核酸化學(xué)-ppt課件

1、第四章核酸化學(xué)第一節(jié)第一節(jié) 概述概述第二節(jié)第二節(jié) 核酸的化學(xué)組成核酸的化學(xué)組成第三節(jié)第三節(jié) 核酸的分子結(jié)構(gòu)核酸的分子結(jié)構(gòu)第四節(jié)第四節(jié) 核酸的性質(zhì)核酸的性質(zhì)第五節(jié)第五節(jié) 核酸的研究方法核酸的研究方法本章內(nèi)容本章內(nèi)容第一節(jié)概第一節(jié)概 述述 核酸nucleic acidNA是一類重要的生物大分子，擔(dān)負著生命信息的儲存與傳遞。 核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域，是基因工程操作的核心分子。1868 F. Miescher從膿細胞的細胞核中分離出了一從膿細胞的細胞核中分離出了一 種種含磷酸的有機物，當(dāng)時稱為核素含磷酸的有機物，當(dāng)時稱為核素nuclein）,后稱為核后稱為核酸酸nucleic a

2、cid）。）。1944 Avery 等通過肺炎球菌轉(zhuǎn)化試驗證明等通過肺炎球菌轉(zhuǎn)化試驗證明DNA是遺是遺傳物質(zhì)。傳物質(zhì)。1952 Hershey, Chase-噬菌體標記實驗。噬菌體標記實驗。1953 Watson和和Crick提出提出DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型。結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型。1958 Crick提出遺傳信息傳遞的中心法則。提出遺傳信息傳遞的中心法則。1973 Boyer，Cohen-DNA Cloning(克隆）。克?。?976 DNA Sequencing(序列分析）。序列分析）。1990 Human Genome Project人類基因組計劃）。人類基因組計劃）。一、核酸的研究歷史光滑型

3、細胞光滑型細胞有毒）有毒）粗糙型細胞粗糙型細胞無毒）無毒）破碎細胞破碎細胞DNAase降降解后的解后的DNA粗糙型細胞接粗糙型細胞接受光滑型受光滑型DNA只有粗糙型只有粗糙型大多數(shù)仍大多數(shù)仍為粗糙型為粗糙型少數(shù)光滑型少數(shù)光滑型細胞被轉(zhuǎn)化細胞被轉(zhuǎn)化SSRRR+DNA1944年年Avery細菌轉(zhuǎn)化實驗細菌轉(zhuǎn)化實驗肺炎球菌pneumococcus） 1928年細菌學(xué)家Griffith 細菌毒性實驗 噬菌體感染實驗 1952年美國Hershey 噬菌體感染實驗 真核生物真核生物 原核生物原核生物 細胞核細胞核98%98%） 擬核擬核 線粒體線粒體mDNA mDNA （少量）（少量） 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADN

4、Aplasmidplasmid） 葉綠體葉綠體ctDNA ctDNA （少量等（少量等 病毒病毒DNADNA 細胞質(zhì)細胞質(zhì)90%90%） 細胞質(zhì)細胞質(zhì) 核仁少量）核仁少量） 病毒病毒RNARNA 二、核酸的種類和分布二、核酸的種類和分布注：生物細胞都含有注：生物細胞都含有DNA DNA 和和 RNA RNA； 病毒中只含病毒中只含 DNA DNA 或或 只含只含 RNA RNA。第二節(jié)核酸的化學(xué)組成第二節(jié)核酸的化學(xué)組成 核酸是由幾十個甚至幾千萬個核苷酸核酸是由幾十個甚至幾千萬個核苷酸聚合而成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的生物聚合而成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的生物大分子。大分子。 基本元素：基本元素：C、H、O

