JC病毒蛋白VP3原核表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

1、JC病毒蛋白VP3原核表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá) 作者：李小權(quán)，毛羽，鄭鐵龍，成軍，張樹林，王琦，李興旺【摘要】 目的 構(gòu)建JC病毒蛋白VP3原核表達(dá)載體，并觀察其表達(dá)情況。方法 通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)獲得VP3基因，將其連接到pGEMT載體，測(cè)序正確后插入至原核表達(dá)載體pET32a(+)中，轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)，并通過十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)、Western blot免疫印跡分析鑒定融合蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 擴(kuò)增獲得VP3基因片段，成功構(gòu)建了大腸桿菌原核表達(dá)JC病毒VP3載體。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，得到了分子質(zhì)量為59ku的目的蛋白，Western bl

2、ot證實(shí)其具有良好的抗原性。結(jié)論 本研究成功表達(dá)了VP3蛋白，對(duì)于研究VP3蛋白的免疫原性和生物學(xué)特性奠定了的基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】 JC病毒；VP3蛋白；原核表達(dá) ABSTRACT: Objective To construct proeukaryotic expressive vector of VP3 gene of JC virus, and observe the expression of recombinant protein. Methods The DNA fragment of vp3 was amplified by polymerase chain reaction (PC

3、R), and cloned into pGEMT vector. After sequencing, the correct DNA fragment was inserted into inducible proeukaryotic expressive vector pET2 / 1332a(+) and transformed into E.coli BL21. The protein was induced with IPTG and analyzed with sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis and W

4、estern blot hybridization. Results The DNA fragment of vp3 was amplified by PCR. The expressive vector was constructed successfully. After induction with IPTG, recombinant target protein with Mr 59ku was expressed. Western blot analysis showed that the protein had good antigenicity. Conclusion The r

5、ecombinant vp3 gene was expressed successfully. These results lay the foundation for studying the immunogenicity and bionomics of VP3 protein. KEY WORDS: JC virus; VP3 protein; prokaryotic expression JC病毒屬人類多瘤病毒，是一種機(jī)會(huì)感染性病原，在正常人群中其血清學(xué)陽性率高達(dá)80%。1971年P(guān)ADGETT等1首先在人類的一種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞脫髓鞘病變(進(jìn)行性多灶性腦白質(zhì)病，progressive m

6、ultifocal lukoenphalapathy, PML)患者的病灶中發(fā)現(xiàn)并分離出JC病毒，該病毒具有明顯的嗜神經(jīng)性特點(diǎn),有致瘤性，而且與某些類型的腦瘤有關(guān)。目前普遍認(rèn)為，兒童期的JC病毒的感染率可能高達(dá)65%，因?yàn)槎酂o明顯的癥狀，故不會(huì)引起人們的注意2。JC病毒具體的傳播途徑目前尚不清楚。大多數(shù)研究認(rèn)為該病是經(jīng)糞口途徑傳播的3，但是也有人認(rèn)為其是母嬰傳播4。雖然多數(shù)人可能從幼年已經(jīng)開始感染該病原，但是只有免疫嚴(yán)重缺陷的患者發(fā)病，尤其是細(xì)胞免疫缺陷的患者2。研究發(fā)現(xiàn)，JC病毒編碼包括VP3在內(nèi)的有6種蛋白，但其功能尚不清楚5。為了進(jìn)一步研究JC病毒的生物學(xué)功能，我們構(gòu)建了JC病毒的VP3

7、原核表達(dá)載體，觀察重組VP3蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)。 1 材料與方法 1.1 材料 1.1.1 材料 菌株、載體、大腸桿菌DH5、大腸埃希菌BL21及原核表達(dá)載體pET32a(+)為本室保存；擴(kuò)增JC病毒VP3基因的材料人免疫缺陷病毒(HIV)感染者的腦脊液從本院獲?。籶GEMT載體購于Promega公司。 1.1.2 主要試劑 Taq酶購于鼎國生物公司；丙烯酰胺、N，N亞甲雙丙烯酰胺、T4 DNA連接酶、IPTG購于Promega公司；玻璃奶回收試劑盒購自博大泰克公司；BamH、Aval購自TaKaRa(大連)公司；抗His單克隆抗體購自Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG購自北

