分支桿菌屬細(xì)菌檢驗(yàn)

1、劉劉 垣垣目 錄v第一節(jié)、結(jié)核分枝桿菌第一節(jié)、結(jié)核分枝桿菌v第二節(jié)、麻風(fēng)分枝桿菌第二節(jié)、麻風(fēng)分枝桿菌v第三節(jié)、非典型分枝桿菌第三節(jié)、非典型分枝桿菌v分枝桿菌屬是一類細(xì)長(zhǎng)略彎曲的，有分枝生長(zhǎng)趨勢(shì)的分枝桿菌屬是一類細(xì)長(zhǎng)略彎曲的，有分枝生長(zhǎng)趨勢(shì)的桿菌。桿菌。v本屬細(xì)菌的主要特點(diǎn)是細(xì)胞壁含有大量脂質(zhì)，因此不本屬細(xì)菌的主要特點(diǎn)是細(xì)胞壁含有大量脂質(zhì)，因此不易著色，若經(jīng)加熱或延長(zhǎng)染色時(shí)間而著色后能抵抗易著色，若經(jīng)加熱或延長(zhǎng)染色時(shí)間而著色后能抵抗3%3%（強(qiáng)脫色劑（強(qiáng)脫色劑) )鹽酸乙醇的脫色，故又稱抗酸桿菌。鹽酸乙醇的脫色，故又稱抗酸桿菌。分枝桿菌屬共性 緩慢生長(zhǎng)菌緩慢生長(zhǎng)菌 迅速生長(zhǎng)菌迅速生長(zhǎng)菌 不能培養(yǎng)

2、菌不能培養(yǎng)菌麻風(fēng)分枝桿菌麻風(fēng)分枝桿菌龜膿腫分枝桿菌群偶發(fā)分枝桿菌分枝桿菌屬結(jié)核分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌牛分枝桿菌非洲分枝桿菌坎納分枝桿菌田鼠分枝桿菌卡介苗鳥分枝桿菌復(fù)合群堪薩斯分枝桿菌戈登分枝桿菌非結(jié)核分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群迅速生長(zhǎng)分菌（Runyon IV群）光產(chǎn)色菌 （Runyon I群）暗產(chǎn)色菌 （Runyon II群）不產(chǎn)色菌 （Runyon III群）分枝桿菌屬分類第一節(jié)、結(jié)核分枝桿菌第一節(jié)、結(jié)核分枝桿菌v核分枝桿菌簡(jiǎn)稱結(jié)核桿菌，是引起結(jié)核病的病原菌。對(duì)人致病的主要有人型、牛型和非洲型分支桿菌。其中人型結(jié)合分支桿菌的發(fā)病率最高。結(jié)核分枝桿菌經(jīng)多途徑感染，侵入全身多個(gè)器官，但以肺結(jié)核為最

3、多見。v結(jié)核分枝桿菌通過呼吸道、消化道和破損的皮膚粘膜進(jìn)入機(jī)體，侵犯多種組織器官，引起相應(yīng)器官感染，其中以肺結(jié)核最常見三大傳染疾病全球三大傳染疾全球疾全球三大全球三大傳傳染染疾病疾病愛滋?。ˋIDS）結(jié)核?。═B）瘧疾（Malaria）結(jié)核病近年來發(fā)病成上升趨勢(shì)，已成為危脅人類健康的嚴(yán)重的全球性重大公共衛(wèi)生問題結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中結(jié)核分枝桿菌感染的發(fā)病率最高，約占90% 案例案例 患者，女，19歲。就診時(shí)主訴：近一個(gè)多月來咳嗽，痰中帶有血絲，無胸痛，但又明顯乏力，消瘦，食欲不振，自覺午后微熱，盜汗。查體：體溫38.2，慢性病容。實(shí)驗(yàn)室檢查：白細(xì)胞8x109/L，血沉70mm/h。X射線透視：右

4、肺尖有多發(fā)性小斑片狀陰影，邊緣模糊。去清晨咳痰進(jìn)行抗酸染色，鏡下可見紅色略長(zhǎng)微彎的桿菌。請(qǐng)問：1.患者可能患何種疾??？引起本病的病原體是什么？ 2.應(yīng)做哪些微生物學(xué)檢查已確診？知識(shí)鏈接知識(shí)鏈接v結(jié)核病至今仍為重要的傳染病。據(jù)WHO報(bào)道，每年約有800萬-1000萬新病例發(fā)生，至少有300萬人死于該病。我國(guó)建國(guó)前死亡率達(dá)200-300人/10萬，居各種疾病死亡原因之首，建國(guó)后人民生活水平提高，衛(wèi)生狀態(tài)改善，特別是開展了群防群治，兒童普遍接種卡介苗，結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率大為降低。但應(yīng)注意，世界上有些地區(qū)因艾滋病、吸毒、免疫抑制劑的應(yīng)用、酗酒和貧困等原因，發(fā)病率又有上升趨勢(shì)。一、生物學(xué)特性1.1.

