基因工程的原理和技術(shù)

1、第二節(jié) 基因工程的原理和技術(shù)基因工程的原理和技術(shù)一、教學(xué)目標(biāo)：一、教學(xué)目標(biāo)：1.了解基因工程的基本原理。了解基因工程的基本原理。2.描述重組描述重組DNA技術(shù)的基本步驟。技術(shù)的基本步驟。二、教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：二、教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：基因工程的基本原理和基本操作步驟。基因工程的基本原理和基本操作步驟。一、基因工程的原理和操作步驟：一、基因工程的原理和操作步驟： 原理：讓人們感興趣的基因（目的基因）在原理：讓人們感興趣的基因（目的基因）在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定和高效表達(dá)。宿主細(xì)胞中穩(wěn)定和高效表達(dá)。 目的基因的獲??；目的基因的獲??； 形成重組形成重組DNA分子；分子； 重組重組DNA 導(dǎo)入受體細(xì)胞；導(dǎo)入受體細(xì)胞；

2、 篩選含有目的基因的受體細(xì)胞；篩選含有目的基因的受體細(xì)胞； 目的基因表達(dá)。目的基因表達(dá)。二、基因工程操作步驟：二、基因工程操作步驟：1.第一步：目的基因的獲取第一步：目的基因的獲?。?）方法：）方法： 從基因文庫(kù)中獲取目的基因從基因文庫(kù)中獲取目的基因 利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增目的技術(shù)擴(kuò)增目的基因基因（目的基因的序列已知）（目的基因的序列已知） 化學(xué)方法合成目的基因化學(xué)方法合成目的基因（目的基因的序列（目的基因的序列已知）已知） 從基因文庫(kù)中獲取目的基因從基因文庫(kù)中獲取目的基因基因文庫(kù)?；蛭膸?kù)。 利用利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在生

3、物體外復(fù)制特定聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在生物體外復(fù)制特定DNADNA片段的核酸合成技術(shù)。可以獲得大量的目的基片段的核酸合成技術(shù)。可以獲得大量的目的基因。因。循環(huán)循環(huán)變性變性退火退火延伸延伸目的基因目的基因的擴(kuò)增呈的擴(kuò)增呈指數(shù)指數(shù)形式形式擴(kuò)增（擴(kuò)增（2n）化學(xué)方法合成目的基因化學(xué)方法合成目的基因化學(xué)方法合成目的基因化學(xué)方法合成目的基因2 2、形成重組形成重組DNA分子分子 核心核心質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA分子分子限制酶處理限制酶處理兩個(gè)切口兩個(gè)切口獲得目的基因獲得目的基因DNADNA連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）同一種同一種一個(gè)切口一個(gè)切口兩個(gè)粘性末端兩個(gè)粘性末端3 3、將

4、重組、將重組DNADNA導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。（1 1）將重組）將重組DNADNA導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法（2 2）將重組）將重組DNADNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)顯微注射技術(shù)提純基因表達(dá)載體提純基因表達(dá)載體體外顯微注射入受精卵體外顯微注射入受精卵受精卵移植受精卵移植1.1.將重組將重組DNADNA導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍

5、法2.2.將重組將重組DNADNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)顯微注射技術(shù)（最多、最有效）（最多、最有效）3.3.將重組將重組DNADNA導(dǎo)入微生物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞Ca2+處理，處理，以增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性。以增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性?？拱逼S青霉素基因抗氨芐青霉素基因點(diǎn)為目的基因與點(diǎn)為目的基因與質(zhì)粒質(zhì)粒A的結(jié)合點(diǎn)的結(jié)合點(diǎn)目前把重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，效率還不高，導(dǎo)入完目前把重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，效率還不高，導(dǎo)入完成后得到的細(xì)菌，實(shí)際上有的根本沒(méi)有導(dǎo)入質(zhì)粒，有的導(dǎo)入成后得到的細(xì)菌，實(shí)際上有的根本沒(méi)有導(dǎo)入質(zhì)粒，有的導(dǎo)入的是普通質(zhì)粒的是普通質(zhì)粒A A，只有少數(shù)導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒。，只有少數(shù)

