細(xì)胞培養(yǎng)基本概念

1、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)初探一、細(xì)胞培養(yǎng)基本概念細(xì)胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細(xì)胞摹擬體內(nèi)出現(xiàn)環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度及酸堿度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使期生長(zhǎng)繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物為單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群。在醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的是外周血淋巴細(xì)胞、皮膚或纖維細(xì)胞和各種能在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)的細(xì)胞系。外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)具有時(shí)間短、技術(shù)簡(jiǎn)便、可重復(fù)取材等優(yōu)點(diǎn)，它在臨床染色體分析中使用最廣泛。體外培養(yǎng)細(xì)胞株可在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生自發(fā)的或在外界作用下的轉(zhuǎn)化，成為永久細(xì)胞系，也可直接建成永久細(xì)胞系，永久細(xì)胞系能在體外無(wú)取制的傳代和生長(zhǎng)。永久細(xì)胞系通常具有非整倍體細(xì)胞和各個(gè)細(xì)胞的核型不完全相同特征。但細(xì)胞

2、克隆的細(xì)胞系其這一特征可以不明顯。二、細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境細(xì)胞在體外培養(yǎng)中所需的條件與體內(nèi)細(xì)胞基本相同。1、無(wú)污染環(huán)境培養(yǎng)環(huán)境無(wú)毒和無(wú)菌是保證細(xì)胞生存的首要條件。當(dāng)細(xì)胞放置于體外培養(yǎng)時(shí)，與體內(nèi)相比細(xì)胞丟失了對(duì)微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質(zhì)積累等，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此在進(jìn)行培養(yǎng)中，保持細(xì)胞生存環(huán)境無(wú)污染、代謝物及時(shí)清除等，是維持細(xì)胞生存的基本條件。2、恒定的溫度維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長(zhǎng)，必須有恒定適宜的溫度。人體細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)溫度為36.5±0.5，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會(huì)受到影響，甚至死亡。培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)低溫的耐受力較對(duì)高溫強(qiáng)，溫度上升不超過(guò)39時(shí)，細(xì)胞代謝與溫度成正

3、比；人體細(xì)胞在39-401小時(shí)，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)；在40-411小時(shí)，細(xì)胞會(huì)普遍受到損傷，僅小半數(shù)有可能恢復(fù)；41-421小時(shí)，細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，大部分細(xì)胞死亡，個(gè)別細(xì)胞仍有恢復(fù)可能；當(dāng)溫度在43以上1小時(shí)，細(xì)胞全部死亡。3、氣體環(huán)境氣體是人體細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生供給細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的能量和合成細(xì)胞生長(zhǎng)所需用的各種成分。開(kāi)放培養(yǎng)時(shí)一般把細(xì)胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中。二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需成分，它在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的PH值。大多數(shù)細(xì)胞的適宜PH為7.2-7.4，偏離

4、這一范圍對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響。但細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環(huán)境中更利于細(xì)胞生長(zhǎng)。有資料顯示，原代羊水細(xì)胞培養(yǎng)PH6.8時(shí)最適。細(xì)胞培養(yǎng)液PH濃度的調(diào)節(jié)最常用的為加NaHCO3的方法，因?yàn)镹aHCO3可供CO2，但二氧易于逸出，故最適用于封閉培養(yǎng)，而羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）因其對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，也起緩沖作用，有防止PH迅速變動(dòng)的特性而用于開(kāi)放細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，其最大優(yōu)點(diǎn)是在開(kāi)放式培養(yǎng)或細(xì)胞觀察時(shí)能維持較恒定的PH值。4、細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)是既是培養(yǎng)細(xì)胞中供給細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促使細(xì)胞生殖增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的生存環(huán)境。培養(yǎng)基的種類(lèi)很多，按其物質(zhì)狀態(tài)分為半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基

