熊本牡蠣單體育苗養(yǎng)殖

1、熊本牡蠣單體苗種生產(chǎn)和養(yǎng)殖技術(shù)研究摘 要 本文對熊本牡蠣幼蟲培育、 單體苗種生產(chǎn)和養(yǎng)殖技術(shù)等進行了研究。 探討熊本牡蠣單體苗種生產(chǎn)相關(guān)技術(shù)， 為單體熊本牡蠣養(yǎng)殖推廣提供了基礎(chǔ)性資料。 其主要結(jié)果如下:1. 本研究以長牡蠣人工育苗技術(shù)為基礎(chǔ)， 進行了熊本牡蠣親貝促熟、 幼蟲培育工作。 經(jīng)過 15 天培育， 親貝可自然排放精卵。受精卵在26海水中， 經(jīng)過 1718 小時孵化為 D形幼蟲。選優(yōu)后進入幼蟲培育階段，控制幼蟲培育密度為 1-2個/ml。 熊本牡蠣幼蟲經(jīng) 17天培育，到達眼點幼蟲期。 2. 本研究運用三種單體苗種生產(chǎn)方法，進行了單體熊本牡蠣生產(chǎn)研究: (1) 先固著后脫基法: 采用聚丙烯扁

2、條包裝帶、尼龍繩、聚乙烯網(wǎng)片、塑料薄膜、 300 目篩絹網(wǎng)等具有局限性，不適于單體苗種生產(chǎn); 而聚乙烯波紋板是一種較理想的生產(chǎn)單體熊本牡蠣附著基，使養(yǎng)殖貝苗具有剝離效率高、生長速度快等優(yōu)點，能夠高效地獲得大量稚貝。 (2) 顆粒固著基采苗法: 以沙粒作為附著基，其眼點幼蟲附著率低于1%，同時，培育期間日常管理很不方便; 以貝殼粉為附著基，幼蟲附著率也僅為2.73%，且需要配套的流水培育設(shè)施。 這兩種方法也不適于單體苗種。 (3) 腎上腺素(EPI)處理法: 經(jīng)過 EPI處理后，眼點幼蟲的變態(tài)率較低， 最高僅能達到 40%，并且藥物處理效果的穩(wěn)定性差。這種方法不適于大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。 3. 單體熊

3、本牡蠣稚貝生長特性研究 同等規(guī)格的稚貝，經(jīng)過 25 天培育，熊本牡蠣單體稚貝殼高生長了 1417m，固著稚貝殼高生長了 1389m， 培育期間二者生長速度無顯著性差異(P > 0.05)。 鹽度對熊本牡蠣稚貝生長和存活具有一定的影響。 半咸水有利于熊本牡蠣稚貝的生長: 鹽度為15 時，稚貝生長最快; 其次為鹽度 10、 20; 鹽度 30 時， 稚貝生長速度最慢。 在鹽度 15-30 范圍內(nèi)， 熊本牡蠣稚貝正常生長; 當鹽度低于10 時，稚貝的存活率顯著降低(P < 0.05)。第一章 文獻綜述 第一節(jié) 牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和經(jīng)濟地位 1 牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展概述 牡蠣又稱海蠣子、蠣蟥等，

4、是一種固著型生活類型的雙殼貝類，在分類上屬于軟體動物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、翼形亞綱(Pterimorpjia)、珍珠貝目(Pterioida)、 牡蠣科(Ostreidae)。 牡蠣屬于界性分布種類， 除寒帶某些海域外，其他海域均有分布，目前已發(fā)現(xiàn) 100 多種，多固著生活于潮間帶巖石上。 牡蠣是分布最廣、種類最多、產(chǎn)量最高的一種經(jīng)濟貝類，世界各臨海國家?guī)缀醵加猩a(chǎn)。牡蠣養(yǎng)殖業(yè)比較發(fā)達的國家有中國、日本、美國、朝鮮、法國等，其中我國牡蠣產(chǎn)量居世界首位。 牡蠣作為我國傳統(tǒng)四大養(yǎng)殖貝類(縊蟶、牡蠣、蛤仔、泥蚶) 之一，沿海各地普遍都有養(yǎng)殖，在我國貝類養(yǎng)殖

5、業(yè)中占有重要地位。我國牡蠣養(yǎng)殖具有悠久的歷史，早在1000 多年前的宋朝就有插竹養(yǎng)殖的記錄。經(jīng)過長期探索和發(fā)展，牡蠣養(yǎng)殖方法不斷改善和提高: 1960年，我國成功采用了水泥棒插植方法養(yǎng)殖牡蠣，后又發(fā)明了垂下式養(yǎng)殖方法， 這使牡蠣養(yǎng)殖面積和產(chǎn)量有了很大增加，我國北方沿海各省也逐漸開始了牡蠣的人工養(yǎng)殖。牡蠣養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展最大的突破是牡蠣室內(nèi)工廠化人工育苗生產(chǎn)技術(shù)的成功，這為牡蠣養(yǎng)殖業(yè)提供了充足的苗種。 2 牡蠣的養(yǎng)殖狀況和經(jīng)濟地位 我國各地沿海由于養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境不同，牡蠣對應(yīng)的養(yǎng)成方法很多。我國傳統(tǒng)牡蠣養(yǎng)殖方法有投石養(yǎng)殖、橋石養(yǎng)殖、立樁養(yǎng)殖、灘涂養(yǎng)殖、筏式養(yǎng)殖等。筏式養(yǎng)殖可以人為控制單位水體牡蠣養(yǎng)殖密度，

6、在海水里攝食時間長，從而養(yǎng)殖牡蠣生長快，縮短養(yǎng)殖時間， 提高牡蠣產(chǎn)量。熊本牡蠣單體苗種生產(chǎn)和養(yǎng)殖技術(shù)的研究 。外國的養(yǎng)殖方式有許多種， 如筏式養(yǎng)殖和潮間帶養(yǎng)殖，并且養(yǎng)殖周期幾乎都要在兩到三年以上。 筏式養(yǎng)殖雖然在水里時間長，餌料豐富，但是因為長時間浸在海水里，因此容易受扁蟲或螃蟹等天敵侵害而死亡; 同時沒有太陽或雨水的沖刷，容易在表面生有絲狀藻類、?？⑻賶氐壬?， 而影響生長。潮間帶養(yǎng)殖因退潮后有太陽曝曬，可以將表面的一些生物殺死，或因退漲潮關(guān)系，沖刷表面附著物，可以讓牡蠣養(yǎng)殖生長比較好、品質(zhì)高，但因進食時間相對縮短， 成長率就相對下降。 我國主要的牡蠣經(jīng)濟品種有長牡蠣( Crassostr