8、京中杉金橋生物公司；化學(xué)發(fā)光底物購自Pierce公司；PVDF膜購自Millipore公司；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純和生化試劑。引物合成及DNA測(cè)序由Invitrogen公司完成。 1.2 方法 1.2.1 VP3基因的擴(kuò)增 根據(jù)VP3基因序列，在編碼區(qū)的上游和下游設(shè)計(jì)合成一對(duì)寡聚核苷酸引物(P1：5CGGGATCCATGGCTTTACAATTATTTAATC3； P2：5CCGCTCGAGACTTCTAGAACTTCTACTCC TC3)，引物兩端分別引入BamH和Aval酶切位點(diǎn)。以HIV患者來源的腦脊液為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得VP3全長序列。反應(yīng)條件：95 5min，94 45s、58

9、 45s、72 45s35循環(huán)，72延伸7min，4。10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增結(jié)果，切膠玻璃奶法純化回收。 1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)VP3的構(gòu)建 將純化回收的目的基因片段與pGEMT載體16條件下T4 DNA連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞，鋪于含有氨芐青霉素的LB的平板上37孵育16h。挑取白色菌落行菌落PCR，堿裂解法提取陽性克隆質(zhì)粒并進(jìn)行BamH/Aval雙酶切鑒定，證明目的基因片段已插入pGEMT載體中后，送生物公司測(cè)序。測(cè)序顯示正確后用BamH/Aval從pGEMT克隆質(zhì)粒上酶切目的基因片段，10g/L瓊脂糖凝膠電泳純化回收，與經(jīng)BamH/Av

10、al酶切的pET32a(+)表達(dá)質(zhì)粒連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株大腸埃希菌BL21，平板于37孵育過夜后進(jìn)行菌落PCR，陽性菌落擴(kuò)增菌搖菌提質(zhì)粒并用BamH/Aval雙酶切質(zhì)粒鑒定。 1.2.3 VP3重組蛋白的表達(dá) 挑取單個(gè)新鮮陽性克隆及pET32a(+)空載體克隆接種于含有羧芐青霉素(終質(zhì)量濃度為100mg/L)的LB培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)過夜。按1100擴(kuò)大、37培養(yǎng)至菌吸光度為A600=0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)2.5、3.5、4.5h，取3mL離心集菌，100L 1mol/L TrisCl(pH 6.8)重懸細(xì)菌沉淀，加入100L 2×SDS凝膠加樣

11、緩沖液及5L 巰基乙醇，煮沸10min，1000g高速離心5min后取20L進(jìn)行SDSPAGE電泳分析。 1.2.4 VP3重組蛋白的抗原性檢測(cè)Western blot分析 將經(jīng)過SDSPAGE分析的聚丙烯酰胺凝膠切下帶有pET32a(+)VP3誘導(dǎo)菌株和帶有空pET32a(+)載體的誘導(dǎo)菌株泳道的凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)移電泳。50g/L脂奶粉4封閉過夜，用1200稀釋的His抗體作為第一結(jié)合抗體反應(yīng)4h；再用12500稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG孵育1h；加入顯色液，X光片曝光。 2期2李小權(quán)，毛 羽，鄭鐵龍，等. JC病毒蛋白VP3原核表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá) 2 結(jié) 果 2.1 VP3基因的PCR擴(kuò)