5、、N、P ；其中其中P 的含量比較穩(wěn)定，占的含量比較穩(wěn)定，占9%-10%，通過測，通過測定定P 的含量來推算核酸的含量定磷法）。的含量來推算核酸的含量定磷法）。磷酸磷酸 核苷核苷 堿基堿基 戊糖戊糖 核酸核酸核苷酸核苷酸 一、戊糖一、戊糖 組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為-D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為-D-核糖。OHHOHHOHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHHOHHD-核糖D-2-脫氧核糖二、堿基二、堿基1. 嘌呤嘌呤Purine） 腺嘌呤腺嘌呤Adenine 鳥嘌呤鳥嘌呤guanine2. 嘧啶嘧啶Pyrimidine）胸腺嘧胸腺嘧啶啶胞嘧啶胞嘧啶尿嘧啶尿嘧啶 核酸中也

6、存在一些不常見的稀有堿基。稀有堿核酸中也存在一些不常見的稀有堿基。稀有堿基的種類很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物?；姆N類很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。NNNNNHCH3dRN6- M e t h y l- d ANNCH3NH25 - M e t h y l- d COdR二氫尿嘧啶二氫尿嘧啶 （DHU）修飾堿基的簡寫符號修飾堿基的簡寫符號 m N22取代位置核苷取代基的數(shù)目取代基( 為為1時可以不寫時可以不寫 )核苷：戊糖核苷：戊糖+ +堿基堿基 糖與堿基之間的糖與堿基之間的C-NC-N鍵，稱為鍵，稱為C-NC-N糖苷鍵糖苷鍵核苷中戊糖與堿基的連接方式：核苷中戊糖與堿基的連接方式：

7、(OH)(OH)修飾核苷修飾核苷/稀有核苷稀有核苷修飾核苷包括三種情況修飾核苷包括三種情況: （1由修飾堿基和糖組成的核苷由修飾堿基和糖組成的核苷 （2由非修飾堿基和由非修飾堿基和2-O-甲基核糖組成的核苷甲基核糖組成的核苷 （3由堿基與糖連接方式特殊的核苷由堿基與糖連接方式特殊的核苷 NNNNNHCH3dRN6-Methyl-dA（1）HNNHO5,6-dihydrouridineORHHH(D or hU)（2）OCH2HHOHHOCH3HHO2-O-甲 基 腺 苷Ade(Am)NNCH3NH25-Methyl-dCOdR二氫尿嘧啶核苷二氫尿嘧啶核苷 (Am)（3）OCH2HHOHHOHH

8、HO (pseudouridine)HNNHOO51假 尿 嘧 啶 核 苷()取代基用下列小寫英文字母表示取代基用下列小寫英文字母表示 :甲基甲基m 乙?；阴；鵤c 氨基氨基n 甲硫基甲硫基ms 羥基羥基o或或h 硫基硫基s 異戊烯基異戊烯基i 羧基羧基c 例：例：HNNORSHNNOROCH2OHs4 Uom5 U或hm5 U四、核苷酸四、核苷酸nucleotide） 核苷酸：核苷酸： 核苷核苷+磷酸磷酸 戊糖戊糖+堿基堿基+磷酸磷酸H五、游離核苷酸及其衍生物的形式五、游離核苷酸及其衍生物的形式1. 繼續(xù)磷酸化2.2.環(huán)化磷酸化環(huán)化磷酸化 cAMP cGMP3.3.輔酶輔酶 NAD NAD

9、、NADPNADP、FADFAD、HSCoAHSCoAFADNAD、NADPHSCoA4. GDP-4. GDP-半乳糖、半乳糖、GDP-GDP-葡萄糖等是糖蛋白葡萄糖等是糖蛋白 生物合成和多糖生物合成的活性糖生物合成和多糖生物合成的活性糖 基供體?；w。 第三節(jié)第三節(jié) 核酸的分子結(jié)構(gòu)核酸的分子結(jié)構(gòu) 一、一、DNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu): DNA核苷酸鏈中脫氧核苷核苷酸鏈中脫氧核苷 酸的組成和排列順序。酸的組成和排列順序。二級結(jié)構(gòu)：二級結(jié)構(gòu)：DNA的兩條多聚鏈間通過的兩條多聚鏈間通過 氫鍵形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。氫鍵形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。三級結(jié)構(gòu)：三級結(jié)構(gòu)：DNA雙鏈進一步折疊卷曲雙鏈進一步折疊