7、ea gigas) 、近江牡蠣(Crassostrea ariakensis)、褶牡蠣(Crassostrea angulata)，其中長牡蠣是北方主要養(yǎng)殖品種，褶牡蠣是南方重要的養(yǎng)殖品種。長牡蠣具有許多優(yōu)良性狀，如生長速度快,產(chǎn)量高 ,肥滿度高， 大大推動了我國牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展， 長牡蠣產(chǎn)量已經(jīng)占到牡蠣總產(chǎn)量的33%， 是我國重要的養(yǎng)殖品種。雖然長牡蠣在我國也有自然分布，但我國大部分養(yǎng)殖長牡蠣是在上世紀80年代由日本引入。 近年來，隨著長牡蠣養(yǎng)殖規(guī)模擴大，養(yǎng)殖產(chǎn)量有大幅提高， 但長牡蠣種質(zhì)退化嚴重，品質(zhì)不斷下降，主要表現(xiàn)在: 出肉率低,肉質(zhì)不好、形狀不規(guī)則、死亡率逐年升高等;種質(zhì)退化表現(xiàn)在:

8、 育苗成功率大幅降低、養(yǎng)殖牡蠣大批死亡、品質(zhì)差等方面。從而導(dǎo)致長牡蠣市場價格偏低，達不到牡蠣出口標準，嚴重影響牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。 牡蠣養(yǎng)殖具有投入低、產(chǎn)量高等優(yōu)點，隨著養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展，其養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量不斷提高， 20世紀50年代至 70年代末，牡蠣養(yǎng)殖總產(chǎn)量一直維持在 2.5萬-3.0萬噸; 80年代超過 4萬噸， 90年代后牡蠣養(yǎng)殖總產(chǎn)量直線上升，1996年達到 238萬噸，養(yǎng)殖總面積 10.7萬公頃; 2006年我國牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)量為389萬噸，占我國貝類養(yǎng)殖業(yè)總產(chǎn)量的 36.6%; 2011年牡蠣養(yǎng)殖總產(chǎn)量達到 375.6 萬噸，占貝類養(yǎng)殖總量的32.5%，比2006 年略有下降，已成為

9、我國貝類養(yǎng)殖的重要產(chǎn)業(yè)。 單體牡蠣研究、養(yǎng)殖現(xiàn)狀及前景 1 研究現(xiàn)狀 牡蠣人工育苗技術(shù)，普遍使用扇貝殼作為附著基，使蠣苗固著于扇貝殼上，熊本牡蠣單體苗種生產(chǎn)和養(yǎng)殖技術(shù)的研究 ,最后將扇貝殼裝進網(wǎng)籠內(nèi)進行筏式養(yǎng)殖。笨重的扇貝殼、瓦片等附著基，讓搬運工作耗費大量的勞動力; 由于牡蠣固著牢固，收獲時必須人為一個個將牡蠣剝離開，給牡蠣的收獲帶來了不便，既影響工作效率，也不利于深加工; 同時固著在一起的牡蠣，在風浪作用下常割破網(wǎng)籠，不利于養(yǎng)殖工作開展和日常管理。牡蠣固著在一起生長，其生長空間受到限制，導(dǎo)致成體牡蠣殼形不規(guī)則，同時由于食物的限制，影響?zhàn)B殖牡蠣生長速度，導(dǎo)致個體差異大，商品經(jīng)濟價值低。多年來

10、，為了得到殼形規(guī)則, 商品價值和產(chǎn)量高的牡蠣，人們探索發(fā)現(xiàn)單體牡蠣這種培育方法。單體牡蠣的形成: 即在牡蠣具有變態(tài)能力的幼蟲期，進行特定的的處理，使之不固著變態(tài)，成為單個游離的牡蠣。常用的單體牡蠣生產(chǎn)方法有: 腎上腺素(EPI)和去甲腎上腺素(NE)處理法、顆粒固著基采苗法、先固著后脫基法。早期單體牡蠣的生產(chǎn)方法是將固著到巖石上的蠣苗，從巖石上剝離后養(yǎng)成，但這種剝離的方式浪費大量勞動力，成本高，而且死亡率很高。自上世紀 70 年代， 國外使用藥品處理方法獲得單體牡蠣的研究取得了突破進展，腎上腺素和去甲腎上腺素應(yīng)用到單體牡蠣生產(chǎn)中。后又研究使用特殊固著基生產(chǎn)單體牡蠣，也取得了很大進展， 我國19

11、87年開始有報道單體牡蠣在威海試養(yǎng)成功， 1991 年于瑞海探究了有關(guān)單體苗種的生產(chǎn)技術(shù)，1992 年王昭萍等進行了單體褶牡蠣的研究， 1993 楊愛國等采用多種處理方法獲得單體長牡蠣， 取得了初步成功 2 養(yǎng)殖現(xiàn)狀及前景單體牡蠣的養(yǎng)殖模式在歐洲和美洲已為牡蠣的一種常見的養(yǎng)殖方式。國外單體牡蠣養(yǎng)殖設(shè)施主要有托盤養(yǎng)殖和集裝箱式養(yǎng)殖。 托盤養(yǎng)殖方式具體為: 規(guī)格為 200×100×10 厘米³的托盤結(jié)構(gòu)， 用特定網(wǎng)目的金屬網(wǎng)作托盤的底，分為上下三層， 每層放養(yǎng)蠣苗量， 隨著個體的增大， 逐漸減少， 將托盤吊掛在合適的海區(qū)，進行筏式養(yǎng)殖; 集裝箱式養(yǎng)殖方式是將裝有牡蠣苗

