第四章 酶學(xué)分析技術(shù)

1、第四章 酶學(xué)分析技術(shù) -酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶丙酮酸Ala + Glu丙氨酸谷氨酸常見酶類v丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT或GPTv乳酸脫氫酶（乳酸脫氫酶（LDH） v天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST或或GOT） v肌酸激酶（肌酸激酶（CK） v5-核苷酸酶（5-NT)v -羥丁酸脫氫酶（ -HBD)一、酶活性一、酶活性n定義：酶活性（定義：酶活性（enzyme activityenzyme activity）也稱為酶活力，指）也稱為酶活力，指酶促反應(yīng)速率，即規(guī)定條件下在單位時(shí)間內(nèi)酶促反應(yīng)速率，即規(guī)定條件下在單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的生成產(chǎn)物的生成量量或底物的減少量。或底物的減少量。 n表示方法：表示方法

2、： dtPdv或或dtSdv 式中式中v v：反應(yīng)速率，：反應(yīng)速率，P P ：產(chǎn)物濃度，：產(chǎn)物濃度，t t：時(shí)間，：時(shí)間，SS：底物濃度。：底物濃度。 注：在實(shí)際測(cè)定酶促反應(yīng)速度時(shí)，以測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的注：在實(shí)際測(cè)定酶促反應(yīng)速度時(shí)，以測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的生成量為好。生成量為好。二、酶活性單位二、酶活性單位（一）酶活性單位（一）酶活性單位u定義：表示酶的相對(duì)含量，指在一定條件下，定義：表示酶的相對(duì)含量，指在一定條件下，單位時(shí)間內(nèi)單位時(shí)間內(nèi)生成一定量的產(chǎn)物或消耗一定量的底物所催化的酶量生成一定量的產(chǎn)物或消耗一定量的底物所催化的酶量。 u表示方法：表示方法：慣用單位（一定的反應(yīng)量慣用單位（一定的反

3、應(yīng)量/ /一定的反應(yīng)時(shí)間）一定的反應(yīng)時(shí)間）國(guó)際單位國(guó)際單位IUIU（mol/minmol/min）KatalKatal單位（單位（mol/smol/s） 1 1慣用單位：慣用單位： 2020世紀(jì)世紀(jì)6060年代以前根據(jù)酶活性測(cè)定方法建立者的姓氏命名的單位年代以前根據(jù)酶活性測(cè)定方法建立者的姓氏命名的單位 ALPALP的金氏單位（的金氏單位（KingKing）氨基移轉(zhuǎn)酶的卡門氏單位（氨基移轉(zhuǎn)酶的卡門氏單位（KarmenKarmen） 特點(diǎn)：各單位對(duì)溫度、時(shí)間、物質(zhì)量的定義不同，導(dǎo)致各測(cè)特點(diǎn)：各單位對(duì)溫度、時(shí)間、物質(zhì)量的定義不同，導(dǎo)致各測(cè)定值、參考范圍相差很大，彼此間無法比較定值、參考范圍相差很大，

4、彼此間無法比較, ,現(xiàn)在臨床應(yīng)用較現(xiàn)在臨床應(yīng)用較少。少?？ㄩT氏單位：卡門氏單位：1.0ml1.0ml血清在血清在2525，340nm340nm，反應(yīng)體積，反應(yīng)體積3.0ml,3.0ml,光徑光徑1.0cm1.0cm時(shí)每分鐘測(cè)定吸光度下降時(shí)每分鐘測(cè)定吸光度下降0.0010.001，即消耗，即消耗4.82 4.82 10 10-4mol NADH-4mol NADH為一為一個(gè)卡門氏單位個(gè)卡門氏單位舉例：舉例：金氏單位：金氏單位：100ml100ml血清血清ALPALP在在3737與底物作用與底物作用15min15min，產(chǎn)生，產(chǎn)生1mg1mg酚。酚。2.2.國(guó)際單位國(guó)際單位IUIU（mol/min

5、mol/min）定義：在規(guī)定條件下（定義：在規(guī)定條件下（2525及其他最適條件），每及其他最適條件），每minmin催化催化1mol1mol底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的酶量，為底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的酶量，為1U1U，1U=1mol/min1U=1mol/min。 IFCC,2001IFCC,2001年年37373 3KatalKatal單位單位 定義：定義：1Katal1Katal是在規(guī)定條件下，每秒鐘催化是在規(guī)定條件下，每秒鐘催化1mol1mol底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的酶量。酶量。1Katal1Katal1mol/s1mol/s。 IUIU與與KatalKatal單位的關(guān)系：?jiǎn)挝坏年P(guān)系：1katal