10、卷曲 形成的構(gòu)象。形成的構(gòu)象。（一（一DNADNA的一級結(jié)構(gòu)的一級結(jié)構(gòu) 由dAMP、dGMP、 dCMP、 dTMP核苷酸單體通過3,5-磷酸二酯鍵相連而成的鏈狀聚合物。5533結(jié)構(gòu)式結(jié)構(gòu)式l 5-5-磷酸端常用磷酸端常用5-P5-P表示）；表示）；3-3-羥基端常羥基端常用用3 -OH3 -OH表示）表示）l 核苷酸鏈具有方向性，當(dāng)核苷酸鏈具有方向性，當(dāng)表示一個核苷酸鏈時，必表示一個核苷酸鏈時，必須注明它的方向是須注明它的方向是5353或是或是3535。字母式字母式5PAPCPGPCPTPGPTPAOH 3 5 PACGCTGTAOH 3線條式線條式PP5335PP53P53ACGTOHDN

11、A的一級結(jié)構(gòu)也可指的一級結(jié)構(gòu)也可指DNA分子中堿基的順序。分子中堿基的順序。DNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲的分子形的堿基順序本身就是遺傳信息存儲的分子形式。生物界物種的多樣性即寓于式。生物界物種的多樣性即寓于DNA分子中四種分子中四種核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合之中。核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合之中。（二（二DNADNA的二級結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu)qWatson Watson 和和 Crick Crick 于于19531953年提出年提出了了DNA DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，說明了雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，說明了DNA DNA 的二級結(jié)構(gòu)。（即的二級結(jié)構(gòu)。（即B B型型DNADNA）（1 1Chargaff

12、Chargaff定則定則 （1950s,E. Chargaff1950s,E. Chargaff發(fā)現(xiàn)）發(fā)現(xiàn)）DNADNA堿基組成符合：堿基組成符合： A=T A=T；G=CG=C； A+G=T+C A+G=T+C。不對稱比率：不對稱比率：A+T/G+CA+T/G+C； 物種不同，物種不同，DNADNA堿基組成不同；堿基組成不同； 物種親緣愈接近，堿基組成也愈接近，物種親緣愈接近，堿基組成也愈接近，該比該比 率越相近似。率越相近似。.具有種的特異性，沒有器官和組織的特具有種的特異性，沒有器官和組織的特異性，年齡、營養(yǎng)狀況、環(huán)境的改變不影響異性，年齡、營養(yǎng)狀況、環(huán)境的改變不影響DNADNA的堿基組

13、成。的堿基組成。1提出提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的根據(jù)雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的根據(jù) （2x-光衍射分析 20世紀40年代Astbury 1952年M.Wilkins 2DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型雙螺旋結(jié)構(gòu)模型double-helical structure） 1953年年Watson和和Crick提出了提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。雙螺旋結(jié)構(gòu)。 DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點1 1）q螺旋中的兩條鏈反向平行，即其中一條鏈的方向為53，而另一條鏈的方向為35，兩條鏈共同圍繞一個假想的中心軸呈右手雙螺旋結(jié)構(gòu)。 DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點2 2）q疏水的堿基位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，親水的