12、的帶孔塑料盤安放在固定在海底的鐵架上。 每個集裝箱可可放養(yǎng)約 10 萬個殼長5毫米的蠣苗，隨牡蠣的生長逐步降低養(yǎng)殖密度。單體牡蠣筏式養(yǎng)殖是一種較先進的養(yǎng)殖方式，可充分利用水體，減少敵害生物侵襲， 牡蠣生長快、產(chǎn)量高。單體牡蠣處于單個游離狀態(tài)，生長空間不受限制，個體能充分生長， 若養(yǎng)殖方式恰當，其生長速率比傳統(tǒng)的養(yǎng)殖方式更快，單位水體產(chǎn)量高， 并且外形更加美觀， 牡蠣也會更健康。 并且這種養(yǎng)殖方式大大提高了網(wǎng)籠的抗風浪能力， 因此適宜單體牡蠣養(yǎng)殖的海區(qū)范圍更廣，只要能夠設(shè)置筏架，就可以進行單體牡蠣笩式籠養(yǎng)。同時單體苗種為分散養(yǎng)殖，不受空間和餌料限制，能夠避免個體同步性差，大量脫苗死亡的弊病。單體

13、牡蠣養(yǎng)殖模式會增加一些養(yǎng)殖成本，但所增加的成本不會高太多，相反因為養(yǎng)殖產(chǎn)品品質(zhì)高，所帶來的利潤可能是加倍的。我國單體牡蠣的養(yǎng)殖還沒有形成規(guī)模化， 主要瓶頸在于單體牡蠣的生產(chǎn)、中間培育技術(shù)和養(yǎng)殖設(shè)施還不成熟、完善，并且投入大， 限制了單體牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。貝養(yǎng)殖籠進行單體牡蠣養(yǎng)殖， 能夠獲得比較好的效果。 當年培育的單體牡蠣苗種，在扇貝暫養(yǎng)籠中養(yǎng)殖到第二年的 4月份， 牡蠣苗可長到 3-4 厘米，此時分苗進入扇貝養(yǎng)殖籠， 至年底平均殼長達到 10.4 厘米， 幼貝平均重 88g， 具有 90%以上的成活率， 產(chǎn)量達到 5 噸左右/畝。 使用網(wǎng)籠進行單體牡蠣養(yǎng)殖， 這種方法簡單易行，無需其他養(yǎng)殖器

14、材。 籠養(yǎng)牡蠣不存在脫落掉苗，也解決了繩養(yǎng)牡蠣附著物多的問題。單體牡蠣是無固著基牡蠣，其生長不受空間限制，殼形規(guī)則，同時食物競爭小，大小均勻，可充分發(fā)揮個體的生長潛力，易于運輸、放養(yǎng)、收獲和加工，便于筏式籠養(yǎng)， 這樣可以提高單位養(yǎng)殖水體的產(chǎn)量。由于單體牡蠣游離養(yǎng)殖，不會在風浪的作用下破壞養(yǎng)殖設(shè)施，提高抗風浪能力。同時單體牡蠣可以無需加工直接出售，不像傳統(tǒng)養(yǎng)殖牡蠣需先從附著基上剝離下來，節(jié)省勞動力與養(yǎng)殖成本。單體牡蠣產(chǎn)業(yè)在國外已經(jīng)普及，目前主要養(yǎng)殖品種有長牡蠣、 歐洲牡蠣和美洲牡蠣， 目前美國、日本和韓國市場對單體牡蠣的需求量還是很大，具有高的經(jīng)濟價值和社會效益，而國內(nèi)這種養(yǎng)殖模式正處于探索階熊

15、具有廣闊的發(fā)展前景。 第二節(jié) 熊本牡蠣的生物學(xué)和人工育苗研究 1 熊本牡蠣生物學(xué)概述 熊本牡蠣(Crassostrea sikamea(Amemiya, 1928)在分類上屬于軟體動物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、翼形亞綱(Pterimorpjia)、珍珠貝目(Pterioida)、牡蠣科(Ostreidae)、巨蠣屬(Crassostrea)。 野生熊本牡蠣與長牡蠣在外形上，沒有明顯的差別。但美國養(yǎng)殖的熊本牡蠣與長牡蠣在形態(tài)上卻有明顯差別。熊本牡蠣相對于長牡蠣，個體偏小; 形狀接近圓形，殼高、 殼長相差不大;左殼較長牡蠣凹陷較深; 自殼頂放射出的肋脊比較明

16、顯; 貝殼表現(xiàn)顏色偏淺，發(fā)白;個體生長緩慢， 3-4 年達到商品規(guī)格; 熊本牡蠣成體最適鹽度為 7-30， 而幼蟲的適宜生長鹽度為 18-26。 熊本牡蠣曾被認為是長牡蠣( C.gigas)的一個地理亞種。 1928 年Amemiya 通過詳細調(diào)查和研究發(fā)現(xiàn)熊本牡蠣在形態(tài)學(xué)、適宜鹽度范圍、卵子大小和棲息地與長牡蠣有所不同， 提出了熊本牡蠣可能是長牡蠣的一個變種(variety)(Amemiya, 1928)。由于長牡蠣和熊本牡蠣在生長過程中受環(huán)境因素影響大，可塑性強，使他們的分類更加苦難(Sekino, 2009)。隨后有研究發(fā)現(xiàn)二者在生長速度、個體大小、放射肋深淺有明顯差異(Imai and

17、 Sakai, 1961)。可是僅從他們的外部特征在棲息環(huán)境下將二者區(qū)分開來，還是有很大困難(Camaraetal.,2008)。在熊本牡蠣原產(chǎn)地有明海，當?shù)厝藢ⅰ癝hikame-gaki”(熊本牡蠣) 和“Magaki”(長牡蠣)統(tǒng)稱為 “Shikame-gaki”，而這讓二者的區(qū)分更加棘手 (Sekino, 2009)。 在1970s中期，Ahmed 第一次提出了用 Crassostrea sikamea 描述 Amemiya提出的長牡蠣的變種即熊本牡蠣，但是當時 Ahmed 提出這種分類方式時，并沒有充分的分類學(xué)證據(jù)支持這種觀點(Ahmed, 1976)。這種分類方式是根據(jù) Imai a

