； 自動化與電子化自動化與電子化。（一）電子顯微鏡的基本知識（一）電子顯微鏡的基本知識1、基本構(gòu)造、基本構(gòu)造電子束照明系統(tǒng)：電子束照明系統(tǒng)：電子槍電子槍聚光鏡聚光鏡成像系統(tǒng)成像系統(tǒng)物鏡物鏡中間鏡中間鏡投影鏡投影鏡真空系統(tǒng)真空系統(tǒng)記錄系統(tǒng)記錄系統(tǒng)（電磁透鏡）（電磁透鏡）電子顯微鏡的分辨率為電子顯微鏡的分辨率為0.2nm，放大倍數(shù)可達百，放大倍數(shù)可達百萬倍；萬倍；2.電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別分辨本分辨本領(lǐng)領(lǐng)光源光源透鏡透鏡真空真空成像原理成像原理光學(xué)光學(xué)顯微顯微鏡鏡200200nmnm10

13、0nm100nm可見光可見光( (波長波長400-700400-700nm)nm)紫外光紫外光( (波長波長約約200200nm)nm)玻璃玻璃透鏡透鏡玻璃玻璃透鏡透鏡不要不要求真求真空空利用樣品對光利用樣品對光的吸收形成明的吸收形成明暗反差和顏色暗反差和顏色變化變化電子電子顯微顯微鏡鏡接近接近0.10.1nmnm電子束電子束( (波長波長0.01-0.90.01-0.9nm)nm)電磁電磁透鏡透鏡要求要求真空真空利用樣品對電利用樣品對電子的散射和透子的散射和透鏡形成明暗反鏡形成明暗反差差 切片厚度一般僅為切片厚度一般僅為4050nm固定：鋨酸（固定：鋨酸（OsO4）和戊二醛等；和戊二醛等；包

14、埋：環(huán)氧樹脂；包埋：環(huán)氧樹脂；切片：切片：染色：重金屬鹽；形染色：重金屬鹽；形成明暗反差成明暗反差電鏡生物樣品制備過程電鏡生物樣品制備過程固定清洗后系列梯度清洗后系列梯度丙酮或酒精脫水丙酮或酒精脫水浸泡于稀浸泡于稀包埋劑中包埋劑中包埋劑包埋劑樣品桿樣品桿用玻璃刀或用玻璃刀或鉆石刀切片鉆石刀切片切片機切片機修塊修塊包埋塊包埋塊置溫箱中包置溫箱中包埋劑聚合埋劑聚合收集切片收集切片于載網(wǎng)上于載網(wǎng)上重金屬染色置重金屬染色置電鏡下觀察電鏡下觀察 用重金屬鹽用重金屬鹽(如磷鎢如磷鎢酸酸) 染色；吸去染料染色；吸去染料干燥后，樣品凹陷處干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，鋪了一層重金屬鹽，而凸出的地方?jīng)]有染

15、而凸出的地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負料沉積，從而出現(xiàn)負染效果，分辨力可達染效果，分辨力可達1.5nm左右。左右。Negative Stained Archaebacteria 將標(biāo)本在標(biāo)本臺上于將標(biāo)本在標(biāo)本臺上于196的液氮中超低溫的液氮中超低溫迅速冰凍；防止形成冰晶。迅速冰凍；防止形成冰晶。 用冷刀將凍結(jié)的標(biāo)本驟然斷開用冷刀將凍結(jié)的標(biāo)本驟然斷開； 當(dāng)溫度上升后，冰在真空條件下迅速當(dāng)溫度上升后，冰在真空條件下迅速升華升華，斷，斷裂面上的結(jié)構(gòu)得以暴露裂面上的結(jié)構(gòu)得以暴露（蝕刻）（蝕刻）； 再噴涂上一層蒸氣再噴涂上一層蒸氣鉑和碳鉑和碳； 將樣品本身溶解掉，把噴涂上的碳和鉑的膜剝將樣品本身溶解掉，把