6、= 601katal = 6010106 6U U，1U = 16.67nkatal 1U = 16.67nkatal 三、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)三、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 以以產(chǎn)物生成量（或反產(chǎn)物生成量（或反應(yīng)物減少量）為縱坐標(biāo)、應(yīng)物減少量）為縱坐標(biāo)、反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖所作圖所得到的一條曲線，稱為反得到的一條曲線，稱為反應(yīng)進(jìn)程曲線（或反應(yīng)時(shí)間應(yīng)進(jìn)程曲線（或反應(yīng)時(shí)間曲線、速率曲線、時(shí)間曲曲線、速率曲線、時(shí)間曲線）線） t1 t2 時(shí)間t 圖5-1酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線吸光度A延滯期線性期非線性期（一）延滯期（一）延滯期（lag phase、延遲期、延遲期 ）u特點(diǎn)：為反應(yīng)的初始階段，反應(yīng)速率一開始

7、時(shí)較慢，通常為幾秒到幾分鐘特點(diǎn)：為反應(yīng)的初始階段，反應(yīng)速率一開始時(shí)較慢，通常為幾秒到幾分鐘 t1 t2 時(shí)間t 圖5-1酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線吸光度A線性期非線性期R1R2延滯期孵育期延滯期（二）線性期（二）線性期此階段酶促反應(yīng)速率此階段酶促反應(yīng)速率基本保持恒定基本保持恒定；對(duì)底物而言，為反應(yīng)速率與底物濃度對(duì)底物而言，為反應(yīng)速率與底物濃度SS的零次方成正比的的零次方成正比的零級(jí)反零級(jí)反應(yīng)應(yīng)，即不受底物濃度的影響，而只與酶活性濃度成正比，即不受底物濃度的影響，而只與酶活性濃度成正比 ； 此時(shí)底物的消耗量小于此時(shí)底物的消耗量小于5%5%，反應(yīng)速率，反應(yīng)速率為反應(yīng)初速率為反應(yīng)初速率。酶活性濃度越高，線性期

8、就越短酶活性濃度越高，線性期就越短 線性度：判斷線性期的一個(gè)指標(biāo)，指吸光度（線性度：判斷線性期的一個(gè)指標(biāo)，指吸光度（A A）相對(duì)于時(shí)間（）相對(duì)于時(shí)間（minmin）變化的可以接受）變化的可以接受的程度的程度 。 線性度線性度= =前半段前半段A/minA/min后半段后半段A/minA/min/ /（前半段（前半段A/minA/min后半段后半段A/minA/min）/2/2100100 線性度值越小則線性越好。一般判斷標(biāo)準(zhǔn)：不大于線性度值越小則線性越好。一般判斷標(biāo)準(zhǔn)：不大于1515，否則判為非線性，否則判為非線性u(píng)特點(diǎn)：可代表酶促反應(yīng)速度特點(diǎn)：可代表酶促反應(yīng)速度（三）非線性期（三）非線性期（

9、偏離線性期、平坦期偏離線性期、平坦期 ）u進(jìn)入非線性期的原因：進(jìn)入非線性期的原因： 反應(yīng)的不斷進(jìn)行，反應(yīng)的不斷進(jìn)行，底物消耗越來越多，酶變性失活增加、可逆反底物消耗越來越多，酶變性失活增加、可逆反應(yīng)增強(qiáng)、產(chǎn)物抑制增加應(yīng)增強(qiáng)、產(chǎn)物抑制增加等使得反應(yīng)速率明顯下降。等使得反應(yīng)速率明顯下降。u特點(diǎn)：特點(diǎn)： 若為單底物的反應(yīng)，則此時(shí)反應(yīng)速率與單底物濃度若為單底物的反應(yīng)，則此時(shí)反應(yīng)速率與單底物濃度SS的一次方的一次方成正比，為成正比，為一級(jí)反應(yīng)一級(jí)反應(yīng)。偶聯(lián)：偶聯(lián)：工具酶與待測(cè)酶、工具酶與工具酶之間的聯(lián)合。工具酶與待測(cè)酶、工具酶與工具酶之間的聯(lián)合。 工具酶：工具酶：將作為試劑用于測(cè)定待測(cè)酶活性或底物濃度的