18、nd Sakai 對日本長牡蠣的描述特征及自己的觀察得出的判斷，并沒有考慮單向配子雜交親和性實驗(Numachi, 1978)。隨后通過對熊本牡蠣和長牡蠣染色體的研究發(fā)現(xiàn)，二者雖然同時有 20 條染色體，但也有明顯差異: 長牡蠣染色體類型為6 條中部著絲粒染色體、 12 條亞中部著絲粒染色體; 熊本牡蠣具有 6 條中部著絲粒染色體、14 條亞中部著絲粒染色體(Ahmed, 1973)。雖然關(guān)于染色體的研究還不能作為充分證據(jù)將二者區(qū)別開來， 還需要更進一步研究，但這初步說明可以通過染色體將熊本牡蠣和長牡蠣來區(qū)別開。 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標記運用到二者的分類，并逐步證明熊本牡蠣和長牡蠣分屬兩

19、個不同的種。早期 Buroker等通過等位酶技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)熊本牡蠣和長牡蠣具有明顯的差異， 并且隨著二者遺傳距離的研究發(fā)現(xiàn)(Buroker et al., 1979)，他們使用了 Ahmed 提出的 Crassostrea sikamea 代替 C. Gigas 來描述熊本牡蠣。 隨著 PCR 技術(shù)的發(fā)展，尤其是線粒體DNA(COI)的研究(Wang and Guo, 2008)，同時大量關(guān)于長牡蠣 SSR 研究的發(fā)表(Huvet et al., 2000; Li et al., 2003; Sekino et al., 2003; Yu and Li, 2008)， 可以證明他們之間具有明顯的

20、遺傳距離。熊本牡蠣最后被訂名為獨立的一個物種，并估計二者分化于一百萬年前(Banks et al.， 1993)。 熊本牡蠣一直被認為是日本特有的種，原產(chǎn)地位于日本南部九州島嶼的熊本縣有明海灣。有明海灣擁有自己獨特地生物群體，包括一些魚類、軟體動物和甲殼類，有研究表明這些種群也沿著中國和韓國大陸架分布(Sato, 2000; Tanaka, 2007)。據(jù)此推測熊本牡蠣的分布不僅僅局限于日本有明海(Sekino, 2009)。 最近有研究證實， 正如 Satou 預(yù)期，熊本牡蠣也分布于韓國和中國，比如: 廣東省、浙江省和江蘇省。20世紀40年代二戰(zhàn)后，熊本牡蠣被當做長牡蠣引進到美國西海岸。并受

21、到當?shù)厝嗣竦南矏?，熊本牡蠣逐漸取代了長牡蠣的進口。但由于當時熊本牡蠣利潤低，熊本縣人們轉(zhuǎn)向紫菜的養(yǎng)殖，熊本牡蠣產(chǎn)量大幅降低，到50年代末期熊本牡蠣對美國的出口逐漸停止。美國養(yǎng)殖戶只能通過過去進口的熊本牡蠣作為親本進行熊本牡蠣的養(yǎng)殖工作。 美國西海岸水域常年溫度在10 至20，而熊本牡蠣是溫暖性種類，在此海域不能自然產(chǎn)卵。在夏天的這幾個月的繁殖期，他們臨產(chǎn)卵時，味道、口感最好。熊本牡蠣具有順滑的質(zhì)地，甘甜的水果風味，爽滑而鮮甜，被牡蠣鑒賞家認為最有價值種類，同時也被人們稱為“西海岸最好的牡蠣品種”。隨著我國對牡蠣調(diào)查研究的深入，近幾年發(fā)現(xiàn)，我國南部海域的確有熊本牡蠣的分布。 2009 年杜玄等對

22、福建沿海巨蠣牡蠣主要種類及分布的調(diào)查，在福建泉州發(fā)現(xiàn)熊本牡蠣。等經(jīng)過多年取樣調(diào)查表明，南通東灶港小廟洪牡蠣礁作為中國現(xiàn)存最大的可露出海面的活牡蠣礁，其上分布有熊本牡蠣。 2 熊本牡蠣人工育苗研究 熊本牡蠣由于其個體小，在日本牡蠣市場，所占比例很小，隨著熊本牡蠣引進到美國，其經(jīng)濟效價值凸顯，人們才開始重視熊本牡蠣。熊本牡蠣人工育苗的基礎(chǔ)材料較少， 據(jù)報道，2008 年日本進行了熊本牡蠣人工育苗工作。近年來，國內(nèi)開展了熊本牡蠣人工育苗技術(shù)研究，并取得一定進展，但是熊本牡蠣人工育苗技術(shù)還很不成熟。除此以外， 苗種生產(chǎn)中還存在一些尚未解決的難題: (1) 親貝的促熟: 需進一步研究熊本牡蠣的繁殖生物學(xué)

23、，選擇合適的親貝入池溫度和時機，優(yōu)化培育餌料、 培育溫度等條件， 促進親貝性腺成熟; (2) 精卵排放: 目前牡蠣人工育苗常用的催產(chǎn)方法有解剖法、 自然排放法、陰干刺激法、流水刺激法、升溫刺激法或降低鹽度法等，這些方法并非對每一種牡蠣都能達到同樣的催產(chǎn)效果。也沒有文獻有關(guān)熊本牡蠣催產(chǎn)方式的描述，如何達到最佳催產(chǎn)效果需進一步的研究;(3) 不同溫度的生長速度與變態(tài)時間; (4) 養(yǎng)殖海區(qū)的選擇: 熊本牡蠣作為暖水性種類，其合適的養(yǎng)殖海區(qū)需要從鹽度、 生長速度、性腺發(fā)育等多方面考慮 第四節(jié) 本論文的研究的目的及意義 本研究的目的是探尋熊本牡蠣單體苗種生產(chǎn)和養(yǎng)殖生產(chǎn)的技術(shù)，為熊本牡蠣單體育苗技術(shù)的應(yīng)