16、噴涂上的碳和鉑的膜剝離下來離下來（復(fù)膜）（復(fù)膜）； 電鏡觀察。電鏡觀察。培養(yǎng)細胞內(nèi)面的深度蝕刻電鏡照片，示 Clathrin衣被工作原理：是用一束極細的電子束掃描樣品，在工作原理：是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出樣品表面激發(fā)出二次電子二次電子，二次電子的多少與樣，二次電子的多少與樣品表面形貌有關(guān)，二次電子由探測器收集，信號品表面形貌有關(guān)，二次電子由探測器收集，信號經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強度，顯示出經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。與電子束同步的掃描圖像。 CO2臨界點干燥法防止引起樣品變形的表面張力臨界點干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題

17、問題 為了使標(biāo)本表面發(fā)射出二次電子信號，標(biāo)本在固為了使標(biāo)本表面發(fā)射出二次電子信號，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜。定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜。Red blood cell Yeast 人類精子人類精子 原理：利用量子力學(xué)中的原理：利用量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)隧道效應(yīng) （通常在低壓下，二電極之間有很大的阻抗，阻止（通常在低壓下，二電極之間有很大的阻抗，阻止電流通過，稱為疊勢）電流通過，稱為疊勢） 當(dāng)二電極之間近到一定距離（當(dāng)二電極之間近到一定距離（100nm以內(nèi)）時，以內(nèi)）時，電極之間產(chǎn)生了電流，稱為電極之間產(chǎn)生了電流，稱為隧道電流隧道電流，并且隧道電流，并且隧道電流和針尖與樣品之間

18、的和針尖與樣品之間的間距間距呈呈指數(shù)指數(shù)關(guān)系。將掃描過程中關(guān)系。將掃描過程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。形態(tài)。 特點：特點： 1. 原子尺度的高分辨率；原子尺度的高分辨率； 2. 可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；可在真空、大氣、液體等多種條件下工作； 3.非破壞測量；非破壞測量；掃描隧道顯微掃描隧道顯微鏡觀察的鏡觀察的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu)STM image of a DNA molecule二、二、 細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類 與脂質(zhì)等的顯示方法與脂質(zhì)等的顯示方法三、放射自顯影技術(shù)三

19、、放射自顯影技術(shù)四、分子雜交技術(shù)四、分子雜交技術(shù)五、定量細胞化學(xué)分析技術(shù)五、定量細胞化學(xué)分析技術(shù) 差速離心差速離心 密度梯度離心密度梯度離心 是分離細胞器及各種大分子基本手段。是分離細胞器及各種大分子基本手段。 轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速1025kr/min的離心機稱為的離心機稱為高速離心機高速離心機。 轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速30kr/min，離心力，離心力89Kg者稱為者稱為超速離超速離心機心機。 超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達150000r/min，離，離心力超過心力超過500kg。 方法：方法： （一）差速離心（一）差速離心 利用不同的離心速度所產(chǎn)生的不同的離心力，利用不同的離心速度所產(chǎn)生的不同的離心

20、力，將各種亞細胞組分和各種顆粒分開。將各種亞細胞組分和各種顆粒分開。原理原理 : 在一定的離心速度下，不同大小的細胞器由在一定的離心速度下，不同大小的細胞器由于體積的不同，沉降的速度也不同，體積大的沉降的于體積的不同，沉降的速度也不同，體積大的沉降的快，反之沉降的慢?？?，反之沉降的慢。用途用途：分離大小相差懸殊的細胞和細胞器：分離大小相差懸殊的細胞和細胞器。 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 離心力離心力 細胞核細胞核 8001000g 線粒體線粒體 20,000-30,000g 葉綠體葉綠體 20,000-30,000g 溶酶體溶酶體 20,000-30,000g 微體微體 20,000-30,000g粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)粗

21、面內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 50,000-80,000g質(zhì)膜和光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)膜和光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 80,000-100,000g游離核糖體、病毒粒子游離核糖體、病毒粒子 150,000-300,000g不同的細胞結(jié)構(gòu)分離所需的離心力沉降順序：核沉降順序：核線粒體線粒體溶酶溶酶體與過氧化物酶體體與過氧化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體體核蛋白體。核蛋白體。 用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度密度梯度，將分離的細胞組分小心置于介，將分離的細胞組分小心置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使樣品中質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使樣品中不同組分以不同的沉降率沉降，形成不同不同組分以不同的