6、導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒。四環(huán)素抗性基因四環(huán)素抗性基因怎樣篩選出已經(jīng)導(dǎo)入質(zhì)粒的細(xì)胞？怎樣篩選出已經(jīng)導(dǎo)入質(zhì)粒的細(xì)胞？4.篩選含有目的基因的受體細(xì)胞篩選含有目的基因的受體細(xì)胞抗氨芐青霉素基因抗氨芐青霉素基因點(diǎn)為目的基因與點(diǎn)為目的基因與質(zhì)粒質(zhì)粒A的結(jié)合點(diǎn)的結(jié)合點(diǎn)四環(huán)素抗性基因四環(huán)素抗性基因在此基礎(chǔ)上，怎樣鑒別已導(dǎo)入重組質(zhì)粒的細(xì)胞？在此基礎(chǔ)上，怎樣鑒別已導(dǎo)入重組質(zhì)粒的細(xì)胞？抗氨芐青霉素基因抗氨芐青霉素基因點(diǎn)為目的基因與點(diǎn)為目的基因與質(zhì)粒質(zhì)粒A的結(jié)合點(diǎn)的結(jié)合點(diǎn)四環(huán)素抗性基因四環(huán)素抗性基因圖圖a a示基因工程中經(jīng)常選用的載體示基因工程中經(jīng)常選用的載體pBR322pBR322質(zhì)粒，質(zhì)粒，AmpAmpr r表示氨芐青

7、霉素抗表示氨芐青霉素抗性基因，性基因，TetTetr r表示四環(huán)素抗性基因。目的表示四環(huán)素抗性基因。目的基因如果插入基因如果插入四環(huán)素抗性四環(huán)素抗性基因中，將使該基因中，將使該基因失活，而不再具有相應(yīng)的抗性。基因失活，而不再具有相應(yīng)的抗性。abAmprTetrc再將滅菌絨布按到圖再將滅菌絨布按到圖b的培養(yǎng)基上，的培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布平使絨布面沾上菌落，然后將絨布平移按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，移按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖得到如圖c的結(jié)果（空圈表示與的結(jié)果（空圈表示與b對(duì)對(duì)照無(wú)菌落的位置）。照無(wú)菌落的位置）。 為了檢查載體是否導(dǎo)入原本沒(méi)有為了檢查載體是否導(dǎo)入原本沒(méi)有A

8、mpr 和和Tetr的大腸桿菌，將大的大腸桿菌，將大腸桿菌培養(yǎng)在含氨芐青霉素的培腸桿菌培養(yǎng)在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，得到如圖養(yǎng)基上，得到如圖b的結(jié)果（黑的結(jié)果（黑點(diǎn)表示菌落）。點(diǎn)表示菌落）。原理：質(zhì)粒上有抗生素的抗性基因原理：質(zhì)粒上有抗生素的抗性基因方法：利用方法：利用選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基篩選篩選檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入上是否插入了目的基因（關(guān)鍵）了目的基因（關(guān)鍵）檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)（表達(dá)）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)（表達(dá)）（2）常用的技術(shù)：）常用的技術(shù)：DNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)蛋白質(zhì)

9、分子（抗原抗體）間的雜交蛋白質(zhì)分子（抗原抗體）間的雜交5. 目的基因的表達(dá)目的基因的表達(dá)（1）內(nèi)容：）內(nèi)容：分子水平：分子水平：DNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)核心核心DNA探針探針目的基因的脫氧核苷目的基因的脫氧核苷酸（單鏈）序列片段酸（單鏈）序列片段用熒光分子用熒光分子或或放射性放射性同位素標(biāo)記同位素標(biāo)記看能否形看能否形成雜合的成雜合的雙鏈區(qū)雙鏈區(qū)檢測(cè)檢測(cè)鑒定鑒定檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒

10、定等抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定等過(guò)程過(guò)程:A.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNAB.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段片段( 單鏈單鏈)用放射性同位素等作標(biāo)記用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針以此做探針C.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶若顯示出雜交帶,表明目的基因已插入染色體表明目的基因已插入染色體DNA中中方法方法: : DNADNA分子雜交分子雜交方法方法: : 分分 子子 雜雜 交交方法方法: : 抗原抗體雜交抗原抗體雜交過(guò)程過(guò)程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交雜交,若出現(xiàn)雜若出現(xiàn)雜交帶交帶,