5、形態(tài)與染色形態(tài)與染色 菌體細(xì)長(zhǎng)略彎曲，呈單、分支狀、束狀、索狀排列的桿菌。無芽胞、無鞭毛、有莢膜。革蘭染色陽性，但不易著色。常用萋尼抗酸染色后菌體呈紅色。萋尼氏抗酸性染色法染色，菌體染成紅色熒光染料金胺O染色，在熒光下菌體呈橘黃色2.2.培養(yǎng)特性培養(yǎng)特性饞饞: :專性需氧,營(yíng)養(yǎng)要求高（L-J培養(yǎng)基）懶懶: :生長(zhǎng)溫度35,生長(zhǎng)緩慢,18小時(shí)繁殖一代丑丑: :液體培養(yǎng)基呈粗糙皺紋狀菌膜生長(zhǎng),固體培 養(yǎng)基上形成形似菜花樣典型菌落3 3、生化反應(yīng)、生化反應(yīng) 1）生化反應(yīng)不活潑。不發(fā)酵糖類。2）熱觸酶試驗(yàn)對(duì)區(qū)別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌有重要意義。 結(jié)核分枝桿菌大多數(shù)觸酶試驗(yàn)陽性，而熱觸酶試驗(yàn)陰性；

6、非結(jié)核分枝桿菌則大多數(shù)兩種試驗(yàn)均陽性。3）與牛分枝桿菌的區(qū)別在于結(jié)核分枝桿菌可合成煙酸和還原硝酸鹽，而牛分枝桿菌不能。“三耐三不耐三耐三不耐”對(duì)某些理化因子的抵抗力較強(qiáng)：v 耐干燥v 耐酸堿v 耐染料v 濕熱v 紫外線v 酒精4.4.抵抗力抵抗力不耐受典型形態(tài)多形性R型菌落S型菌落有毒無毒（卡介苗）抗結(jié)核藥敏感耐藥5 5、變異性、變異性卡介苗卡介苗：是有毒力的牛型結(jié)核分枝桿菌在甘油、膽汁和馬鈴薯的培養(yǎng)基中經(jīng)13年230次傳代而獲得的減毒變異株脂質(zhì)脂質(zhì)：磷脂 索狀因子 蠟質(zhì) 硫酸腦苷酯蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)莢膜莢膜1 1、致病物質(zhì)、致病物質(zhì) 尚未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生內(nèi)外毒素及侵襲性酶，主要由菌體成分導(dǎo)致的炎癥和免疫損

7、傷引起病變主要致病物質(zhì)主要致病物質(zhì)二、臨床意義二、臨床意義2.所致疾病2 2、所致疾病、所致疾病 結(jié)核分枝桿菌通過呼吸道、消化道和破損的皮膚粘膜進(jìn)入機(jī)體，侵犯多種組織器官，引起相應(yīng)器官感染，其中以肺結(jié)核最常見。結(jié)核分支桿菌可經(jīng)淋巴-血液播散，引起腦結(jié)核、腎結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎等3.3.免疫性免疫性抗體無保護(hù)作用，臨床輔助診斷有意義。細(xì)胞免疫發(fā)揮重要抗感染作用TB菌的感染率很高，發(fā)病率卻較低?？菇Y(jié)核的免疫稱為有菌免疫，菌體及其成分消失，免疫力也隨之消失4 4、結(jié)核菌素試驗(yàn)、結(jié)核菌素試驗(yàn)v 結(jié)核菌素即結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)，目前常用結(jié)核菌素制劑是純蛋白衍生物（PPD）v 1 1）原理）原理：結(jié)核菌素試驗(yàn)是應(yīng)