12、增 PCR擴(kuò)增VP3基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析顯示擴(kuò)增的基因片段大小與預(yù)期相同，且無非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象(圖1)。 2.2 pET32a(+)/VP3重組質(zhì)粒的構(gòu)建 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后連接pGEMT載體，經(jīng)測(cè)序及BamH/Aval雙酶切鑒定正確后，插入表達(dá)載體pET32a(+)相應(yīng)酶切位點(diǎn)上，經(jīng)轉(zhuǎn)化、提質(zhì)粒后BamH/Aval行雙酶切鑒定，結(jié)果表明重組表達(dá)載體pET32a(+)VP3構(gòu)建成功(圖2、圖3)。 2.3 VP3重組蛋白的表達(dá)和Western blot免疫印跡分析 將經(jīng)過誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21，進(jìn)行SDSPAGE和Western免疫印跡分析。結(jié)果顯示，經(jīng)過誘導(dǎo)

13、的大腸桿菌BL21Western免疫印跡分析可見明顯條帶且無雜帶(圖4、圖5)。 3 討 論 JC病毒屬人類多瘤病毒，與人類多種腫瘤的發(fā)生以及PML病密切相關(guān)。隨著免疫抑制患者的增多，探討JC病毒的致病機(jī)理就顯得尤為重要。 將克隆化基因插入合適載體后導(dǎo)入大腸桿菌用于表達(dá)大量蛋白質(zhì)的方法，一般稱為原核表達(dá)6。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應(yīng)用。作為研究最為詳盡的原核細(xì)菌，大腸桿菌用于重組蛋白的表達(dá)具有易于生長和控制的特點(diǎn)，用于細(xì)菌培養(yǎng)的材料便宜，而且有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質(zhì)?？晒┻x擇。本研究中采用的原核表達(dá)載體pET32a(+)，含有T7啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止信

14、號(hào)，除了能夠編碼6個(gè)組氨酸殘基外，還帶有大腸桿菌TrxA基因。外源基因經(jīng)多克隆位點(diǎn)插入后與TrxA及His標(biāo)簽一起融合表達(dá)，不僅提高了表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性，而且由于分子質(zhì)量增大，經(jīng)SDSPAGE分析時(shí)更容易鑒定。尤其重要的一點(diǎn)是，載體上帶有的His標(biāo)簽可以使重組蛋白與Ni柱螯合，利于大量表達(dá)后的親和層析。 VP3是JC病毒編碼的6個(gè)蛋白中的一個(gè)重要的包膜蛋白，全長678bp，編碼225個(gè)氨基酸序列，在病毒的裝配、傳播及與細(xì)胞的相互作用中有著多種生物學(xué)功能。通過定點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)，VP3突變株比野生株的傳播能力明顯降低，VP3缺乏會(huì)導(dǎo)致病毒不能正確地裝備和細(xì)胞定位78。因此，要研究JC病毒，VP3蛋白的研

15、究就顯的極其重要。 在本實(shí)驗(yàn)中，我們著眼于VP3原核表達(dá)系統(tǒng)的建立，成功地從人類免疫缺陷疾病患者腦脊液中克隆了VP3基因，構(gòu)建了pET32a(+)/VP3原核表達(dá)載體，并在大腸埃希菌BL21中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)下獲得高效表達(dá)。隨后分別以His單克隆抗體與羊抗鼠HRPIgG為一抗和二抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)，驗(yàn)證了其正確性。制備目的蛋白的多克隆或單克隆抗體是深入探索基因功能的重要前提。本研究是進(jìn)一步研究VP3生物學(xué)意義的前提和基礎(chǔ)，今后我們將制備VP3抗體，為研究其臨床意義提供有效手段。【參考文獻(xiàn)】 1CO JK, VERMA S, GURJAV U, et al. Interferon

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17、al peptide with limited homology to myelin basic protein J. Exp Neurol, 2007, 206(2):231239.3BROFILLMAS S, CLEMENTECASARES P, MAJOR EO, et al. Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission J. J Neurovirol, 2003, 9:498507.4KUNITAKE T, KITAMURA T, GUO J, et al. Parent

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