24、用和推廣提供基礎(chǔ)材料。牡蠣作為分布廣、產(chǎn)量高的貝類，已成為我國沿海人民普遍喜愛的水產(chǎn)品。但由于牡蠣在夏季繁殖季節(jié)，尤其產(chǎn)卵排精后，肉質(zhì)、口感差，市場產(chǎn)量明顯降熊本牡蠣單體苗種生產(chǎn)和養(yǎng)殖技術(shù)的研究降低，不適合銷售，從而出現(xiàn) 8、9月牡蠣供應(yīng)不足的現(xiàn)象， 此階段被稱為牡蠣市場的“空白期”。熊本牡蠣生存在溫暖水域，與長牡蠣生殖周期不同，繁殖期晚兩個月左右。在美國俄勒岡州 Yaquina 灣，熊本牡蠣性成熟達到最高水平的時間為7月至10月，晚于長牡蠣(從 5 月 到 8月 )。 而且， 熊本牡蠣即使在繁殖期，還能保持其獨特的風味(Robinson, 1992)，可以填補牡蠣市場夏天的“空白期”，提升其

25、經(jīng)濟價值。 如圖 1-1B 熊本牡蠣雖個體小，但其形狀規(guī)則，殼質(zhì)的堅硬，質(zhì)地的順滑，甘甜的水果風味，被牡蠣鑒賞家認為最有價值，被稱為“西海岸最好的牡蠣品種”。在美國熊本牡蠣的價格是長牡蠣的兩倍，如圖 1-1A，每打長牡蠣大約,5.99 美元，熊本牡蠣的售價能達到 12.99 美元每打， 在我國熊本牡蠣的價格更高。熊本牡蠣軟體部所占比重大， 肥滿度高，頗受美國消費者喜愛。鑒于長牡蠣的成功引進，熊本牡蠣作為新的養(yǎng)殖品種具有很大潛力。 同時由于不健康養(yǎng)殖，長牡蠣有效群體減小和近親交配及種間雜交現(xiàn)象的日益加重， 導(dǎo)致長牡蠣遺傳多樣性下降，近年來出現(xiàn)的育苗成功率大大降低、生長速度慢、死亡率高、品質(zhì)差等問

26、題。因此，我國養(yǎng)殖牡蠣市場價格偏低(4-6元/千克，僅為國際價格的 1/100)，達不到牡蠣活體出口標準，嚴重影響我國牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。熊本牡蠣的推廣，可以改善牡蠣養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)降低養(yǎng)殖風險，并且有利于牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。 隨著生活水平提高，人們更加注重食品安全與品質(zhì)。單體牡蠣作為國內(nèi)新興消費種類，頗受國內(nèi)消費者喜歡，常出現(xiàn)在一些高端餐飲場所，并且價格昂貴。雖然我國在單體牡蠣人工育苗和養(yǎng)殖技術(shù)研究取得一定進展， 但單體牡蠣人工育苗和養(yǎng)殖技術(shù)還很不完善，沒有得到大規(guī)模推廣，單體牡蠣產(chǎn)量低，遠遠不能滿足市場需求?，F(xiàn)在國內(nèi)市場大部分單體牡蠣都是從美國、法國等其他國家進口， 供給量有限、 價格高

27、。 因此熊本牡蠣單體苗種生產(chǎn)和養(yǎng)殖技術(shù)的研究符合市場和生產(chǎn)的需要，具有 較高的研究意義和經(jīng)濟價值。 第二章 熊本牡蠣單體苗種培育 前言 單體牡蠣是一種單個游離、 無固著基的牡蠣。 通常在牡蠣幼蟲出現(xiàn)眼點即將開始附著變態(tài)時，對其進行一系列的處理，使之成為單個游離的牡蠣。單體牡蠣的形成方法主要有: 先固著后脫著基法、顆粒固著基采苗法、腎上腺素(EPI) 和去甲腎上腺素(NE) 處理法先固著后基法中常用的固著基為方便剝離降低死亡率，要求有一定彈性且價廉，如: 塑料板、聚丙烯扁條包裝條、塑料紙、篩絹網(wǎng)等。研究發(fā)現(xiàn)，當顆粒固著基粒徑與幼蟲變態(tài)時的殼長相仿時，此時獲得的單體率較高。 本研究以熊本

28、牡蠣人工育苗為為基礎(chǔ)，培養(yǎng)至眼點幼蟲時期，采用腎上腺素誘導(dǎo)、顆粒固著、先固著后脫離固著基三種方法對熊本牡蠣眼點幼蟲進行處理，生產(chǎn)熊本牡蠣單體苗種。第一節(jié) 熊本牡蠣幼體培育 1 材料1.1 熊本牡蠣親貝 實驗于2012年7月在山東萊州市煙臺海益苗業(yè)有限公司進行。熊本牡蠣(Crassostrea sikamea) 2012 年 7 月 29 日來自美國西海岸，共 100個體。清除殼表面附著物，挑揀貝殼無損傷個體，洗刷消毒后移入培育池培養(yǎng)。 1.2 藻種 小球藻( Chlorella vulgaris )、小新月菱形藻( Nitzschia closterium f.minutissima)、亞心形

29、扁藻(Platymonas subcordiformis)、球等鞭金藻 (Isochrysis galbana) 取自中國海洋大學(xué)。 1.3 主要試劑和藥物 土霉素(購于浙江國邦藥業(yè)有限公司) 青霉素鈉(有效成分含量 98%， 購于浙江國邦藥業(yè)有限公司) 億菌優(yōu)(主要成分為植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)氨基酸、生物酶、果糖核酸、多種微量元素和生長因子， 購于廣東綠百多生物科技有限公司) 2 方法 2.1 親貝促熟: 親貝暫養(yǎng)兩天， 挑出死貝， 移入培養(yǎng)池常溫促熟。 2.1.1 餌料 優(yōu)質(zhì)的餌料是親貝發(fā)育成熟的基礎(chǔ)，。餌料投喂量和種類也是關(guān)鍵因素。本實驗，以球等鞭金藻為主，混以小新月 ,菱形藻及適