14、磷酸和脫氧核糖基位于螺旋外側(cè)。堿基平面與螺旋軸垂直，脫氧核糖平面與中心軸平行。q由于幾何形狀的限制，堿基對只能由嘌呤和嘧啶配對，即A與T，G與C。這種配對關(guān)系，稱為堿基互補。A和T之間形成兩個氫鍵， G與C之間形成三個氫鍵。T-A堿基對堿基對C-G堿基對堿基對DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點3 3）q由于堿基對排列的方向性，使得堿基對占據(jù)的空間是不對稱的，因而，在雙螺旋的表面形成大小兩個凹槽，分別稱為大溝和小溝，二者交替出現(xiàn)。2.0 nm小小溝溝大大溝溝DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點4 4）q雙螺旋橫截面的直徑雙螺旋橫截面的直徑約為約為2 nm2 nm，相鄰兩

15、個，相鄰兩個堿基平面之間的距離堿基平面之間的距離軸距為軸距為0.34 nm0.34 nm，每每1010個核苷酸形成一個核苷酸形成一個螺旋，其螺距即個螺旋，其螺距即螺旋旋轉(zhuǎn)一圈的高螺旋旋轉(zhuǎn)一圈的高度為度為3.4 nm3.4 nm。2.0 nm小小溝溝大大溝溝DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點5 5）q兩條鏈借堿基之間的氫鍵和堿基堆積力即堿基之間的范德華力牢固的連接起來，維持DNA雙螺旋的三維結(jié)構(gòu)。q兩條鏈是堿基互補關(guān)系。3. DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定因素 氫鍵氫鍵 堿基堆積力堿基堆積力 磷酸基上負電荷被胞內(nèi)磷酸基上負電荷被胞內(nèi)組蛋白或正離子中和組蛋白或正離子中和 堿基處于疏水環(huán)境中堿

16、基處于疏水環(huán)境中4. DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的意義 該模型揭示了該模型揭示了DNA作為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性作為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性特征，最有價值的是確認了堿基配對原則，這特征，最有價值的是確認了堿基配對原則，這是是DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)，亦是復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)，亦是遺傳信息傳遞和表達的分子基礎(chǔ)。該模型的提遺傳信息傳遞和表達的分子基礎(chǔ)。該模型的提出是上個世紀生命科學(xué)的重大突破之一，它奠出是上個世紀生命科學(xué)的重大突破之一，它奠定了生物化學(xué)和分子生物學(xué)乃至整個生命科學(xué)定了生物化學(xué)和分子生物學(xué)乃至整個生命科學(xué)飛速發(fā)展的基石。飛速發(fā)展的基石。DNA雙螺旋構(gòu)象的類型（三（三DNADNA的三級結(jié)構(gòu)

17、的三級結(jié)構(gòu)-超螺旋超螺旋1超螺旋是指雙螺旋進一步扭曲或再螺旋的構(gòu)象。2正超螺旋變緊，過旋和負超螺旋變松，欠旋）。3人類46條染色體的DNA總長可達1.7m，經(jīng)過螺旋化壓縮，實際總長只有200nm。負超螺旋負超螺旋核小體盤繞及染色質(zhì)示意圖DNADNA的存在形式的存在形式-核小體核小體真核生物中DNA雙螺旋沿著組蛋白八聚體核心的短軸繞1.75圈，形成左手超螺旋，稱核小體。染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位是核小體。串珠狀結(jié)構(gòu)進一步卷曲形成螺線管，后者再進一步卷曲形成超螺旋管，形成染色單體?；蚝突蚪M基因和基因組1)基因即一段有功能的基因即一段有功能的DNA片段，生物片段，生物細胞中細胞中DNA分子的最小功能單

18、位交分子的最小功能單位交換單位）。換單位）。2)一個細胞或生物體所含的全套基因稱一個細胞或生物體所含的全套基因稱基因組。基因組。二、二、RNA的分子結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu)（一） RNA的分類及特點（二） RNA分子的結(jié)構(gòu)特點 （一（一RNARNA的特點及分類的特點及分類結(jié)構(gòu)特點：結(jié)構(gòu)特點：1. 堿基組成：堿基組成：A、G、C、U （AU/GC）；）；2. 稀有堿基較多，穩(wěn)定性較差，易水解；稀有堿基較多，穩(wěn)定性較差，易水解；3. 多為單鏈結(jié)構(gòu)，少數(shù)局部形成螺旋發(fā)夾結(jié)構(gòu)）；多為單鏈結(jié)構(gòu)，少數(shù)局部形成螺旋發(fā)夾結(jié)構(gòu)）；4. 分子較小。分子較小。分類：分類：1. 信使信使RNA（ mRNA）2. 轉(zhuǎn)運轉(zhuǎn)運RNA