22、沉降率沉降，形成不同的沉降帶，從而將細胞成分分層、分離。的沉降帶，從而將細胞成分分層、分離。 類型：類型：速度沉降、等密度沉降速度沉降、等密度沉降。 常用介質(zhì)：常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。 用途用途：分離密度相近而大小不等的細胞組：分離密度相近而大小不等的細胞組分。分。 特點特點：介質(zhì)密度較低。：介質(zhì)密度較低。 原理原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離。的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離。 用途用途：分離密度不等的顆粒。：分離密度不等的顆粒。 特點特點：1）介質(zhì)密度高，陡度大，介質(zhì)最高密度）介質(zhì)密

23、度高，陡度大，介質(zhì)最高密度大于被分離組分的最大密度。大于被分離組分的最大密度。2）力場比速度沉降法大）力場比速度沉降法大10100倍，需要高速或倍，需要高速或超速離心。超速離心。 原理原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定時間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，時間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的成分并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的成分分離。分離。二、二、 細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類與脂細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類與脂質(zhì)等的顯示方法質(zhì)等的顯示方法 為了測定蛋白質(zhì)、核酸、多糖和脂類等細為了測定蛋白質(zhì)、

24、核酸、多糖和脂類等細胞組分，常利用一些胞組分，常利用一些顯色劑顯色劑與所檢測物質(zhì)中與所檢測物質(zhì)中特殊基團的特異性結(jié)合，通過顯色劑在細胞特殊基團的特異性結(jié)合，通過顯色劑在細胞中出現(xiàn)的部位和顏色顯示的程度，從而判斷中出現(xiàn)的部位和顏色顯示的程度，從而判斷被檢物質(zhì)在細胞中的分布和含量。被檢物質(zhì)在細胞中的分布和含量。 DNA Feulgen反應(yīng)反應(yīng)多糖多糖 PAS反應(yīng)反應(yīng) 如淀粉、纖維素及動物如淀粉、纖維素及動物 細胞中的糖原、粘蛋白等。細胞中的糖原、粘蛋白等。脂類脂類 蘇丹染色等蘇丹染色等蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) Millon反應(yīng)反應(yīng) 用于研究標(biāo)記化合物在機體、組織和細胞中的用于研究標(biāo)記化合物在機體、組織和細胞中

25、的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。作用部位等等。原理：原理：將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。 一般用一般用14C和和3H標(biāo)記。常用標(biāo)記。常用3H-TDR來顯示來顯示DNA，用，用3H-UDR顯示顯示RNA；用；用3H氨基酸研究蛋氨基酸研究蛋白質(zhì)，用白質(zhì)，用3H甘露糖、甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。巖藻糖研究多糖。14C半衰期為半衰期為5730年，年，

26、3H為為12.5年。年。 具有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)具有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測定單鏈分子雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補關(guān)系。核苷酸序列間是否具有互補關(guān)系。 原位雜交原位雜交（in situ hybridization）。）。 用于檢測染色體上的特殊用于檢測染色體上的特殊DNA序列。最初是使用放射性序列。最初是使用放射性DNA探針，后來又發(fā)明了免疫探針法。探針，后來又發(fā)明了免疫探針法

27、。人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片 （一）（一）顯微分光光度測定技術(shù)顯微分光光度測定技術(shù)利用細胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異光譜的利用細胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異光譜的吸收，測定這些物質(zhì)，吸收，測定這些物質(zhì)，如核酸與蛋白如核酸與蛋白質(zhì)等）在細胞內(nèi)的含量。質(zhì)等）在細胞內(nèi)的含量。 包括：包括：紫外光顯微分光光度測定法紫外光顯微分光光度測定法 可見光顯微分光光度測定法可見光顯微分光光度測定法主要應(yīng)用：主要應(yīng)用： 用于定量測定細胞中的用于定量測定細胞中的DNADNA、RNARNA或某一特或某一特 異蛋白的含量；異蛋白的含量； 測定細胞群體中不同時相細胞的數(shù)量測定細胞群體中不同時相細胞的數(shù)量； 從細胞群體中分離某些特