8、用結(jié)核菌素進(jìn)行皮膚試驗(yàn)來測(cè)定機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌是否能引起超敏反應(yīng)的一種試驗(yàn)v 2 2）試驗(yàn)方法與意義：）試驗(yàn)方法與意義：受試者前臂掌側(cè)皮內(nèi)注射PPD5U，4872h后，觀察結(jié)果。v 3 3）結(jié)果及意義：）結(jié)果及意義：紅腫硬結(jié)超過5mm者為陽性，15mm為強(qiáng)陽性，對(duì)臨床診斷有意義。若PPD-C側(cè)紅腫大于BCG-PPD側(cè)為感染。反之，BCG-PPD側(cè)大于PPD-C側(cè)，可能系卡介苗接種所致。v 4 4）用途：）用途：選擇卡介苗的接種對(duì)象和測(cè)定接種效果；輔助診斷嬰幼兒結(jié)核??；在流行病學(xué)中，作為調(diào)查人群感染結(jié)核桿菌的一個(gè)指標(biāo)；測(cè)定腫瘤患者的細(xì)胞免疫功能。結(jié)核菌素試驗(yàn)v 純蛋白衍生物純蛋白衍生物(PPD)

9、(PPD)，是用三氯醋酸沉淀結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，是用三氯醋酸沉淀結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液后的純化物。注入皮內(nèi)后如受試者已感染結(jié)核，則結(jié)核濾液后的純化物。注入皮內(nèi)后如受試者已感染結(jié)核，則結(jié)核菌素與致敏淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合，形成遲發(fā)型超敏反應(yīng)性炎菌素與致敏淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合，形成遲發(fā)型超敏反應(yīng)性炎癥癥根據(jù)注射部位是否出現(xiàn)紅腫判斷結(jié)果 5mm為陰性 5mm為陽性48小時(shí)后三、微生物檢查三、微生物檢查1 1、標(biāo)本采集：、標(biāo)本采集：根據(jù)病變部位不同采集不同的標(biāo)本。常見標(biāo)本為痰、尿、胸腹水等。1）痰：留取清晨第一口痰3-5ml。合格的痰標(biāo)本應(yīng)使患者深吸氣后，由肺部深處一干咳痰、血痰或黏液痰為合格標(biāo)本。用WHO推薦

10、的國(guó)際通用螺旋蓋痰瓶，或用密封塑料盒、蠟紙盒收集后送檢。2）其他：無菌抽取腦脊液、胸水、腹水及關(guān)節(jié)液等盛無菌試管送檢。腦脊液標(biāo)本靜置后，表面可有細(xì)薄凝塊，取凝塊作涂片或接種培養(yǎng) 臨床標(biāo)本臨床標(biāo)本涂片檢查涂片檢查 分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)HPLCHPLC分子鑒定免疫學(xué)鑒定分子鑒定免疫學(xué)鑒定直接涂片集菌涂片處理標(biāo)本或無污染標(biāo)本直接涂片集菌涂片處理標(biāo)本或無污染標(biāo)本 染色液體培養(yǎng)基染色液體培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基動(dòng)物試驗(yàn)固體培養(yǎng)基動(dòng)物試驗(yàn)（L-JL-J培養(yǎng)基）培養(yǎng)基）抗酸抗酸.金胺金胺O. O. 3535 涂片鏡檢涂片鏡檢儀器培養(yǎng)儀器培養(yǎng) 7 7天生長(zhǎng)天生長(zhǎng)7 7天生長(zhǎng)天生長(zhǎng)快速生長(zhǎng)菌慢生長(zhǎng)菌快速生長(zhǎng)菌慢生長(zhǎng)菌 初

11、步鑒定初步鑒定抗酸染色菌落特點(diǎn)抗酸染色菌落特點(diǎn)鑒定試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)鑒定試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)2 2、檢驗(yàn)程序、檢驗(yàn)程序3 3、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)方法（1）抗酸染色鏡檢1）直接涂片薄涂片：0.01ml，10mmX10mm,厚涂片：0.1ml，20mmX15mm2）集菌涂片：將標(biāo)本濃集后再涂片，提高陽性檢出率沉淀集菌法；漂浮集菌法（2）熒光染色鏡檢：用金胺O染色，在暗背景下，抗酸桿菌發(fā)出熒光（優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、視野覆蓋面大和陽性率檢出高） 結(jié)核分枝桿菌痰涂片抗酸染色（1000）（3 3）分離培養(yǎng)）分離培養(yǎng)1）培養(yǎng)基選擇：通常使用的固體培養(yǎng)基有改良羅氏（L-J）培養(yǎng)基、小川培養(yǎng)基、米氏7H10和7H11，液體培養(yǎng)基有