19、 （ tRNA）3. 核糖體核糖體RNA （r RNA） Messenger RNA Messenger RNA約占總約占總RNARNA的的3%-5%3%-5%，含量最少，種類，含量最少，種類最多。最多。成熟成熟mRNAmRNA不含內(nèi)含子，不含內(nèi)含子，hnRNAhnRNA含有。含有。mRNAmRNA從從DNADNA轉(zhuǎn)錄遺傳信息，并作為蛋轉(zhuǎn)錄遺傳信息，并作為蛋白質(zhì)合成的模板，決定蛋白質(zhì)的氨基白質(zhì)合成的模板，決定蛋白質(zhì)的氨基酸順序。酸順序。Ribosome RNA Ribosome RNA 1)1) 約占全部約占全部RNARNA的的80%80%，含量最多。，含量最多。2)2) 與多種蛋白質(zhì)結(jié)合成核

20、糖體，后與多種蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖體，后者是合成蛋白質(zhì)的場所。者是合成蛋白質(zhì)的場所。原核生物原核生物真核生物真核生物核糖體核糖體rRNArRNA核糖體核糖體rRNArRNA 30s30s70s70s 50s50s16s16s5s 5s 、23s23s 40s 40s 80s80s 50s 50s 18s18s5s5s、5.8s5.8s、28s28sTransfer RNATransfer RNA1)1) 約占總約占總RNARNA的的10-15%10-15%，分子最小。，分子最小。2)2) 它在蛋白質(zhì)生物合成中起翻譯它在蛋白質(zhì)生物合成中起翻譯mRNAmRNA信息，并將相應(yīng)的氨基酸轉(zhuǎn)運到核信息，并將相

21、應(yīng)的氨基酸轉(zhuǎn)運到核糖體，參與蛋白質(zhì)體的合成。糖體，參與蛋白質(zhì)體的合成。3)3) 已知每一個氨基酸至少有一個相應(yīng)已知每一個氨基酸至少有一個相應(yīng)的的tRNAtRNA。（二RNA分子的結(jié)構(gòu)特點1) tRNA 的結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)特征：二級結(jié)構(gòu)特征： 單鏈單鏈 三葉草葉形三葉草葉形 四臂四環(huán)四臂四環(huán)三級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu) 特征：特征： 在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進一步折疊扭曲形成倒進一步折疊扭曲形成倒L型型酵母tRNA Ala 的二級結(jié)構(gòu)DHU環(huán)環(huán)IGC反密碼子反密碼子反密碼環(huán)反密碼環(huán)氨基酸臂氨基酸臂可變環(huán)可變環(huán)TC環(huán)環(huán)CCAAla3 5 2） rRNA的分子結(jié)構(gòu)特征：特征： 單鏈，螺旋化程度較單鏈，螺旋化

22、程度較tRNA低低 與蛋白質(zhì)組成核糖體后方能發(fā)揮其功能與蛋白質(zhì)組成核糖體后方能發(fā)揮其功能5SRNA5SRNA的二級結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu) 3mRNA的分子結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)錄一章講授在轉(zhuǎn)錄一章講授第四節(jié)第四節(jié) 核酸的性質(zhì)核酸的性質(zhì)一、一般物理性質(zhì)一、一般物理性質(zhì)二、核酸的水解二、核酸的水解三、兩性解離三、兩性解離四、紫外吸收性質(zhì)四、紫外吸收性質(zhì)五、穩(wěn)定性五、穩(wěn)定性六、變性六、變性七、復(fù)性與雜交七、復(fù)性與雜交一、一般物理性質(zhì)一、一般物理性質(zhì)1. DNA白色纖維狀固體，白色纖維狀固體，RNA白色粉末狀固白色粉末狀固體，都微溶于水，不溶于乙醇，因此常用乙醇來體，都微溶于水，不溶于乙醇，因此常用乙醇來沉淀沉淀DNA ；