30、量的螺旋藻和酵母等代用餌料。根據(jù)親貝攝食、水色、水溫、糞便和發(fā)育確定投喂量，投喂頻率 5 次左右/天。 2.1.2 水質(zhì)調(diào)節(jié) 保持水質(zhì)良好，是保證親貝性腺發(fā)育良好的重要措施。 養(yǎng)殖用水抽取自距海岸 100 米的海區(qū)，于沉淀池沉淀曝曬兩日，由砂濾池過濾后，經(jīng)管道流入車間使用; 換水與倒池: 每日換水三次， 每次換水 1/3; 每兩天倒池一次;適量充氣: 使用氣石充氣，充氣量大小適宜，使水面輕微泛起水波。吸污: 親貝發(fā)育成熟后，為減少對親貝的刺激，減少換水量，因此要通過吸污的方式清理池底的殘餌和糞便，頻率為 1 至 2 次/天。 2.1.3 光照強度 光照不超過 500勒克斯，工作外其他時間保持光

31、源關(guān)閉 2.1.4 病害防治 首先保證優(yōu)選親貝、合理投餌、保證水質(zhì)外，還應(yīng)根據(jù)水質(zhì)和攝食不定期投喂青霉素和土霉素等抗菌藥。 2.1.5 控制親貝流產(chǎn) 親貝促熟后期性腺發(fā)育成熟， 當外界環(huán)境變化劇烈時容易引起親貝大量流產(chǎn)， 可采取以下防控措施: 保持較高的換水量: 如果發(fā)現(xiàn)親貝輕微流產(chǎn)，此時不能盲目降低換水量，為盡可能減少對親貝的刺激，可減少每次換水量，但加大換水頻率，保證換水量 。 同時使用吸污的方法，即減少對親貝的刺激， 又能改善水質(zhì)。餌料投喂要堅持量少次多的原則: 投喂高品質(zhì)的單胞藻(濃度高、無雜菌)，由于藻液和培育水體在鹽度、溫度等差異大，降低藻液流入親貝蓄養(yǎng)池的量，防止培育池水體理化因

32、子大幅波動。同時保持餌料入池點與親貝之間的距離，以減少餌料對親貝的刺激。 換水時，注意水流要徐緩，換水口和入水口盡量與親貝保持一定距離，減少對親貝的流水刺激。 促熟后期充氣量要均勻、緩和，氣石不能直接放入親貝蓄養(yǎng)框內(nèi)，如有流產(chǎn)可停止充氣，待親貝穩(wěn)定后繼續(xù)通氣。待產(chǎn)前幾天，要定時觀察親貝狀況，遇到流產(chǎn)親貝，應(yīng)立刻揀出，防止流產(chǎn)物對親貝的強烈刺激。 2.2 催產(chǎn)、 受精孵化 常用的催產(chǎn)方法有: 自然排放發(fā)、 陰干流水刺激、 解剖法。 催產(chǎn)的時機: 當?shù)钩睾螅?有個別親貝少量排放精卵， 此時性腺發(fā)育基本達到成熟。 但此時還需要再培養(yǎng)兩到三天，保證性腺發(fā)育充分，排放精卵的同步性強。當少量雌貝頻繁產(chǎn)卵時

33、， 到達催產(chǎn)時機， 能夠獲得理想催產(chǎn)效果。催產(chǎn)時挑出排精的雄貝， 防止精子過多導(dǎo)致受精卵畸形率增高， 惡化水質(zhì)。顯微鏡下下觀察每個卵子周圍有 3-4 個活躍的精子即可。受精卵孵化，加入 EDTA，減少海水重金屬離子對受精卵影響。前期受精卵無游動能力， 為避免受精卵沉底缺氧死亡， 孵化時持續(xù)微量充氣， 同時每小時攪池一次。 2.3 幼蟲培育2.3.1 培育密度 幼蟲在受精17小時后孵化為D 形幼蟲，控制幼蟲密度 1-2 個/ml， 隨個體生長，可適當降低密度。 眼點幼蟲密度控制在 1 個/ml。 2.3.2 水質(zhì)調(diào)控 養(yǎng)殖用水加入1ppmEDTA 去除重金屬離子;每天使用砂濾海水換水 3 次，每

34、次換水 1/2 全量。 換水時注意控制水流速度， 并及時更換大網(wǎng)目的篩絹，避免幼蟲損傷。每四天倒池一次。倒池后培育池用高錳酸鉀消毒清洗。幼蟲培育期間充氣要均勻， 每個 25 方的培育池均勻放置 14 個氣石，充氣量以水面稍泛起水波為宜。 2.3.3 餌料 幼蟲變態(tài)為 D形幼蟲即開始投餌。前期投喂球等鞭金藻 (Isochrysis galbana)，逐漸混合一定比例小球藻(Chlorella vulgaris)，小球藻比例由20%逐漸提高，隨熊本牡蠣生長，培育后期以小球藻為主，并適量投喂亞心形扁藻(Platymonas subcordiformis)。 一般每天投喂 6 次，根據(jù)鏡檢幼蟲腸胃飽滿

35、度、水中殘餌情況和餌料濃度確定投喂量。餌料必須選用新鮮的高濃度藻液，每天投喂前要測量餌料密度及是否被原生動物等污染，減少外來原生動物及病原菌進入培育池。 2.3.4 病害防治 此外還要合理控制養(yǎng)殖密度，防止密度過高導(dǎo)致的惡化水質(zhì); 每天投喂10ppm 的光合細菌改善水質(zhì); 同時還要定期投喂 1-2ppm 青霉素鈉抑制細菌繁殖。 2.3.5 受精孵化測量: 所記錄的性狀: 1) 受精率、 2) 孵化率、 3) 胚胎發(fā)育過程、 4) 幼蟲殼高、殼長 受精率(%) =有第一極體出現(xiàn)的卵子/所有卵子×100; 孵化率(%) =孵化出的 D 形幼蟲/受精卵×100; 胚胎發(fā)育: 受精