28、異染色的細胞；從細胞群體中分離某些特異染色的細胞； 分離分離DNADNA含量不同的中期染色體。含量不同的中期染色體。 2000V2000V高壓偏轉(zhuǎn)板高壓偏轉(zhuǎn)板充以正電充以正電的小水滴的小水滴充以充以負電負電的小的小水滴水滴分別收集細胞分別收集細胞激光激光排列成單列的細胞通排列成單列的細胞通過激光束時，儀器可過激光束時，儀器可測定出標(biāo)記細胞上的測定出標(biāo)記細胞上的熒光強度；熒光強度；儀器使帶有熒光細胞儀器使帶有熒光細胞的小水滴充電；的小水滴充電；帶電水滴通過高壓偏帶電水滴通過高壓偏轉(zhuǎn)板偏離原來方向，轉(zhuǎn)板偏離原來方向，收集細胞；收集細胞；未含標(biāo)記的細胞或不未含標(biāo)記的細胞或不含有細胞的水滴不偏含有細胞

29、的水滴不偏轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)。水滴水滴充電充電信號信號 第三節(jié)第三節(jié) 細胞培養(yǎng)、細胞工程技細胞培養(yǎng)、細胞工程技術(shù)與顯微操作技術(shù)術(shù)與顯微操作技術(shù)一、細胞培養(yǎng)一、細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)技術(shù)是細胞生物學(xué)研究方法中細胞培養(yǎng)技術(shù)是細胞生物學(xué)研究方法中最有價值的技術(shù)，通過細胞培養(yǎng)可以獲得大最有價值的技術(shù)，通過細胞培養(yǎng)可以獲得大量的細胞，也可通過細胞培養(yǎng)研究細胞的運量的細胞，也可通過細胞培養(yǎng)研究細胞的運動、細胞的信號傳導(dǎo)、細胞的合成代謝等動、細胞的信號傳導(dǎo)、細胞的合成代謝等。 體外培養(yǎng)細胞必須注意三個環(huán)節(jié)：體外培養(yǎng)細胞必須注意三個環(huán)節(jié)： 物質(zhì)營養(yǎng)：由培養(yǎng)基提供。物質(zhì)營養(yǎng)：由培養(yǎng)基提供。 物質(zhì)營養(yǎng)、生存環(huán)境和廢物物質(zhì)營養(yǎng)、生

30、存環(huán)境和廢物的排除。的排除。1、原代培養(yǎng)、原代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)是指直接從機體取下細原代培養(yǎng)是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行培養(yǎng)。胞、組織和器官后立即進行培養(yǎng)。但一般通常把第一代至第十代以內(nèi)但一般通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細胞統(tǒng)稱為的培養(yǎng)細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)原代細胞培養(yǎng)。 （一）動物細胞培養(yǎng)（一）動物細胞培養(yǎng)2、細胞系和細胞株、細胞系和細胞株原代培養(yǎng)經(jīng)首次傳代成功后即為原代培養(yǎng)經(jīng)首次傳代成功后即為細胞系細胞系細胞細胞系系傳至傳至50代后，許多細胞不能再傳下代后，許多細胞不能再傳下去，但有少部分細胞發(fā)生遺傳突變，可在去，但有少部分細胞發(fā)生遺傳突變，可在培養(yǎng)條件下無限制地傳下去培養(yǎng)條

31、件下無限制地傳下去，這種傳代細這種傳代細胞稱為胞稱為永生細胞系永生細胞系。 10代代 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) 50代代 傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng) 遺傳物質(zhì)不變，接觸抑制遺傳物質(zhì)不變，接觸抑制 （細胞系細胞系） 傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng) 遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，無接觸抑制遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，無接觸抑制 3、 動物細胞培養(yǎng)方法動物細胞培養(yǎng)方法貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng) 分散的細胞懸浮在培養(yǎng)瓶中很快就貼分散的細胞懸浮在培養(yǎng)瓶中很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁，貼壁后的附在瓶壁上，稱為細胞貼壁，貼壁后的細胞形態(tài)形成多態(tài)性，呈單層生長，所細胞形態(tài)形成多態(tài)性，呈單層生長，所以此法又叫以此法又叫單層細胞培養(yǎng)單層細胞培養(yǎng)，單層培養(yǎng)的，單層培養(yǎng)的細胞