23、 DNA溶液黏度大于溶液黏度大于RNA 。2. DNA難溶于難溶于0.14mol/L的的NaCl溶液，可溶于溶液，可溶于 12 mol/L的的NaCl溶液，溶液，RNA則相反，可據(jù)此則相反，可據(jù)此分離二者。分離二者。3. 加熱條件下，加熱條件下， D核糖濃鹽酸苔黑酚核糖濃鹽酸苔黑酚 綠色綠色 D2脫氧核糖酸二苯胺脫氧核糖酸二苯胺 藍紫色藍紫色二、核酸的水解二、核酸的水解核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸或核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸或堿性條件下水解切斷。堿性條件下水解切斷。DNADNA和和RNARNA對酸或堿的耐受程度有很對酸或堿的耐受程度有很大差別。室溫條件下，大差別。室溫條件下，DNADNA在堿

24、中在堿中變性，但不水解，變性，但不水解，RNARNA水解。水解。在細胞內(nèi)核酸分子受在細胞內(nèi)核酸分子受DNADNA酶作用。酶作用。三、兩性解離三、兩性解離核酸含酸性的磷酸基團，又含弱堿性核酸含酸性的磷酸基團，又含弱堿性的堿基，為兩性電解質(zhì)，可發(fā)生兩性的堿基，為兩性電解質(zhì)，可發(fā)生兩性解離；解離；核酸相當(dāng)于多元酸，核酸相當(dāng)于多元酸，pH大于大于4時，呈時，呈陰離子狀態(tài)；陰離子狀態(tài)；等電點等電點四、紫外吸收四、紫外吸收在核酸分子中嘌呤堿和嘧啶堿都含有在核酸分子中嘌呤堿和嘧啶堿都含有共軛雙鍵體系，在共軛雙鍵體系，在260 nm260 nm有吸收；有吸收；可以作為區(qū)別蛋白質(zhì)和對核酸及其組可以作為區(qū)別蛋白質(zhì)

25、和對核酸及其組份定性和定量測定的依據(jù)，進行核酸份定性和定量測定的依據(jù)，進行核酸純度鑒定，也可作為核酸變性和復(fù)性純度鑒定，也可作為核酸變性和復(fù)性的指標。的指標。DNA的紫外吸收光譜天然天然DNA變性變性DNA核苷酸總吸收值核苷酸總吸收值1232202402602800.10.20.30.4波長波長nmnm）光光吸吸收收123根據(jù)根據(jù)A260/A280的比值判斷核酸樣品的純度的比值判斷核酸樣品的純度純純DNA：A260/A280=1.8 純純RNA：A260/A280=2.0（若樣品中含有雜蛋白或苯酚，則（若樣品中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低）比值明顯降低）純的核酸樣品可根據(jù)

26、純的核酸樣品可根據(jù)260nm的光吸收值算出其含量的光吸收值算出其含量若若260nm光吸收值為光吸收值為1相當(dāng)于相當(dāng)于50g/ml雙螺旋雙螺旋DNA或相當(dāng)于或相當(dāng)于40g/ml單鏈單鏈DNA或或RNA或相當(dāng)于或相當(dāng)于20g/ml寡核苷酸。寡核苷酸。五、五、DNADNA的穩(wěn)定性的穩(wěn)定性1.DNA1.DNA的溶液呈粘稠狀，但實際上的溶液呈粘稠狀，但實際上DNADNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)僵直而有剛性，易斷成的雙螺旋結(jié)構(gòu)僵直而有剛性，易斷成碎片，這也是目前難以獲得完整大分碎片，這也是目前難以獲得完整大分子子DNADNA的原因。的原因。2.2.溶液狀態(tài)的溶液狀態(tài)的DNADNA易受易受DNADNA酶作用而降酶作用而