10、酶。將作為試劑用于測(cè)定待測(cè)酶活性或底物濃度的酶。工具酶有工具酶有氧化還原酶類、轉(zhuǎn)移酶類和水解酶類氧化還原酶類、轉(zhuǎn)移酶類和水解酶類n分類：分類：第二節(jié) 酶學(xué)分析的類型表表7-2 7-2 常用工具酶的名稱及其縮寫符號(hào)常用工具酶的名稱及其縮寫符號(hào) 名名 稱稱 縮寫符號(hào)縮寫符號(hào) 名名 稱稱 縮寫符號(hào)縮寫符號(hào)乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶 LDH蘋果酸脫氫酶蘋果酸脫氫酶 MDH6-磷酸葡萄糖脫氫酶磷酸葡萄糖脫氫酶 G6PD谷氨酸脫氫酶谷氨酸脫氫酶 GLDH葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 GOD膽固醇氧化酶膽固醇氧化酶 COD磷酸甘油氧化酶磷酸甘油氧化酶 GPO過氧化物酶過氧化物酶 POD己糖激酶己糖激酶 HK肌酸激酶肌

11、酸激酶 CK丙酮酸激酶丙酮酸激酶 PK甘油激酶甘油激酶 GK脂蛋白脂肪酶脂蛋白脂肪酶 LPL膽固醇酯酶膽固醇酯酶 CE脲酶脲酶肌酐酶肌酐酶 常用品工具酶主要是氧化還原酶類，部分常用品工具酶主要是氧化還原酶類，部分轉(zhuǎn)移酶類和水解酶類。轉(zhuǎn)移酶類和水解酶類。工具酶的質(zhì)量要求工具酶的質(zhì)量要求 工具酶的用量一般較多，故工具酶的用量一般較多，故要求工具酶來源廣泛，價(jià)廉易得，純度要求不要求工具酶來源廣泛，價(jià)廉易得，純度要求不太高，可降低制備成本，但對(duì)工具酶中的雜質(zhì)太高，可降低制備成本，但對(duì)工具酶中的雜質(zhì)也要有一定的限制，以保證工具酶有一定的比也要有一定的限制，以保證工具酶有一定的比活性，減少或避免一些能干擾

12、測(cè)定的副反應(yīng)?；钚裕瑴p少或避免一些能干擾測(cè)定的副反應(yīng)。NAD(P)或或NAD(P)H偶聯(lián)的脫氫酶及指示反應(yīng)，偶聯(lián)的脫氫酶及指示反應(yīng)，NADH和和NADPH在在340nm有光吸收特性，可用紫有光吸收特性，可用紫外分光光度計(jì)直接測(cè)定，另外，外分光光度計(jì)直接測(cè)定，另外，NAD(P)H還有強(qiáng)還有強(qiáng)烈熒光，其激發(fā)光波長(zhǎng)為烈熒光，其激發(fā)光波長(zhǎng)為365nm，熒光波長(zhǎng)為，熒光波長(zhǎng)為460nm，熒光法的靈敏度比分光光度法高。，熒光法的靈敏度比分光光度法高。如如 ALT測(cè)定測(cè)定 工具酶是工具酶是LDH二、二、 酶活性的測(cè)定方法酶活性的測(cè)定方法n測(cè)定方法分類：測(cè)定方法分類： 按照儀器檢測(cè)方法分類按照儀器檢測(cè)方法分類

13、：分光光度法、濁度法、熒光法、：分光光度法、濁度法、熒光法、放射性核素法、電位滴定法、電極法、量氣法。放射性核素法、電位滴定法、電極法、量氣法。 按照反應(yīng)時(shí)間分類按照反應(yīng)時(shí)間分類；分為；分為定時(shí)法、連續(xù)監(jiān)測(cè)法定時(shí)法、連續(xù)監(jiān)測(cè)法和平衡法。和平衡法。 按照檢測(cè)對(duì)象分類按照檢測(cè)對(duì)象分類：分為直接法和間接法。：分為直接法和間接法。 1、定時(shí)法、定時(shí)法u原理：原理： 定時(shí)法是固定時(shí)間法的簡(jiǎn)稱，是指測(cè)定反應(yīng)開始后一段時(shí)間（定時(shí)法是固定時(shí)間法的簡(jiǎn)稱，是指測(cè)定反應(yīng)開始后一段時(shí)間（t1t1t2t2）產(chǎn)物的增加量或底物的減少量以測(cè)定酶活性的方法。）產(chǎn)物的增加量或底物的減少量以測(cè)定酶活性的方法。該方法一般需要該方法

