布魯氏菌試管凝集試驗ppt課件

1、布魯氏菌血清學檢驗布魯氏菌血清學檢驗山西省疾病預防控制中心山西省疾病預防控制中心1.2 免疫學基礎免疫學基礎 3n由于布魯氏菌培養(yǎng)的營養(yǎng)條件苛刻而且時間長，所以布魯氏菌的血清學診斷越來越受到重視。4 主要是根據(jù)相應抗原抗體可以在體外發(fā)生特異性結合并呈現(xiàn)可見反應的原主要是根據(jù)相應抗原抗體可以在體外發(fā)生特異性結合并呈現(xiàn)可見反應的原理理,用已知抗原用已知抗原(或抗體或抗體)檢測體液中未知的抗體檢測體液中未知的抗體(或抗原或抗原).由于試驗時通常是用由于試驗時通常是用患者血清作為待檢材料患者血清作為待檢材料,所以檢測抗原抗體的體外試驗又稱為血清學試驗或血所以檢測抗原抗體的體外試驗又稱為血清學試驗或血清

2、學反應清學反應. 5n血清學檢查既可協(xié)助早期診斷，還可確定是否復發(fā)或重復感染。血清學檢查既可協(xié)助早期診斷，還可確定是否復發(fā)或重復感染。n感染感染1-2周后，患者血清中出現(xiàn)周后，患者血清中出現(xiàn)IgM抗體，可以用凝集試驗或抗人球蛋白試驗抗體，可以用凝集試驗或抗人球蛋白試驗檢測檢測n感染周后，患者血清中出現(xiàn)感染周后，患者血清中出現(xiàn)IgG抗體，可以用補體結合試驗，熒光抗體或抗體，可以用補體結合試驗，熒光抗體或ELISA檢測檢測6 虎紅平板的凝集反應（虎紅平板的凝集反應（RBPT）7 原理原理n該試驗又稱為班氏孟加拉紅平板凝集試驗。由于所用的抗原是酸性該試驗又稱為班氏孟加拉紅平板凝集試驗。由于所用的抗原

3、是酸性（PH3.63.9）帶色的抗原，該抗原與被檢血清作用時能抑制血清中的）帶色的抗原，該抗原與被檢血清作用時能抑制血清中的IgM類抗體的凝集活性、檢查出的抗體是類抗體的凝集活性、檢查出的抗體是IgG類，因此提高了該項反應的特異性。類，因此提高了該項反應的特異性。8 器材與試劑器材與試劑n虎紅平板凝集抗原、被檢血清、清潔脫脂玻片或有凹形孔的玻片、0.1ml吸管或微量加樣器、混合棒或牙簽 9 試驗方法試驗方法n在玻片上加0.03ml被檢血清，然后加入虎紅平板抗原0.03ml，充分混勻，在5分鐘內觀察結果。10(四四) 結果判定結果判定n有二種方法，第一種是，出現(xiàn)可見的凝集反應就判為陽性；n另一種

4、用“+”表示凝集程度按下列標準用加號記錄反應強度：n+：出現(xiàn)大的凝聚片或小的粒狀物，液體完全透明，100%凝集n+：有明顯的凝聚片，液體幾乎完全透明，75%凝集n+：有可見的凝集片，液體不甚透明，50%凝集n+：液體混濁，只有少量粒狀物，25%凝集n-：液體均勻混濁11評價評價n此法簡便、快速、容易操作，適于基層大面積檢疫；n此法有一定敏感性，檢查牛的陽性率稍高于綿羊、山羊。n因為在酸性環(huán)境下IgM活性受抑，該法主要是檢查IgG類凝集抗體，所以特異性較好，與補體結合試驗、二巰基乙醇（2-ME）試驗和抗球蛋白（Coombs0）試驗有較高的吻合率。n該法受制備抗原時條件影響較大，所以每批制備抗原應

5、予以檢查、標化方可應用。1213 試管凝集試驗14試管凝集試驗的原理1897年萊特氏等(Wright)與其同事發(fā)現(xiàn)患該病的病人血清與馬爾他細菌的培養(yǎng)物產生了凝集現(xiàn)象，遂稱之為萊特氏凝集反應，成了迄今常用的血清學診斷方法之一。15設備及試劑n試管凝集抗原n被檢血清n0.5%的石碳酸生理鹽水n吸管n試管n試管架n孵箱16操作步驟n被檢血清的稀釋:一般情況下,每份血清用5支小試管,第一管加入2.3毫升石碳酸生理鹽水,第二管不加，第三、四、五管各加入0.5毫升.用1毫升吸管吸取被檢血清0.2毫升,加入第一管中,混勻?；靹蚝? 以該吸管吸取第一管中血清加入第二和第三管各0.5毫升，以該吸管將第三管混勻，