27、降解，抽干水分的解，抽干水分的DNADNA性質(zhì)十分穩(wěn)定。性質(zhì)十分穩(wěn)定。六、六、DNA的變性的變性1. 概念概念2. 變性條件變性條件3. 變性的特征變性的特征1. 概念概念是指核酸雙螺旋區(qū)的多聚核苷酸鏈間是指核酸雙螺旋區(qū)的多聚核苷酸鏈間的氫鍵斷裂，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。的氫鍵斷裂，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。2.DNA2.DNA的變性的條件的變性的條件能夠引起核酸變性的因素有：能夠引起核酸變性的因素有：1溫度升高；溫度升高；2酸堿度改變、酸堿度改變、 pH（11.3或或5.0）；）；3有機溶劑如甲醛和尿素、甲酰胺等；有機溶劑如甲醛和尿素、甲酰胺等；4低離子強度。低離子強度。3.DNA3.DNA變性的特征

28、變性的特征1)變性核酸將失去其部分或全部的生物變性核酸將失去其部分或全部的生物活性?；钚?。2)變性改變了變性改變了DNA的二級結(jié)構(gòu)。核酸的的二級結(jié)構(gòu)。核酸的變性并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，所變性并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，所以它的一級結(jié)構(gòu)以它的一級結(jié)構(gòu)(堿基順序堿基順序)保持不變。保持不變。3)DNA的變性過程是突變性的，它在很的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。 DNA解鏈溫解鏈溫度度4)紫外吸收值明顯增加，即增色效應(yīng)。紫外吸收值明顯增加，即增色效應(yīng)。5)粘度降低，沉降系數(shù)增加。粘度降低，沉降系數(shù)增加。DNADNA解鏈溫度熔點，解鏈溫度熔點，Tm Tm ）1)1)

29、 當(dāng)當(dāng)50% 50% 的的DNADNA變性時的溫度稱為該變性時的溫度稱為該DNADNA的的解鏈溫度，即增色效應(yīng)達到一半時的溫解鏈溫度，即增色效應(yīng)達到一半時的溫度；一般度；一般DNADNA的的TmTm值在值在70-8570-85C C之間。之間。2)2) 均一均一DNADNA如病毒的如病毒的TmTm值范圍較小。值范圍較小。3)3) 分子中分子中G G和和C C的含量越高，越不易變性，的含量越高，越不易變性，TmTm值越高。可通過經(jīng)驗公式計算：值越高?？赏ㄟ^經(jīng)驗公式計算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44G+C)%=(Tm-69.3)X2.444)4) TmTm值隨溶液鹽濃度增加而增大，值

30、隨溶液鹽濃度增加而增大，5)5) Tm Tm值較低，易變性，不易保存。值較低，易變性，不易保存。溶解曲線與溶解曲線與TmTm。影響影響Tm值的因素值的因素 DNA的均一性的均一性 DNA中中G-C對的含量對的含量 經(jīng)驗式: (G-C)%=(Tm-69.3)2.44 鹽離子強度鹽離子強度 增色效應(yīng)與減色效應(yīng)增色效應(yīng)與減色效應(yīng) 天然天然DNADNA分子在熱變性條件下，雙螺分子在熱變性條件下，雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞，堿基暴露，在紫外光旋結(jié)構(gòu)破壞，堿基暴露，在紫外光260nm260nm波長處的吸收度明顯增加，此現(xiàn)象稱為波長處的吸收度明顯增加，此現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。增色效應(yīng)。 變性變性DNADNA分子復(fù)性形成雙螺