5、兩類(lèi)；按其來(lái)源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。（1）合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞所需物質(zhì)的種類(lèi)和數(shù)量嚴(yán)格配制而成的。內(nèi)含碳水化合物、氨基酸、脂類(lèi)、無(wú)機(jī)鹽、維生素、微量無(wú)素和細(xì)胞生長(zhǎng)因子等。單獨(dú)使用細(xì)胞雖有生存但不能很好的生長(zhǎng)增殖。（2）天然培養(yǎng)基：使用最普遍的天然培養(yǎng)基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促貼附因子及其多活性物質(zhì)。與合志培養(yǎng)基合用，能使細(xì)胞碩利增殖生長(zhǎng)。常見(jiàn)使用最為5-20%。三、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)施和基本條件1、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)細(xì)胞培養(yǎng)是一種無(wú)菌操作技術(shù)，要求工作環(huán)境和條件必須保證無(wú)微生物污染和不受其它有害因素的影響。細(xì)胞培養(yǎng)室和設(shè)計(jì)原則是防止微生物污染和有害因素影

6、響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新，干燥和無(wú)煙塵。細(xì)胞培養(yǎng)工作包括：工作液配制、無(wú)菌操作（采樣）、溫育、無(wú)菌處理，細(xì)胞和用品貯存等。細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)實(shí)施原則一般是無(wú)菌操作區(qū)設(shè)在室內(nèi)較少走動(dòng)的內(nèi)側(cè)，常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室，而洗刷消毒在另一室。2、常用設(shè)施及設(shè)備（1）超凈工作臺(tái)：也稱(chēng)凈化工作臺(tái)，分為側(cè)流式、直流式和外流式三大類(lèi)。（2）無(wú)菌操作間：一般由更衣間、緩部間和操作間三部分組成。操作間放置凈化工作臺(tái)及二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機(jī)、倒置顯微鏡等。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及消毒好的無(wú)菌物品等。（3）操作間：普通培養(yǎng)箱、離心機(jī)、水浴鍋、定時(shí)鐘、普通天平及日常分析處理物品。（4）洗刷消毒間：烤箱、消毒鍋、

7、蒸餾水處理器及酸缸等。（5）分析間：顯微鏡、計(jì)算機(jī)及打印機(jī)等。3、培養(yǎng)器皿細(xì)胞培養(yǎng)以玻璃器皿為主，常準(zhǔn)備最需是使用最的三倍。器皿應(yīng)選擇透明度好、無(wú)毒、中性硬度玻璃制品。常用的玻璃器皿有下面幾種。（1）液體儲(chǔ)存瓶：用于儲(chǔ)存各種配制好的培養(yǎng)液、血清等液體，常以500ml、250ml、100ml生理鹽水瓶或血漿瓶代替。（2）培養(yǎng)瓶：根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞種類(lèi)要求不同培養(yǎng)瓶的形態(tài)各異，用于細(xì)胞傳代培養(yǎng)的細(xì)胞要求瓶壁厚簿均勻，便于細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)和觀察，瓶口要大小一致，口徑一般不小于1cm，允許吸管伸入瓶?jī)?nèi)任何部位，規(guī)格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml等幾種。用于外周血培養(yǎng)的常用10ml普通圓瓶

8、。兩種培養(yǎng)瓶均要求選用優(yōu)質(zhì)玻璃制成。（3）培養(yǎng)皿：用于開(kāi)放式培養(yǎng)及其它用途。分直徑30mm、60mm、120mm等幾種。（4）吸管：常用的有長(zhǎng)吸管和短吸管兩類(lèi)，長(zhǎng)吸管也稱(chēng)刻度吸管。其改良后管上部有球型刻度稱(chēng)改良吸管，刻度吸管用于移動(dòng)液體。常用1ml和10ml兩種。短吸管也叫滴管，分彎頭和直頭兩種。（5）離心管：離心管是細(xì)胞培養(yǎng)中使用最廣泛的器皿，根據(jù)用途不同形態(tài)各樣，常用于細(xì)胞培養(yǎng)的離心管有大腹式尖底離心管和普通尖底離心管兩類(lèi)。前者分別為50ml、30ml、15ml；后者則多為10ml和5ml。（6）其它：如三角燒瓶、燒杯、量筒、漏斗、注射器等。四、培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)體外培養(yǎng)細(xì)胞根據(jù)它們?cè)谂囵B(yǎng)器皿是