14、一般需要在反應(yīng)進(jìn)行到一定時(shí)間后用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、蛋白沉淀劑等終止反應(yīng)在反應(yīng)進(jìn)行到一定時(shí)間后用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、蛋白沉淀劑等終止反應(yīng)。 u特點(diǎn)：特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單，因?yàn)樽詈鬁y(cè)定時(shí)酶促反應(yīng)已被終止，故比色時(shí)不需要簡(jiǎn)單，因?yàn)樽詈鬁y(cè)定時(shí)酶促反應(yīng)已被終止，故比色時(shí)不需要保溫設(shè)備，顯色劑的選擇也可不考慮對(duì)酶活性的影響。保溫設(shè)備，顯色劑的選擇也可不考慮對(duì)酶活性的影響。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：如果不做預(yù)試驗(yàn)則無法了解其酶促反應(yīng)進(jìn)程（如果不做預(yù)試驗(yàn)則無法了解其酶促反應(yīng)進(jìn)程（t1-t2t1-t2）是否）是否為零級(jí)反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)，故難以確保測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。，故難以確保測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。 吸光度At1 t2 時(shí)間t圖5-6定時(shí)法的三

15、種反應(yīng)進(jìn)程231定時(shí)法與兩點(diǎn)法、終點(diǎn)法的區(qū)別定時(shí)法與兩點(diǎn)法、終點(diǎn)法的區(qū)別 2. 連續(xù)監(jiān)測(cè)法（連續(xù)監(jiān)測(cè)法（continuoue monitosing）每隔一定時(shí)間（每隔一定時(shí)間（1060s）連續(xù)測(cè)定酶反應(yīng)）連續(xù)測(cè)定酶反應(yīng)中產(chǎn)物或底物的變化中產(chǎn)物或底物的變化量稱為連續(xù)監(jiān)測(cè)法。量稱為連續(xù)監(jiān)測(cè)法。又稱又稱動(dòng)力法或速率法動(dòng)力法或速率法，終點(diǎn)法的測(cè)定兩個(gè)時(shí)終點(diǎn)法的測(cè)定兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，該法進(jìn)行多點(diǎn)間點(diǎn)，該法進(jìn)行多點(diǎn)連續(xù)測(cè)定。連續(xù)測(cè)定。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：多點(diǎn)測(cè)定結(jié)果，連接成線，很多點(diǎn)測(cè)定結(jié)果，連接成線，很容易找到成直線的區(qū)段，因而可選擇線性容易找到成直線的區(qū)段，因而可選擇線性反應(yīng)期來計(jì)算酶活性，不需終止反應(yīng)，測(cè)反應(yīng)期

16、來計(jì)算酶活性，不需終止反應(yīng)，測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確。省時(shí)、省試劑。定結(jié)果較準(zhǔn)確。省時(shí)、省試劑。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：分光光度計(jì)必須有保溫裝置，分光光度計(jì)必須有保溫裝置，而且而且P或或S應(yīng)是可直接測(cè)定的化合物，如需應(yīng)是可直接測(cè)定的化合物，如需加入其他試劑則必須考慮它們對(duì)待測(cè)酶活加入其他試劑則必須考慮它們對(duì)待測(cè)酶活性是否有影響。性是否有影響。 3. 平衡法平衡法（end-paint amalyin）測(cè)定酶測(cè)定酶反應(yīng)開始后某一段時(shí)反應(yīng)開始后某一段時(shí)間內(nèi)間內(nèi)(從從t1t2)產(chǎn)物或產(chǎn)物或底物的總變化量稱為底物的總變化量稱為終點(diǎn)法。終點(diǎn)法。而而t1和和t2是是反應(yīng)歷程中的兩個(gè)點(diǎn)，反應(yīng)歷程中的兩個(gè)點(diǎn)，故又稱故又稱兩點(diǎn)法兩點(diǎn)