6、并吸取0.5毫升加入第四管,依次稀釋到第五管,混勻后從第五管吸出0.5毫升棄去.如此稀釋后,從第二管起血清稀釋度分別為1:12.5 1:25 1:50 1:10017操作步驟n加入抗原:先以0.5%石碳酸生理鹽水將抗原原液做適當稀釋（一般是作1:10稀釋）,稀釋后的抗原加入各稀釋的血清管（第一管不加，作為血清對照）,每管0.5毫升,混勻。加入抗原后，第二管至第五管每管總量為1毫升，從第二管起血清稀釋度分別為1:25 1:50 1:100 1:200，從第一管再吸出0.5毫升，剩1毫升。n對照管的制作:n抗原對照（適當稀釋的抗原加石碳酸鹽水）n被檢血清對照n陰性對照（陰性血清稀釋后加抗原）n陽性

7、對照（陽性血清稀釋到原有滴度加抗原）18n然后將試驗管和對照管充分混勻后，放于37溫箱中20-22小時后取出，在室溫下放置2個小時，以比濁管為標準判定結果。19結果的判定n判定比濁管的制備判定比濁管的制備:每次試驗須配制比濁管作為判定的標準依據(jù)每次試驗須配制比濁管作為判定的標準依據(jù).n配制方法是配制方法是:取本次試驗用的抗原稀釋液（一般取本次試驗用的抗原稀釋液（一般1:10）5-10毫升，加入等量的毫升，加入等量的0.5%石碳酸生理鹽水作倍比稀釋，按下表配制比濁管石碳酸生理鹽水作倍比稀釋，按下表配制比濁管n比濁管的配制比濁管的配制20 試管凝集反應標準比濁管配制n管號管號 抗原稀釋液（抗原稀釋

8、液（ml） 生理鹽水（生理鹽水（ml） 透明度透明度 標記標記n1 0.00 1.00 100% + n2 0.25 0.75 75% + n3 0.50 0.50 50% + n4 0.75 0.25 25% n5 1.00 0.00 0% 21結果記錄n根據(jù)各管中上層液體的清亮程度記錄結果，特別是根據(jù)各管中上層液體的清亮程度記錄結果，特別是50%清亮度（清亮度（+）對判定）對判定結果關系較大，一定要與比濁管對比判定結果關系較大，一定要與比濁管對比判定n血清對照為清亮透明無沉淀血清對照為清亮透明無沉淀,抗原對照為均勻混濁在兩種對照管都成立的情況抗原對照為均勻混濁在兩種對照管都成立的情況下，才

9、可判定試驗管，否則應重做。對沉淀需要經驗判定。下，才可判定試驗管，否則應重做。對沉淀需要經驗判定。22n “+” 幾乎完全凝集，上清液幾乎完全凝集，上清液75%清亮清亮n“+”顯著凝集，上清液顯著凝集，上清液50%清亮清亮n“+” 微量凝集，液體微量凝集，液體25%清亮清亮n “-” 無凝集，液體不清亮無凝集，液體不清亮n確定每份血清滴度是以出現(xiàn)確定每份血清滴度是以出現(xiàn)“+”及以上的凝集現(xiàn)象的最高血清稀釋度及以上的凝集現(xiàn)象的最高血清稀釋度n“+”完全凝集，上清液完全凝集，上清液100%清亮清亮23診斷標準n沒有進行過菌苗接種的人、畜血清試驗的標準是：n人、牛、馬、鹿、駱駝等大家畜血清為1：10