9、否能貼附于支持物上生長(zhǎng)特征，可分為貼附型生長(zhǎng)和懸浮型生長(zhǎng)兩大類(lèi)。貼附型細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)能貼附在支技物表面生長(zhǎng)。如羊水細(xì)胞為貼附型細(xì)胞，常表現(xiàn)為成纖維型細(xì)胞和上皮細(xì)胞生長(zhǎng)。懸浮型細(xì)胞在培養(yǎng)中懸浮生長(zhǎng)。1、成纖維型細(xì)胞在培養(yǎng)中的細(xì)胞凡形態(tài)與成纖維細(xì)胞類(lèi)似時(shí)，皆可稱(chēng)之為成纖維細(xì)胞。本型細(xì)胞由形態(tài)與體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)相似而得名，細(xì)胞在支持物表面呈梭形或不規(guī)則三角形生長(zhǎng)，細(xì)胞中央有卵園形核，胞質(zhì)向外伸出2-3厘米個(gè)長(zhǎng)短不同的突起，除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間質(zhì)起源的組織細(xì)胞常呈本類(lèi)形態(tài)生長(zhǎng)。2、上皮型細(xì)胞此類(lèi)型細(xì)胞在培養(yǎng)器皿支持物上生長(zhǎng)具有扁平不規(guī)則多角形特征，細(xì)胞中央有園形核，細(xì)胞緊密相連單層膜樣

10、生長(zhǎng)。起源于內(nèi)、外胚層細(xì)胞如皮膚、表皮衍生物、消化管上皮等組織細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，皆呈上皮型形態(tài)生長(zhǎng)。3、游走型細(xì)胞本型細(xì)胞在支持物上散在生長(zhǎng)，一般不連成片。細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運(yùn)動(dòng)，速度快且不規(guī)則。此型細(xì)胞不很穩(wěn)定，有時(shí)亦難和其它型細(xì)胞區(qū)別。在一定的條件下，由于細(xì)胞密度增大聯(lián)成片后，可呈類(lèi)似多角型或成纖維細(xì)膩包形態(tài)。常見(jiàn)于羊水細(xì)胞培養(yǎng)的早期。五、培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)分析培養(yǎng)細(xì)胞隨貼附支持物形狀不同而形態(tài)各異，最常見(jiàn)的是貼附于平面支持物細(xì)胞。在一般光鏡下生存中的細(xì)胞是均質(zhì)而透明的，結(jié)構(gòu)不明顯。細(xì)胞在生長(zhǎng)期常有1-2個(gè)核仁在細(xì)胞機(jī)能狀態(tài)不良時(shí)，細(xì)胞輪廓會(huì)增強(qiáng)，反差增大。若胞質(zhì)中時(shí)而出現(xiàn)顆

11、粒、脫滴和腔泡等，表明細(xì)胞代謝不良。六、培養(yǎng)用品的清洗與消毒目前我國(guó)細(xì)胞培養(yǎng)器皿主要仍使用能反復(fù)使用的玻璃器皿，清洗的主要目的為清除雜質(zhì)和微生物，使在器皿內(nèi)不殘留任何影響細(xì)胞生長(zhǎng)的成份。因而在組織細(xì)胞培養(yǎng)中清洗和消毒是一項(xiàng)極為重要的環(huán)節(jié)。（一）清洗在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)都非常敏感。微生物產(chǎn)品附帶雜物，上次細(xì)胞殘留物及非營(yíng)養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)，均能影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此對(duì)新使用和重新使用的培養(yǎng)器皿都要嚴(yán)格徹底的清洗，且要根據(jù)器皿的組成材料不同，選擇不同的清洗方法。1、玻璃器皿的清洗組織細(xì)胞培養(yǎng)中，使用量最大的是玻璃器皿，故工作最最大的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、

12、刷洗、侵酸和沖洗四個(gè)步驟。清洗后的玻璃器皿僅要求干凈透明無(wú)油跡，而且不能殘留任何物質(zhì)。（1）浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶液掉。新的初次使用的玻璃器皿，在生產(chǎn)及運(yùn)輸過(guò)程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對(duì)細(xì)胞有害的物質(zhì)等。新瓶使用前應(yīng)先用自來(lái)水簡(jiǎn)單刷洗，然后用稀鹽酸液（5）浸泡過(guò)夜，以中和其中的堿性物質(zhì)。再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過(guò)的蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上。（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì)。刷洗要適度