12、米氏7H9和蘇通氏培養(yǎng)基。2）標(biāo)本的前處理：前處理的目的：一是殺死雜菌，二是液化標(biāo)本。常見的方法：40g/LNaOH法：1份痰+2份40g/LNaOH溶液，35水浴消化15-30分鐘，震蕩2-3次，3000r/min離心15min，棄上清，沉淀物接種4%H2SO4法：多用于尿標(biāo)本的前處理，1份標(biāo)本+2-4倍4%H2SO4，室溫20min，震蕩2-3次，3000r/min離心15min，棄上清，沉淀物接種胰酶-苯扎溴銨法3）接種與培養(yǎng)取堿處理過的標(biāo)本，接種于酸性羅氏培養(yǎng)基斜面上酸處理過的標(biāo)本則接種在改良羅氏培養(yǎng)基斜面上4）結(jié)果：3天內(nèi)有菌落生長(zhǎng)，可報(bào)告非分枝桿菌生長(zhǎng)。7天內(nèi)發(fā)現(xiàn)菌落生長(zhǎng)者，經(jīng)過抗

13、酸染色證實(shí)后可報(bào)告快速生長(zhǎng)抗酸桿菌。7天以后發(fā)現(xiàn)菌落生長(zhǎng)者，經(jīng)過抗酸染色證實(shí)后可報(bào)告抗酸桿菌生長(zhǎng)。滿8周后仍未見菌落生長(zhǎng)者可報(bào)告培養(yǎng)陰性。（4 4）鑒定：）鑒定：依據(jù)生化反應(yīng)鑒定（5 5）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（6 6）其他診斷技術(shù)）其他診斷技術(shù)抗酸染色（抗酸染色（10001000）結(jié)果報(bào)告）結(jié)果報(bào)告 0 0300300視野視野 1 12 2條條300300視野視野 1 19 9條條/100/100視野視野 2 2 1 19 9條條/10/10視野視野 3 3 1 19 9條條/ /每個(gè)視野每個(gè)視野 4 4 9/9/每個(gè)視野每個(gè)視野第二節(jié)、麻風(fēng)分枝桿菌第二節(jié)、麻風(fēng)分枝桿菌麻風(fēng)分枝桿菌是麻風(fēng)病的病原

14、菌。麻風(fēng)是一種慢性傳染病。主要表現(xiàn)為皮膚、粘膜和神經(jīng)末梢的損害。晚期可侵犯深部組織和器官，形成肉芽腫1 1、形態(tài)與染色、形態(tài)與染色 較結(jié)核桿菌粗而短，抗酸染色陽性，呈束狀或團(tuán)狀排列，革蘭陽性，無鞭毛、莢膜和芽胞。典型細(xì)胞內(nèi)寄生菌，可形成麻風(fēng)細(xì)胞（即有麻風(fēng)桿菌存在、呈泡沫狀的細(xì)胞）2 2、培養(yǎng)特性：、培養(yǎng)特性：目前不能人工培養(yǎng)，可用動(dòng)物犰狳（qiu yu）接種建立模型。一一、生物學(xué)特性、生物學(xué)特性二二、臨床意義、臨床意義v 傳染源：麻風(fēng)患者v 傳播途徑：直接接觸、飛沫傳播v 易感人群：多為免疫缺陷個(gè)體3種臨床類型:1)瘤型麻風(fēng)：傳染性強(qiáng)且病情嚴(yán)重，細(xì)胞免疫功能缺陷而體液免疫正常。在皮膚和黏膜下形

15、成結(jié)節(jié)性紅斑，稱為麻風(fēng)結(jié)節(jié)。面部結(jié)節(jié)融合可呈“獅面”狀。 2）結(jié)核樣型麻風(fēng) 3）界線類綜合征v 根據(jù)臨床表現(xiàn)、免疫病理變化和細(xì)菌檢查結(jié)果等將麻風(fēng)分為瘤型、結(jié)核樣型、界線綜合征兩種病型結(jié)核樣型麻風(fēng)患者手部病變體征第三節(jié)、非典型分支桿菌第三節(jié)、非典型分支桿菌非典型分枝桿菌分為光產(chǎn)色菌（I群）、暗產(chǎn)色菌（II群）、不產(chǎn)色菌（III群）和速生菌（IV群）4群。廣泛分布在自然界，致病性較弱，可寄居與人體。當(dāng)機(jī)體抵抗力低下時(shí)，可導(dǎo)致肺內(nèi)、外或淋巴結(jié)類似結(jié)核的病變。 特點(diǎn)特點(diǎn) 結(jié)核分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌 非典型分支桿菌非典型分支桿菌菌落特征 粗糙、顆粒狀 光滑或粗糙菌落顏色 乳白色或米白色 黃色或橘黃色耐熱觸

