western blotting 原理及體會(huì)

1、Western blotting 全攻略 蛋白免疫印跡（western blotting）一般由凝膠電泳、樣品印記和免疫學(xué)檢測三個(gè)部分組成。第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測樣品中的蛋白按分子量大小在凝膠中分成條帶。第二部把凝膠中已分成條帶的蛋白轉(zhuǎn)移到一種固相支持物上，常用硝酸纖維素膜（NC膜）和PVDF膜，蛋白轉(zhuǎn)移的方法多用電泳轉(zhuǎn)移，它又分為半干法和濕法之分，先打多用濕法。第三部是用特異性的抗體檢測出已經(jīng)印跡在膜上的所需要研究的相應(yīng)抗原。免疫檢測的方法可以是直接的和間接的?，F(xiàn)在多用間接免疫酶標(biāo)法，在用特異性的第一抗體雜交結(jié)合后，再用酶標(biāo)的第二抗體（堿性磷酸酶AP）或辣根過氧化物酶（H

2、RP）標(biāo)記的第一抗體的抗體雜交結(jié)合，再加酶的底物顯色或者通過膜上的顏色或X光底片上曝光的條帶來顯示抗原的存在。一、 基本原理 第一部分：SDS-PAGE電泳1、蛋白中含有很多的氨基（+）和羧基（-），不同的蛋白在不同的PH值下表現(xiàn)出不同的電荷，為了是蛋白在電泳中的遷移率只與分子量有關(guān)，我們在上樣前，會(huì)進(jìn)行一些處理，即加入上樣緩沖液（loading buffer）。其中所含的SDS和-巰基乙醇可破壞蛋白分子間的二級三級結(jié)構(gòu)，斷開半胱氨酸殘疾之間的二硫鍵，再經(jīng)高溫處理后，使蛋白完全變性和結(jié)聚，形成棒狀結(jié)構(gòu)同時(shí)整個(gè)蛋白帶上負(fù)電荷；其所含的溴酚藍(lán)，用于監(jiān)控整個(gè)電泳過程；其所含的甘油或蔗糖增大溶液密度，

3、可加速聚沉樣品入凹槽底部。通電后被負(fù)電荷包裹的蛋白在凝膠中向正極移動(dòng)。樣品先通過高度多孔性的濃縮膠，使蛋白在分離膠表面聚集形成一條很薄的區(qū)帶。2、電泳啟動(dòng)后蛋白所帶的電荷數(shù)除以單位質(zhì)量是不同的，所以帶負(fù)電多者遷移快，反之則慢（電荷效應(yīng)）；而由于膠孔徑小，且成為一個(gè)整體的篩狀結(jié)構(gòu)，他們對大分子阻力大，小分子阻力?。ǚ肿雍Y效應(yīng)），最終達(dá)到彼此分開的目的。3、SDS-PAGE膠分離范圍：丙烯酰胺濃度（%）線性分離范圍（KD）15104312126010208083694557212第二部分：樣品的印跡（轉(zhuǎn)膜）膜的選擇：PVDF膜、NC膜、尼龍膜。我們常用PVDF膜，具有更好的蛋白吸附能力、物理強(qiáng)度以

4、及具有更好的化學(xué)兼容性。PVDF膜及濾紙預(yù)處理：轉(zhuǎn)膜前，先甲醇15s，雙蒸水2min，再轉(zhuǎn)膜液至少5min。濾紙轉(zhuǎn)膜前浸濕，趕出濾紙中氣泡即可。注：膜的處理是為了使膜上的部分集團(tuán)充分活化，更有利于蛋白吸附。轉(zhuǎn)膜緩沖液：現(xiàn)用現(xiàn)配，其pH為8.3，比大多數(shù)的蛋白等電點(diǎn)（pI）高，因此蛋白帶負(fù)電荷向陽極移動(dòng)，所以安裝夾層時(shí)，應(yīng)該在黑色夾子一面（陰性電極）依次放上泡沫、濾紙、凝膠、轉(zhuǎn)移膜、濾紙、泡沫。轉(zhuǎn)膜液中最好不要含有SDS，其會(huì)嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)印效果；如果蛋白分子量比較大，可以適當(dāng)加入一點(diǎn)，濃度在0.01%范圍內(nèi)。電泳后的膠最好再用清水洗下，除去running buffer中的SDS。轉(zhuǎn)膜時(shí)間：目的蛋白

5、分子大?。╧Da）膠濃度轉(zhuǎn)膜時(shí)間（h）801408%1.52.0258010%1.5154012%0.75<2015%0.5第三部分：免疫檢測影響抗原抗體反應(yīng)的因素（一） 電解質(zhì) 常用1%脫脂奶粉作為抗體稀釋液（二） 酸堿度 抗原抗體反應(yīng)一般在pH為68進(jìn)行（三） 溫度溫度升高可以加速分子運(yùn)動(dòng)，使結(jié)合加速，若高于56，可導(dǎo)致已結(jié)合的抗原抗體再解離，甚至變性破壞，在40時(shí)，結(jié)合速度慢，但是結(jié)合牢固，常用抗原抗體反應(yīng)溫度為37。此外，適當(dāng)震蕩也可以促進(jìn)抗原抗體分子的接觸，加速反應(yīng)。二、基本操作流程：提取細(xì)胞或組織蛋白、測定含量、蛋白樣品變性制備SDS-PAGE膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗TBST清洗H

6、RP標(biāo)記二抗TBST清洗ECL發(fā)光X-光片曝光、顯影結(jié)果分析三、操作流程中的細(xì)節(jié)注意（一）蛋白樣品制備A、提前制冰，提前打開低溫離心機(jī)。B、全部操作需在冰上進(jìn)行，防降解。C、提取細(xì)胞蛋白需注意：裂解液不要加多，以6孔板為例，每孔一般為60100µl，如果細(xì)胞密度小，每孔60µl，如果細(xì)胞密度大，每孔80100µl，以增加蛋白濃度，便于后期實(shí)驗(yàn)。D、貼壁細(xì)胞需注意：刮細(xì)胞時(shí)，需均勻，多次。E、除腦組織等易剪碎樣品外，其余組織需在剪碎外，做勻漿處理后，方可超聲。（二）蛋白樣初步定量蛋白樣品初步定量，常用BCA法，后用Thermo 酶標(biāo)儀測定。A、 BCA法注意事項(xiàng)：1

7、、檢測蛋白濃度時(shí)，樣品是需稀釋再檢測2、先加BCA工作液，再加樣本和標(biāo)準(zhǔn)蛋白B、 酶標(biāo)儀方法：File - 打開 demol START，即可開始檢測，十幾秒內(nèi)完成測定，插入優(yōu)盤，導(dǎo)出數(shù)據(jù)C、 配平蛋白濃度時(shí)，每孔上樣蛋白不可低于20µg，上樣量按30µl來計(jì)算。D、 關(guān)于蛋白變性后的分裝問題： a. 若為細(xì)胞蛋白，建議不分裝，在34次內(nèi)用完，每次需速用速凍。（注意：若不分裝，則上樣時(shí)需充分混勻再加樣） b. 若為組織蛋白，由于模型建立復(fù)雜，周期長，取樣難度大，可考慮分裝，但需充分混勻后分裝，速分速凍。（三）SDS-PAGE電泳（1）清洗膠板需溫柔，輕拿輕放（2）灌膠需迅速

8、（3）插梳子時(shí)避免將氣泡插入梳孔內(nèi)（4）電泳時(shí)間根據(jù)所需最小目標(biāo)蛋白來確定，使其跑到膠版中下部即可停止電泳（四）轉(zhuǎn)膜（1）PVDF膜在預(yù)處理前需用藍(lán)色或黑色圓珠筆在相應(yīng)位置標(biāo)記所轉(zhuǎn)蛋白名稱，便于后期操作。（2）PVDF膜在可作出實(shí)驗(yàn)的前提下，節(jié)省使用。（3）提前制冰。（4）關(guān)于切膠與切膜 a. 若只有一板膠，則用整張膜轉(zhuǎn)整張膠（包含所需蛋白即可），在孵育不同抗體前，將其剪開；或?qū)⒉眉魹檫m當(dāng)寬度的PVDF膜直接貼于凝膠的所需蛋白條帶的位置。b. 若為兩塊以上膠版，可考慮使用切膠法，將兩塊（或更多）PAGE膠含所需蛋白的相應(yīng)位置的凝膠切下，放于一起，再將其同轉(zhuǎn)在同一個(gè)整膜上，便于后期的抗體孵育和顯

9、影。（五）免疫反應(yīng)（1）關(guān)于抗體孵育時(shí)選擇自封袋還是搖盒 a. 在第一次做這種蛋白時(shí)，可以考慮使用搖盒，使用小搖盒，每盒需5ml，若培養(yǎng)皿，每皿10ml。 b. 對于小張膜或者單張膜，可以考慮使用自封袋，自封袋節(jié)省抗體。 （2） 關(guān)于抗體的使用 a. 新到抗體需分裝，冰上操作。b. 在能做出條帶的基礎(chǔ)上，抗體需節(jié)省使用。c. 一抗可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)可重復(fù)使用：如，Bioworld 的GAPDH 在1:5000的稀釋基礎(chǔ)上，普通情況，至少可重復(fù)使用4次。 abcam的LC3B，在1:1000的稀釋基礎(chǔ)上，至少可重復(fù)使用3次。d. 二抗使用前需看清所對應(yīng)的一抗是什么種屬，兔源or鼠源。（3）操作步驟的修改

10、部分：一抗室溫2h，4過夜，第二天再室溫1h；二抗室溫2h。（六） ECL化學(xué)發(fā)光，顯影，定影 （1）A、B液等體積混勻，手握1min，再滴加在膜表面12min，后壓片（2）壓片時(shí)根據(jù)熒光亮度選擇壓片時(shí)間（一張底片根據(jù)條帶數(shù)量可以壓多次） a. 無熒光情況下，選擇小壓片盒，壓片1530minb. 熒光微弱情況下，大壓片盒，1min、2min、3min、5minc. 熒光中度情況下，大壓片盒，1s、5s、10s、20s、30s、40s、1mind. 熒光強(qiáng)的情況下，大壓片盒，使其先淬滅一陣，再壓1s不到四、數(shù)據(jù)分析（一）步驟掃描圖片使用PS反相使用sigma pro 5摳圖，計(jì)算灰度，并將數(shù)據(jù)移入excel 使用SPSS 1