10、0( +)及以上者為陽性，1：50(+)為可疑。n豬、羊(綿羊、山羊)、犬等小家畜血清在1：50(+)及以上者為陽性，1：25(+)為可疑。n對可疑反應的人和動物應在10-25天內重復檢查，以便進一步確定診斷。24影響試驗結果的因素及注意事項n 受檢血清應新鮮、無溶血、無污染，存放血清處溫度不能超過10，采血后應于34日內進行檢查，因放置時間過長可能會導致血清效價降低。n 遵守操作規(guī)程：所用的器材要清潔、干燥，試劑的加量一定要正確，放入溫箱的溫度和時間都要按要求，否則都影響結果。每份血清和抗原均要有對照。n高滲鹽水作凝集反應，一般濃度在1012%，一般切記人血清不能用高滲鹽水。25n作凝集反應

11、時，有個別血清會出現(xiàn)前帶現(xiàn)象，即稀釋度低的血清管內作凝集反應時，有個別血清會出現(xiàn)前帶現(xiàn)象，即稀釋度低的血清管內(或血清或血清量多的格量多的格)不發(fā)生凝集，而稀釋度高的管內不發(fā)生凝集，而稀釋度高的管內(或血清量少的格或血清量少的格)出現(xiàn)凝集，這叫出現(xiàn)凝集，這叫做前帶現(xiàn)象。如果某血清在平板凝集反應中出現(xiàn)了前帶現(xiàn)象，那么做試管反做前帶現(xiàn)象。如果某血清在平板凝集反應中出現(xiàn)了前帶現(xiàn)象，那么做試管反應時應多做幾個管，多采用幾個稀釋度。應時應多做幾個管，多采用幾個稀釋度。n 氯化鈉的含量增高對血清反應有明顯的影響，鹽的濃度越高，反應的敏感性氯化鈉的含量增高對血清反應有明顯的影響，鹽的濃度越高，反應的敏感性提

12、高，因此在獸醫(yī)界為了克服凝集反應中的阻抑抗體的干擾，對羊血清采用提高，因此在獸醫(yī)界為了克服凝集反應中的阻抑抗體的干擾，對羊血清采用高滲鹽水作凝集反應，一般濃度在高滲鹽水作凝集反應，一般濃度在1012%，切記一般人血清不能用高滲鹽，切記一般人血清不能用高滲鹽水。水。26n 前帶現(xiàn)象產生的原因前帶現(xiàn)象產生的原因n 膠體粒子學說：血清稀釋度低所含的膠體粒子多，它影響抗原抗體的結合，膠體粒子學說：血清稀釋度低所含的膠體粒子多，它影響抗原抗體的結合，而稀釋度高的則含膠體粒子少，所以出現(xiàn)凝集。而稀釋度高的則含膠體粒子少，所以出現(xiàn)凝集。n 不完全抗體學說：血清中因存在不完全抗體競爭抗原，所以在低稀釋度的不完

13、全抗體學說：血清中因存在不完全抗體競爭抗原，所以在低稀釋度的管中不凝集。管中不凝集。n 抗原抗體比例失調，也就是抗體過?；蜓鍍群羞^多防腐劑，嚴重污染抗原抗體比例失調，也就是抗體過剩或血清內含有過多防腐劑，嚴重污染可造成前帶現(xiàn)象的產生，封閉抗原的干擾?？稍斐汕皫КF(xiàn)象的產生，封閉抗原的干擾。27 評價n該方法特異性較好，敏感性也高，因此適用于檢疫和臨床診斷。該方法特異性較好，敏感性也高，因此適用于檢疫和臨床診斷。n由于該試驗有時出現(xiàn)前帶現(xiàn)象和封閉現(xiàn)象，所以有時也出現(xiàn)假陰性結果，必由于該試驗有時出現(xiàn)前帶現(xiàn)象和封閉現(xiàn)象，所以有時也出現(xiàn)假陰性結果，必要時和其它方法聯(lián)合應用。要時和其它方法聯(lián)合應用。2

14、8n抗原抗體反應的特點抗原抗體反應的特點29抗原抗體結合的特異性抗原抗體結合的特異性 抗原抗體結合的基礎是抗原決定簇與抗體的抗原結合部位之間抗原抗體結合的基礎是抗原決定簇與抗體的抗原結合部位之間 的反應的反應.這種反這種反應是專一性的應是專一性的.例如例如:布氏桿菌只能與布氏桿菌抗體相結合布氏桿菌只能與布氏桿菌抗體相結合,而不能與痢疾桿菌而不能與痢疾桿菌抗體相結合抗體相結合.30 抗原抗體抗原抗體 結合的表面性結合的表面性n抗原抗體的結合僅僅是分子表面的結合，雖然兩者的結合相當穩(wěn)定，但結合后的抗原抗體，其本身的結構，生物學活性均未遭到破壞,并且在一定條件下可解離.即抗原抗體的結合是可逆的,所以