17、法。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便，測(cè)定產(chǎn)物時(shí)，酶反應(yīng)被終簡(jiǎn)便，測(cè)定產(chǎn)物時(shí)，酶反應(yīng)被終止，顯色劑的選擇只考慮對(duì)酶活性的影響，止，顯色劑的選擇只考慮對(duì)酶活性的影響，分光光度計(jì)不需保溫裝置。分光光度計(jì)不需保溫裝置。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：無法了解這段時(shí)間的反應(yīng)是否都無法了解這段時(shí)間的反應(yīng)是否都是零級(jí)反應(yīng)，故難以保證結(jié)果的真實(shí)性。是零級(jí)反應(yīng)，故難以保證結(jié)果的真實(shí)性。n計(jì)算公式計(jì)算公式: 產(chǎn)物的增加量產(chǎn)物的增加量 每單位規(guī)定的保溫時(shí)間每單位規(guī)定的保溫時(shí)間 10001000（mlml）酶單位酶單位/ /升升 = = 每單位規(guī)定的產(chǎn)物增加量每單位規(guī)定的產(chǎn)物增加量 實(shí)際保溫時(shí)間實(shí)際保溫時(shí)間 實(shí)際標(biāo)本用量（實(shí)際標(biāo)本用量（mlml）

18、分光光度法測(cè)定的公式：分光光度法測(cè)定的公式： （A A測(cè)定測(cè)定 A A對(duì)照）對(duì)照）VV總總10106 6 每單位規(guī)定的保溫時(shí)每單位規(guī)定的保溫時(shí)間間酶單位酶單位/ /升升 = = LVLV標(biāo)標(biāo) 實(shí)際保溫時(shí)間實(shí)際保溫時(shí)間第三節(jié)第三節(jié) 影響酶活性測(cè)定的因素影響酶活性測(cè)定的因素一、標(biāo)本一、標(biāo)本 1. 溶血溶血 RBC中某些酶活性比血高，如中某些酶活性比血高，如LDH高高150倍，倍，AST高高15倍，倍，ALT高高7.5倍。倍。 2. 抗凝劑抗凝劑 某些酶可被抗凝劑抑制，如某些酶可被抗凝劑抑制，如EDTA、草酸鹽，可抑制需、草酸鹽，可抑制需Ca2+的的AMS和需和需Mg2+的的CK、5NT、ALP等，

19、酸酶活性測(cè)定都等，酸酶活性測(cè)定都用血清。用血清。 3. 樣品存放時(shí)間樣品存放時(shí)間，各種血清酶穩(wěn)定性不，各種血清酶穩(wěn)定性不同，如同，如ACP、CK在室溫下迅速失活，在室溫下迅速失活，AMS、GGT則很穩(wěn)定。則很穩(wěn)定。二、測(cè)定條件的影響二、測(cè)定條件的影響 1. 溫度溫度 溫度對(duì)酶活性的影響包括兩溫度對(duì)酶活性的影響包括兩個(gè)方面，一方面是溫度升高，反應(yīng)速度加個(gè)方面，一方面是溫度升高，反應(yīng)速度加快。另外一方面溫度升高，會(huì)發(fā)生熱變性，快。另外一方面溫度升高，會(huì)發(fā)生熱變性，使酶活性降低。使酶活性降低。 （1）溫度的選擇）溫度的選擇 37反應(yīng)速度快，單位反應(yīng)速度快，單位時(shí)間反應(yīng)物質(zhì)變化量大，測(cè)定靈敏度增加，保時(shí)間反應(yīng)物質(zhì)變化量大，測(cè)定靈敏度增加，保溫時(shí)間短，溫時(shí)間短，25、30可使單位時(shí)間的散熱較可使單位時(shí)間的散熱較少，溫度便于恒定，很多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的物理化學(xué)少，溫度便于恒定，很多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的物理化學(xué)較難定在較難定在30進(jìn)行，進(jìn)行，IFCC建議建議30作為參考作為參考方法的標(biāo)準(zhǔn)溫度。方法的標(biāo)準(zhǔn)溫度。 （2）溫度系數(shù)）溫度系數(shù) 將溫度每升高將溫度每升高10后反應(yīng)后反應(yīng)速度相當(dāng)于原來的倍數(shù)，稱為溫度系數(shù)速度相當(dāng)于原來的倍數(shù)，稱為溫度系數(shù)(Q10)。Q10表示溫度對(duì)反應(yīng)速度影響的大小