36、后立即觀察記錄胚胎發(fā)育過程; 幼蟲期， 每天隨機取樣 20 個體觀察， 然后用魯格氏液固定，在顯微鏡下，測量其殼高、 殼長。2 結(jié)果（1）胚胎和幼蟲發(fā)育觀察: 8 月 14 日開始， 對實驗中獲得的受精卵進行胚胎和幼蟲發(fā)育觀察，測量其個體大小和發(fā)育時間特征， 結(jié)果見表 2-1 和圖 2-1。結(jié)果顯示: 各時期幼蟲外形特征明顯。 D 形幼蟲早期，殼高/殼長=0.8557: 1，隨幼蟲生長逐漸增大， 第三天殼高逐漸大于殼長，比值為 1.023:1，到第九天殼高與殼長的比值基本穩(wěn)定在 1.2:1。表明，形幼蟲期前期殼高生長明顯快于殼長，D形幼蟲后期殼高生長還是比殼長快，但生長速度相對較慢，進入殼頂初

37、期， 殼高與殼長比例相對穩(wěn)定， 殼高與殼長按 1.2: 1 的速度等比例生長。表 2-1: 熊本牡蠣胚胎和幼蟲發(fā)育情況 發(fā)育階段 時間 殼高×殼長(m) 發(fā)育特征 受精卵 0 60(卵經(jīng)) 受精膜輕微突起， 形成較窄的透明環(huán) 第一極體 12min 細胞質(zhì)均勻分布， 卵膜下突出形成一小的透明泡 第二極體 30min 在第一個透明泡位置又出現(xiàn)一透明泡 2 細胞期 60min 第一極葉伸出后縮回， 形成一大一小的分裂球 4 細胞期 1h35min 第二極葉伸出， 形成 4 細胞 8 細胞期 1h50min 形成 2 層小分裂球 16 細胞期 2h10min 形成三層小分裂球 32 細胞期

38、2h25min 個分裂球間的輪廓變得模糊 桑椹胚 2h50min 卵表面的凹凸層次進一步減弱 囊胚期 3h20min 魯格氏液處理后能夠看到胚胎表面布滿微絨毛， 已經(jīng)可以開始做圓周運動 擔輪早期 9h10min 體呈陀螺狀，頂端形成細長纖毛束和纖毛環(huán)，幼蟲有一定的游動能力擔輪后期 12h30min 游動能力明顯增強，有趨光性D形幼蟲期 14h10min 52x61 胚殼出現(xiàn)，伸出面盤，絞合線逐漸平直，殼高與殼長相差不明顯，殼長大于殼高。早期，殼高生長快于殼長。殼頂期 45d 83x76 殼頂隆起，左殼殼頂突出，殼高大于殼長；右殼生長較慢，使左右兩殼呈不對稱狀態(tài)；后期，足、腮等器官 逐漸出現(xiàn)稚貝

39、期 17-19d 380x360 生長速度明顯加快，出現(xiàn)次生殼；殼表形成明顯分界線。水溫 26.226.8（2） 形狀分析 受精率(%) =96.27% 孵化率(%) =93.84%（3）幼苗生長情況 圖表2-1顯示 D形幼蟲至眼點后期的殼高和殼長的變化，經(jīng)過17天的培養(yǎng)，殼高52um，殼長61um的D形幼蟲長至殼高382um、殼長312um的眼點幼蟲。幼蟲期生長速度相對較慢，總體隨著生長天數(shù)的增加生長速度加快。以殼高為例，D形幼蟲期平均日生長速度10um,從第五天起，早期殼頂幼蟲生長速度加快，平均日生產(chǎn)量20um，從第14天生長速度最快，平均日生長量30um。從圖中可以明顯發(fā)現(xiàn)殼高與殼長有逆

40、轉(zhuǎn)現(xiàn)象發(fā)生，在D形幼蟲期，剛孵化的D形幼蟲殼高小于殼長，但殼高生長速度快于殼長，第三天出現(xiàn)殼高與殼長相等，幼蟲繼續(xù)生長殼高大于殼長，這說明在熊本牡蠣浮游幼蟲期生長不屬于異速生長。第15天出現(xiàn)眼點。2-3天后，可以投放附著基，固著的幼蟲進入稚貝期，少量生長20天沒有附著的幼蟲，眼點黑而大，此時有些幼蟲足明顯而發(fā)達，能夠伸出殼在底部爬行。4 討論 熊本牡蠣卵為均黃卵，卵黃分布均勻，分裂方式為不等全裂，從第三次卵裂究進行螺旋分裂，在第1、2次分裂時有明顯的極葉伸出和縮回現(xiàn)象，其胚胎和D形幼蟲除胚胎大小外，形態(tài)基本和其他牡蠣科相同。 熊本牡蠣屬于暖水性種類，在渤海灣水域進行親貝培育，其產(chǎn)卵期較當?shù)亻L牡

41、蠣晚一個月。本實驗熊本牡蠣親貝促熟，以球等鞭金藻為主，小新月菱形藻為輔，同時投喂適量的螺旋藻和酵母，經(jīng)過一個月的培育，性腺發(fā)育好，流產(chǎn)量少，能夠大量自然排放。因此，常規(guī)牡蠣親貝促熟的餌料和操作技術(shù)適用于熊本牡蠣促熟，為人工育苗提供基礎(chǔ)。但是，親貝性腺發(fā)育控制不成熟，不能控制親貝精卵排放時間，為大規(guī)模生產(chǎn)帶來不便。第二節(jié) 熊本牡蠣單體苗種培育1 材料實驗用熊本牡蠣眼點幼蟲由室內(nèi)人工培育獲得2方法2.1腎上腺素（EPI）處理對單體熊本牡蠣的影響腎上腺素（EPI）母液的配制：（1）取500微升10摩爾鹽酸溶于0.1升水中，配成0.05M鹽酸。（2）將稱取好的336mg腎上腺素溶于0.1升0.05M鹽

42、酸配成腎上腺素母液，濃度為10-2mol/L;(3)將配置好的腎上腺素母液置于5下避光保存。 熊本牡蠣眼點幼蟲變態(tài)率=b/a（a為熊本牡蠣眼點幼蟲在待處理幼蟲中所占比例；b為腎上腺素處理熊本牡蠣幼蟲后稚貝在處理幼蟲中所占的比例） 幼蟲不固著變態(tài)判斷方法：幼蟲經(jīng)腎上腺素處理后，大部分幼蟲沉底失去浮游能力，經(jīng)1224小時培育，在顯微鏡下觀察，長出次生殼的幼蟲即為不固著變態(tài)的幼蟲。2.1.1 不同腎上腺素處理對單體熊本牡蠣誘導(dǎo)的影響（1） 不同腎上腺素濃度處理組：將腎上腺素母液與海水按一定比例配成10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L;10-6mol/L四種不同濃度梯度的腎上腺素