13、，過(guò)度會(huì)損害器皿表面光澤度。（3）浸酸：清潔液是由重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水按一定比例配制而成，其處理過(guò)程稱(chēng)為浸酸。清潔液對(duì)玻璃器皿無(wú)腐蝕作用，而其強(qiáng)氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì)。清潔液去污能力很強(qiáng)。是清洗過(guò)程中關(guān)鍵的一環(huán)。浸泡時(shí)器皿要充滿(mǎn)清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面。浸泡時(shí)間一般為過(guò)夜，不應(yīng)少于6小時(shí)。清潔液可根據(jù)需要，配制成不同的強(qiáng)度，常用的下列三種：重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml）（A）強(qiáng)清潔液631000200000B）次強(qiáng)清洗液1202001000（C）弱清潔液100100100清潔液配制時(shí)應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護(hù)好面部及身體裸露部分。配制過(guò)程中可

14、使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制過(guò)程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色。（4）沖洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或潔液的殘跡。沖洗最好用洗滌裝置。即省力、效果又好。如用手工操作，則需流水沖洗十次以上，每天水須灌滿(mǎn)及倒干凈，最好用蒸餾水清洗3-5次，晾干備用。2、膠塞的清洗細(xì)胞培養(yǎng)中所用的橡膠制品主要是瓶塞。新購(gòu)置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來(lái)水沖洗，再做常規(guī)處理，常規(guī)清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，

15、然后用2%NaOH或洗衣粉煮沸10-20分鐘，以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)。自來(lái)水沖洗后，再用1%稀鹽酸浸泡30分鐘或蒸餾水沖洗后再煮沸10-20分鐘，晾干備用。3、塑料制品的清洗塑料自制品現(xiàn)多是采用無(wú)毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打開(kāi)包裝即可用，多為一次性物品。必要時(shí)用2%NaOH浸泡過(guò)夜，用自來(lái)水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，最后用自來(lái)水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。（二）消毒細(xì)胞培養(yǎng)的最大危險(xiǎn)是發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)菌，真菌和病毒等微生物的污染，污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常見(jiàn)的原因有操作間或周?chē)臻g的不潔，培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底，由于有關(guān)培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，故細(xì)胞

16、培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴(yán)格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染。消毒方法分為三類(lèi)：（A）物理滅菌法（紫外線、濕熱、過(guò)渣等）。（B）化學(xué)滅菌法（各種化學(xué)消毒劑）。（C）抗生素。（1）紫外線消毒：用于空氣，操作臺(tái)表面和不能使用其它法進(jìn)行消毒和培養(yǎng)器皿。紫外線直接照射方便、效果好，經(jīng)一定的時(shí)間照射后，可以消滅空氣中大部分細(xì)菌，培養(yǎng)室紫外線燈應(yīng)距地面不超過(guò)2.5米，且消毒進(jìn)物品不宜相互遮檔，照射不到的地方起不到消毒作用。紫外線可產(chǎn)生臭氧，污染空氣，試劑及培養(yǎng)液都有不良影響，對(duì)人皮膚也有傷害，不宜近照射也進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。（2）溫?zé)嵯荆杭锤邏赫魵庀?，是一種使用最廣泛、效果最好的消毒方法。溫?zé)嵯緯r(shí)，消毒物品不能裝得過(guò)滿(mǎn)，以防止消毒器內(nèi)氣體阻塞而千百萬(wàn)危險(xiǎn)，保證其內(nèi)氣體的流通。在加熱升壓之前，先要打開(kāi)排氣閥門(mén)排放消毒器內(nèi)的冷空氣，冷氣空氣排出后，關(guān)閉排氣閥門(mén)，同時(shí)檢驗(yàn)安全閥活動(dòng)自如，繼后開(kāi)始升壓，當(dāng)達(dá)到所需