16、酶試驗(yàn) - +中性紅試驗(yàn) + -索狀因子 + +/-豚鼠致病性 + -本章小結(jié) 分枝桿菌屬的細(xì)菌因其細(xì)胞壁富含脂質(zhì)，經(jīng)加溫或延遲染色時(shí)間分枝桿菌屬的細(xì)菌因其細(xì)胞壁富含脂質(zhì)，經(jīng)加溫或延遲染色時(shí)間后能抵抗一定濃度鹽酸乙醇的脫色作用，故稱抗酸桿菌。該屬細(xì)菌培后能抵抗一定濃度鹽酸乙醇的脫色作用，故稱抗酸桿菌。該屬細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)專性需氧，營(yíng)養(yǎng)要求特殊，大多數(shù)生長(zhǎng)緩慢，其中的麻風(fēng)分枝桿養(yǎng)時(shí)專性需氧，營(yíng)養(yǎng)要求特殊，大多數(shù)生長(zhǎng)緩慢，其中的麻風(fēng)分枝桿菌目前尚不能人工培養(yǎng)。該屬細(xì)菌中臨床最常見的是結(jié)核分枝桿菌，菌目前尚不能人工培養(yǎng)。該屬細(xì)菌中臨床最常見的是結(jié)核分枝桿菌，該菌經(jīng)萋該菌經(jīng)萋尼抗酸染色后呈紅色，用熒光染料金

17、胺尼抗酸染色后呈紅色，用熒光染料金胺O O染色后，在熒光染色后，在熒光顯微鏡下菌體發(fā)出黃綠色熒光。結(jié)核分枝桿菌常用羅顯微鏡下菌體發(fā)出黃綠色熒光。結(jié)核分枝桿菌常用羅琴培養(yǎng)基進(jìn)行琴培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，該菌在羅培養(yǎng)，該菌在羅琴培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，一般琴培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，一般2 24 4周才能形成肉眼可周才能形成肉眼可見菌落，菌落外觀類似見菌落，菌落外觀類似“菜花樣菜花樣”；在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較為迅速，；在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較為迅速，一般一般1 12 2周即可生長(zhǎng)，常形成表面菌膜，有毒力菌株可呈束狀生長(zhǎng)周即可生長(zhǎng)，常形成表面菌膜，有毒力菌株可呈束狀生長(zhǎng) 結(jié)核分枝桿菌典型生化特征表現(xiàn)為煙酸累積試驗(yàn)陽性、還原硝酸

18、結(jié)核分枝桿菌典型生化特征表現(xiàn)為煙酸累積試驗(yàn)陽性、還原硝酸鹽為亞硝酸鹽、觸酶陽性。該菌不被鹽為亞硝酸鹽、觸酶陽性。該菌不被T2HT2H抑制、吡嗪酰胺酶陽性，而抑制、吡嗪酰胺酶陽性，而牛結(jié)核分枝桿菌正好相反。結(jié)核分枝桿菌易發(fā)生變異，卡介苗是其減牛結(jié)核分枝桿菌正好相反。結(jié)核分枝桿菌易發(fā)生變異，卡介苗是其減毒活疫苗。該菌對(duì)理化因素有較強(qiáng)抵抗力，耐干燥、耐一定濃度酸堿毒活疫苗。該菌對(duì)理化因素有較強(qiáng)抵抗力，耐干燥、耐一定濃度酸堿和孔雀綠或結(jié)晶紫等染料，但對(duì)乙醇、紫外線、濕熱等敏感。該菌是和孔雀綠或結(jié)晶紫等染料，但對(duì)乙醇、紫外線、濕熱等敏感。該菌是結(jié)核病的病原體，可侵犯全身各個(gè)器官，但以肺結(jié)核最為多見。其致結(jié)核病的病原體，可侵犯全身各個(gè)器官，但以肺結(jié)核最為多見。其致病物質(zhì)主要與其菌體成分如莢膜、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等有關(guān)，結(jié)核的免疫病物質(zhì)主要與其菌體成分如莢膜、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等有關(guān)，結(jié)核的免疫屬于有菌免疫，結(jié)核菌素試驗(yàn)通過檢測(cè)機(jī)體對(duì)結(jié)核菌素有無遲發(fā)型超屬于有