11、表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA.基因工程的基本操作程序目的基因的獲取目的基因的獲取形成重組形成重組DNADNA分子分子將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞篩選含有目的基因的受體細(xì)胞和目的基因表達(dá)篩選含有目的基因的受體細(xì)胞和目的基因表達(dá)1、從基因文庫(kù)中獲取目的基因、從基因文庫(kù)中獲取目的基因2、利用、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、化學(xué)方法人工合成、化學(xué)方法人工合成農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法、CaCa2+2+處理法處理法DNADNA分子雜交技術(shù)、抗原分子雜交技術(shù)、抗原抗體雜交技術(shù)抗體雜交技術(shù)分子檢測(cè)外的個(gè)體水平鑒定分子檢測(cè)外的個(gè)體水平

12、鑒定本節(jié)小結(jié)：1. 用基因工程技術(shù)可使大腸桿菌合成人的蛋用基因工程技術(shù)可使大腸桿菌合成人的蛋白質(zhì)。下列敘述不正確的是白質(zhì)。下列敘述不正確的是 A.常用相同的限制性?xún)?nèi)切酶處理目的基因和常用相同的限制性?xún)?nèi)切酶處理目的基因和質(zhì)粒質(zhì)粒 B.DNA連接酶和連接酶和 RNA聚合酶是構(gòu)建重組質(zhì)聚合酶是構(gòu)建重組質(zhì)粒必需的工具酶粒必需的工具酶 C.可用含抗生素的培養(yǎng)基檢測(cè)大腸桿菌中是可用含抗生素的培養(yǎng)基檢測(cè)大腸桿菌中是否導(dǎo)入了重組質(zhì)粒否導(dǎo)入了重組質(zhì)粒 D.導(dǎo)入大腸桿菌的目的基因不一定能成功表導(dǎo)入大腸桿菌的目的基因不一定能成功表達(dá)達(dá) B鞏固練習(xí)鞏固練習(xí)2下列屬于獲取目的基因的方法的是下列屬于獲取目的基因的方法的是

13、( )利用利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成反轉(zhuǎn)錄形成 從基因文庫(kù)中提取從基因文庫(kù)中提取從受體細(xì)胞中提取從受體細(xì)胞中提取 利用利用PCR技術(shù)技術(shù) 利用利用DNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 人工合成人工合成A B CDD3.基因工程又叫基因拼接技術(shù)?；蚬こ逃纸谢蚱唇蛹夹g(shù)。 (1)在該技術(shù)中，用人工合成方法獲得目的基因的途徑之在該技術(shù)中，用人工合成方法獲得目的基因的途徑之一是：以目的基因轉(zhuǎn)錄的一是：以目的基因轉(zhuǎn)錄的 為模板，為模板， 成互成互補(bǔ)的單鏈補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成，然后在酶的作用下合成 。 (2)基因工程中常用的受體細(xì)胞有細(xì)菌、真菌、基因工程中常用的受體細(xì)胞有細(xì)菌、真菌、 。 (3)假設(shè)以大腸桿菌質(zhì)粒

14、作為載體，并以同一種限制性?xún)?nèi)假設(shè)以大腸桿菌質(zhì)粒作為載體，并以同一種限制性?xún)?nèi)切酶切割載體與目的基因，將切割后的載體與目的基因切酶切割載體與目的基因，將切割后的載體與目的基因片段混合，并加入片段混合，并加入DNA連接酶。連接產(chǎn)物至少有連接酶。連接產(chǎn)物至少有 種環(huán)狀種環(huán)狀DNA分子，它們分別分子，它們分別 是是 。信使信使RNA 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄 雙鏈雙鏈DNA(目的基因目的基因)動(dòng)植物細(xì)胞動(dòng)植物細(xì)胞 3 載體自連的、目的基因片段自連的、載體自連的、目的基因片段自連的、載體與目的基因片段相連的環(huán)狀載體與目的基因片段相連的環(huán)狀DNA分子分子 目的基因與質(zhì)粒的連接目的基因與質(zhì)粒的連接 基因基因DNADNA文