15、,解離抗原抗體復合物的方法可用于 提取,純化抗原或抗體.31抗原抗體結合的適當比例抗原抗體結合的適當比例抗原是多價的抗原是多價的(分子表面有多個抗原決定簇分子表面有多個抗原決定簇)，抗體一般是雙價的，抗體一般是雙價的，(分子的末端有分子的末端有兩個抗原結合部位兩個抗原結合部位)，所以，二者的結合就有一個比例關系問題只有抗原抗，所以，二者的結合就有一個比例關系問題只有抗原抗體比例適當，才能形成較大的，容易觀察的復合物如若比例不當體比例適當，才能形成較大的，容易觀察的復合物如若比例不當,就不能形就不能形成較大復合物成較大復合物.所以試驗時要根據(jù)不同情況對抗原抗體所以試驗時要根據(jù)不同情況對抗原抗體(

16、甚至兩者同時甚至兩者同時)進行連進行連續(xù)稀釋續(xù)稀釋,以便更好地提供兩者最適的比例以便更好地提供兩者最適的比例.顆粒性抗原顆粒性抗原,因其分子較大因其分子較大,形成可見形成可見的凝集物質所需的抗體較少的凝集物質所需的抗體較少,所以試驗時一般把含有抗體的血清做連續(xù)稀釋所以試驗時一般把含有抗體的血清做連續(xù)稀釋,盡管如此盡管如此,有時還能在含有較多抗體的前列試管中有時還能在含有較多抗體的前列試管中,因兩者比例不當不呈現(xiàn)可因兩者比例不當不呈現(xiàn)可見反應見反應,這種現(xiàn)象被稱為前帶現(xiàn)象這種現(xiàn)象被稱為前帶現(xiàn)象.32抗原抗體結合的階段性抗原抗體結合的階段性抗原抗體的結合分為兩個階段抗原抗體的結合分為兩個階段第一階

17、段第一階段:特異性結合階段特異性結合階段,反應快反應快,只需幾秒或幾分即可完成只需幾秒或幾分即可完成.但不出現(xiàn)肉眼可見但不出現(xiàn)肉眼可見的反應的反應.第二階段第二階段:抗原抗體結合的可見階段抗原抗體結合的可見階段,這一階段的反應是可見的這一階段的反應是可見的,反應較慢反應較慢,常需幾常需幾分鐘，幾十分鐘或更久。分鐘，幾十分鐘或更久。 33抗原抗體反應的影響因素抗原抗體反應的影響因素n電解質；抗原抗體反應必須有適量的電解質參加，否則不出現(xiàn)可見反應，一電解質；抗原抗體反應必須有適量的電解質參加，否則不出現(xiàn)可見反應，一般拿般拿0.85化鈉溶液做為抗原或抗體的稀釋液?；c溶液做為抗原或抗體的稀釋液。n溫

18、度：適當提高溫度可以增多抗原與抗體的碰撞機會。促進反應現(xiàn)象加速出溫度：適當提高溫度可以增多抗原與抗體的碰撞機會。促進反應現(xiàn)象加速出現(xiàn)。一般最適溫度范圍在現(xiàn)。一般最適溫度范圍在0-56之間。在這個范圍內，溫度低，對反應的促進之間。在這個范圍內，溫度低，對反應的促進作用較小，但生成的復合物不易解離。溫度高，對反應的促進作用較大，但作用較小，但生成的復合物不易解離。溫度高，對反應的促進作用較大，但生成的復合物容易解離。實際工作中，多數(shù)反應在生成的復合物容易解離。實際工作中，多數(shù)反應在37進行。在試驗過程中，進行。在試驗過程中，一般在加溫之前，適度的振搖抗原抗體的混合液，也能增加兩者之間的碰撞一般在加溫之前，適度的振搖抗原抗體的混合液，也能增加兩者之間的碰撞機會。機會。n酸堿度：一般以酸堿度：一般以6.0-8.0為宜，若低至為宜，若低至3左右，因接近細菌的等電點，可引起左右，因接近細菌的等電點，可引起細菌性抗原非特異性的酸凝集，影響試驗結果。