43、海水溶液。取4個25ml燒杯，分別加入配制好的四種溶液10ml，標上序號，置于暗處。每個燒杯分別加入2萬熊本牡蠣眼點幼蟲，處理一個小時，每隔10分鐘震蕩燒杯，防止幼蟲聚集缺氧死亡。1小時后將幼蟲放在200目的篩絹網(wǎng)上，用流水處理1個小時；將處理好的幼蟲分別置于5升水桶中充氣培養(yǎng)，第二天測量熊本牡蠣眼點幼蟲變態(tài)率。（2） 不同處理時間組將腎上腺素母液與海水按一定比例配制成10-4mol/L的腎上腺素海水溶液；取4個25ml燒杯，分別加入腎上腺素海水溶液10ml，標記1h、3h、5h、7h,置于暗處；每個燒杯分別加入2萬熊本牡蠣眼點幼蟲；分別按燒杯標記時間處理0.5h、1h、2h、4h，每隔10分

44、鐘震蕩燒杯，防止幼蟲聚集缺氧死亡；將腎上腺素處理后幼蟲放在200目是篩絹網(wǎng)上，用流水處理1小時；將處理好的幼蟲分別置于5升水桶中充氣培養(yǎng)，第二天測量熊本牡蠣眼點幼蟲變態(tài)率。（3） 不同處理苗量組將腎上腺素母液與海水按一定比例配制成10-4mol/L的腎上腺素海水溶液；取4個25ml燒杯，分別加入腎上腺素海水溶液10ml，做標記0.5萬、1萬、2萬、4萬，,置于暗處；每個燒杯按標記分別加入相應(yīng)的熊本牡蠣眼點幼蟲，每隔10分鐘震蕩燒杯，防止幼蟲聚集缺氧死亡；將腎上腺素處理后幼蟲放在200目是篩絹網(wǎng)上，用流水處理1小時；將處理好的幼蟲分別置于5升水桶中充氣培養(yǎng)，第二天測量熊本牡蠣眼點幼蟲變態(tài)率。2.

45、1.2 腎上腺素處理熊本牡蠣眼點幼蟲生產(chǎn)單體牡蠣根據(jù)不同腎上腺素處理組對單體牡蠣誘導(dǎo)效果,優(yōu)化腎上腺素處理組,包括腎上腺素濃度、每毫升處理眼點幼蟲量、吃了時間。2.2 不同附著基對單體熊本牡蠣誘導(dǎo)的影響（1） 聚乙烯波紋板：利用海參幼體附著用聚乙烯波紋板作為熊本牡蠣幼蟲的固著基。將波紋板用高錳酸鉀溶液消毒處理，在海水中浸泡2天后使用。把處理好的波紋板插入塑料框，每筐放10個，每兩層隔3cm，將插入波紋板的塑料框放入100L塑料大桶中。取10萬熊本牡蠣眼點幼蟲加入塑料桶，充氣培養(yǎng)。（2） 篩絹網(wǎng)：將廢舊的300目篩絹網(wǎng)，裁剪成30x20cm的長方形，在淡水中浸泡消毒。將篩絹網(wǎng)固定于盛放波紋板的塑

46、料框中，兩層間隔3cm，每筐有10片篩絹網(wǎng)。將固定篩絹網(wǎng)的塑料框放入100L塑料大桶，使篩絹網(wǎng)傾斜放置。取10萬熊本牡蠣眼點幼蟲加入塑料桶，充氣培養(yǎng)。（3） 塑料紙：分別剪裁30x20cm黑色和透明聚乙烯塑料紙各100張，在高錳酸鉀中消毒處理后，于海水中浸泡2天后。把處理好的塑料紙，以黑色和透明塑料紙間隔插入塑料框中，每筐兩層間隔3cm，每筐有10片篩絹網(wǎng)。將固定篩絹網(wǎng)的塑料框放入100L塑料大桶，使篩絹網(wǎng)傾斜放置。取10萬熊本牡蠣眼點幼蟲加入塑料桶，充氣培養(yǎng)。（4） 聚丙烯扁條包裝帶：將聚丙烯扁條包裝帶編織成40x30cm的簾子作為附著基，在高錳酸鉀中消毒處理后，于海水中浸泡2天后。把處理好

47、的簾子，懸掛于自制的支架上，每兩層間隔3cm，。放入100L塑料大桶，。取10萬熊本牡蠣眼點幼蟲加入塑料桶，充氣培養(yǎng)。（5） 尼龍繩:用高錳酸鉀將尼龍繩消毒處理,在海水中浸泡2天后使用.將處理好的尼龍繩剪裁成長30cm的短繩，大約60根為一簇，一端固定于小石塊墜入100L大塑料桶，另一端散開飄散在水中，每桶放置4簇尼龍繩。取10萬熊本牡蠣眼點幼蟲加入塑料桶，充氣培養(yǎng)。（6） 聚乙烯網(wǎng)片: 用高錳酸鉀將聚乙烯網(wǎng)片消毒處理，在海水中浸泡2天后使用。將處理好的網(wǎng)片一端固定上小石塊墜入100L塑料桶，每桶放置4片聚乙烯網(wǎng)片。取10萬熊本牡蠣眼點幼蟲加入塑料桶，充氣培養(yǎng)。2.3 顆粒固著基采苗法對熊本牡蠣誘導(dǎo)效果的影響2.3.1 貝殼粉 將扇貝殼和牡蠣殼粉碎后，用淡水浸泡消毒、清洗。分別用80目篩絹網(wǎng)和100目篩絹網(wǎng)過濾，留下80目篩下物，100目曬上午，保證貝殼粉粒度在400um左右，與熊本牡蠣眼點幼蟲大小相似，此時眼