15、庫(kù)的構(gòu)建文庫(kù)的構(gòu)建 將總將總DNADNA經(jīng)過(guò)酶解，分離不同長(zhǎng)短的經(jīng)過(guò)酶解，分離不同長(zhǎng)短的DNADNA片段。包片段。包含的基因片段分別克隆在質(zhì)?；蚴删w載體上，感染含的基因片段分別克隆在質(zhì)?；蚴删w載體上，感染細(xì)菌或體外包裝到噬菌體顆粒上便構(gòu)成了該生物的基細(xì)菌或體外包裝到噬菌體顆粒上便構(gòu)成了該生物的基因文庫(kù)。因文庫(kù)。DNADNA分子雜交示意圖分子雜交示意圖 采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNADNA分子的單分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙那么，互補(bǔ)的

16、堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒(méi)有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離鏈區(qū)；在沒(méi)有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。的單鏈。 基因探針（基因探針（DNA探針）與目的基因雜交，有無(wú)探針）與目的基因雜交，有無(wú)雜交帶雜交帶 傳統(tǒng)的遺傳育種方法有哪些？ 傳統(tǒng)的遺傳育種方法能否解決不同種生物優(yōu)良性狀的重組問(wèn)題？ 基因工程技術(shù)如何解決不同種生物優(yōu)良性狀的重組問(wèn)題？基因工程的應(yīng)用基因工程的應(yīng)用基因工程的應(yīng)用基因工程的應(yīng)用一、基因工程與作物育種一、基因工程與作物育種二、基因工程與疾病治療二、基因工程與疾病治療（）基因工程藥物（）基因工程藥物（2 2）基因診斷）基因診斷（3 3）基因治療）基因

17、治療三、三、 基因工程與環(huán)境保護(hù)基因工程與環(huán)境保護(hù)基因工程的應(yīng)用基因工程的應(yīng)用一、基因工程與作物育種一、基因工程與作物育種1.抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物2.抗病轉(zhuǎn)基因植物抗病轉(zhuǎn)基因植物3.其他抗逆轉(zhuǎn)基因植物其他抗逆轉(zhuǎn)基因植物（如抗鹽、抗旱、抗除草劑植物等）（如抗鹽、抗旱、抗除草劑植物等）4.利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)基因工程在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用：基因工程在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用：1 1）高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和具優(yōu)良品質(zhì)的品種）高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和具優(yōu)良品質(zhì)的品種2 2）抗逆性品種）抗逆性品種基因工程與疾病治療基因工程與疾病治療v 基因工程藥品的生產(chǎn)基因工程胰島素基因工程胰島素 胰島素是治療糖尿病的胰島素

18、是治療糖尿病的特效藥，長(zhǎng)期以來(lái)只能特效藥，長(zhǎng)期以來(lái)只能依靠從豬、牛等動(dòng)物的依靠從豬、牛等動(dòng)物的胰腺中提取，胰腺中提取，100Kg100Kg胰胰腺只能提取腺只能提取4-5g4-5g的胰島的胰島素，其產(chǎn)量之低和價(jià)格素，其產(chǎn)量之低和價(jià)格之高可想而知。之高可想而知。基因工程胰島素基因工程胰島素 將合成的胰島素基因?qū)⒑铣傻囊葝u素基因?qū)氪竽c桿菌，每入大腸桿菌，每2000L2000L培養(yǎng)液就能產(chǎn)生培養(yǎng)液就能產(chǎn)生100g100g胰胰島素！大規(guī)模工業(yè)化生島素！大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)不但解決了這種比黃產(chǎn)不但解決了這種比黃金還貴的藥品產(chǎn)量問(wèn)題金還貴的藥品產(chǎn)量問(wèn)題，還使其價(jià)格降低了，還使其價(jià)格降低了30%-50%!30%-50%!基因工程干擾素基因工程干擾素 干擾素治療病毒感染簡(jiǎn)直是干擾素治療病毒感染簡(jiǎn)直是“萬(wàn)能靈藥萬(wàn)能靈藥”！過(guò)去從人血中提取，過(guò)去從人血中提取，300L300L血才提取血才提取1mg1mg！其其“珍貴珍貴”程度自不用多說(shuō)。程度自不用多說(shuō)。SCID的基因工程治療的基因工程治療 重癥聯(lián)合免疫缺陷（重癥聯(lián)合免