32、保持細胞保持接觸抑制接觸抑制的特性。的特性。懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng)的細胞在培養(yǎng)過程中不貼壁，懸浮培養(yǎng)的細胞在培養(yǎng)過程中不貼壁，一直懸浮在培養(yǎng)液中生長，如一直懸浮在培養(yǎng)液中生長，如T細胞的培細胞的培養(yǎng)就是如此。懸浮培養(yǎng)的條件較為復(fù)雜，養(yǎng)就是如此。懸浮培養(yǎng)的條件較為復(fù)雜，難度也較大，但是容易同時獲得大量的培難度也較大，但是容易同時獲得大量的培養(yǎng)細胞。養(yǎng)細胞。 單倍體細胞培養(yǎng)單倍體細胞培養(yǎng)：花藥：花藥 原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)：體細胞經(jīng)纖維素酶處理去：體細胞經(jīng)纖維素酶處理去掉細胞壁掉細胞壁 原生質(zhì)體原生質(zhì)體 (三三)非細胞體系非細胞體系：由來源于細胞，而不具有：由來源于細胞，而不具有完整的細胞結(jié)

33、構(gòu)與成分，但包含了進行正完整的細胞結(jié)構(gòu)與成分，但包含了進行正常生物學(xué)反應(yīng)所需的物質(zhì)（如供能系統(tǒng)和常生物學(xué)反應(yīng)所需的物質(zhì)（如供能系統(tǒng)和酶反應(yīng)體系等）組成的體系。酶反應(yīng)體系等）組成的體系。 用于用于DNA復(fù)制，復(fù)制，RNA轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)合成，轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)合成，高爾基體的膜泡運輸，細胞核裝配等高爾基體的膜泡運輸，細胞核裝配等 細胞提取物，細胞核提取物細胞提取物，細胞核提取物二、二、 細胞工程細胞工程（一）細胞融合（一）細胞融合細胞融合細胞融合是指自發(fā)或人工誘導(dǎo)下，兩個或多是指自發(fā)或人工誘導(dǎo)下，兩個或多個細胞融合形成一個雙核或多核細胞的現(xiàn)象。個細胞融合形成一個雙核或多核細胞的現(xiàn)象。 自發(fā)的動物細胞融合幾

34、率很低，自發(fā)的動物細胞融合幾率很低，1962年年Okada和和Tadokoro發(fā)現(xiàn)滅活的發(fā)現(xiàn)滅活的仙臺病毒仙臺病毒有促進細胞融合的作有促進細胞融合的作用。用。病毒外殼上的病毒外殼上的糖蛋白糖蛋白具有促進細胞融合的功能。具有促進細胞融合的功能。聚乙二醇聚乙二醇也有促進細胞融合的功能。也有促進細胞融合的功能。（二）（二） 單克隆抗體單克隆抗體 19751975年英國科學(xué)家年英國科學(xué)家Milstein和和Kohler將產(chǎn)生抗體將產(chǎn)生抗體 的的淋巴細胞淋巴細胞同同腫瘤細胞融合腫瘤細胞融合，成功建立了單克隆抗，成功建立了單克隆抗 體技術(shù)，而獲得體技術(shù)，而獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎。年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎。 每個每個B淋巴細胞僅專一地產(chǎn)生、分泌一種針對某淋巴細胞僅專一地產(chǎn)生、分泌一種針對某 種抗原決定簇的種抗原決定簇的特異性抗體特異性抗體，而腫瘤細胞可以無限，而腫瘤細胞可以無限 增殖，因此雜交瘤細胞可在體外培養(yǎng)或移植到體內(nèi)增殖，因