31、旋結(jié)構(gòu)時分子復(fù)性形成雙螺旋結(jié)構(gòu)時其紫外吸收降低的現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)。其紫外吸收降低的現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)。七、七、DNADNA的復(fù)性的復(fù)性概念概念復(fù)性的條件復(fù)性的條件3. 影響復(fù)性的因素影響復(fù)性的因素4. 復(fù)性動力學(xué)復(fù)性動力學(xué)5. 分子雜交分子雜交1. 1. 概念概念1.1.變性變性DNADNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，其物理性質(zhì)和生物活性隨之恢復(fù)，這一過其物理性質(zhì)和生物活性隨之恢復(fù)，這一過程稱為復(fù)性；程稱為復(fù)性；2.2.對于熱變性的對于熱變性的DNADNA，在緩慢冷卻的條件，在緩慢冷卻的條件下可重新結(jié)

32、合恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為退下可重新結(jié)合恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為退火?；稹?.DNA3.DNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)。但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)。DNA的復(fù)性圖示的復(fù)性圖示2.DNA2.DNA的復(fù)性條件的復(fù)性條件1.1.將熱變性的將熱變性的DNADNA驟然冷卻至低溫驟然冷卻至低溫時，時，DNADNA不可能復(fù)性。即淬火。不可能復(fù)性。即淬火。2.2.將變性的將變性的DNADNA緩慢冷卻時，可以復(fù)緩慢冷卻時，可以復(fù)性。退火溫度性。退火溫度TmTm25253.3.分子量越大復(fù)性越難。濃度越大，分子量越大復(fù)性越難。濃度越大，復(fù)性越容

33、易。此外，復(fù)性越容易。此外，DNADNA的復(fù)性需要的復(fù)性需要一定的鹽濃度，也與它本身的組成和一定的鹽濃度，也與它本身的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)。結(jié)構(gòu)有關(guān)。高于高于Tm值值5 復(fù)性 也稱退火 緩緩慢慢冷冷卻卻迅迅速速冷冷卻卻3. 影響復(fù)性的因素影響復(fù)性的因素 樣品的性質(zhì)樣品的性質(zhì) DNA的濃度的濃度 DNA片段的大小片段的大小 溫度溫度 離子強度離子強度 4.4.復(fù)性動力學(xué)復(fù)性動力學(xué) DNADNA的復(fù)性過程是一種雙分子反應(yīng)的復(fù)性過程是一種雙分子反應(yīng) DSSk S S：single strand DNA single strand DNA D D：double strand DNA double stran

34、d DNA 21CC0 Cot : 21時的時的Cot值，即指復(fù)性完成一半時的值，即指復(fù)性完成一半時的Cot值。值。 5.5.分子雜交分子雜交1.1.在變性的在變性的DNADNA溶液中加入外源溶液中加入外源DNADNA單鏈分子或單鏈分子或RNARNA單鏈分子與原單鏈分子與原DNADNA具有同源性），去掉變具有同源性），去掉變性條件后復(fù)性形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。性條件后復(fù)性形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。2.2.這樣形成的新分子稱為雜交這樣形成的新分子稱為雜交DNADNA分子。分子。3.3.利用核酸雜交可檢測特定的核苷酸片段或研利用核酸雜交可檢測特定的核苷酸片段或研究同源性等。究同源性等。分子雜交分子雜交 探針：用于雜交的異源DNA或RNA序列，其核苷酸序列是人工特定的、已知的，經(jīng)放射性標記的一條鏈。核酸的變性、復(fù)性和雜交變性加熱）變性加熱）探針探針雜交緩慢冷卻）雜交緩慢冷卻）復(fù)性緩慢冷卻）復(fù)性緩慢冷卻）分子雜交的種類分子雜交的種類1) Southern Blot：DNA-DNA雜交雜交2) Northern Blot：D