脂類細胞化學--蘇丹Ⅲ染色法實驗報告

1、 山東大學實驗報告 2015年 3 月 12 日姓名 班級 13級生命基地班 學號 同組者： 科目 細胞生物學實驗 實驗題目 脂類細胞化學-蘇丹III染色法 【實驗題目】 脂類細胞化學-蘇丹III染色法【實驗目的】1.  了解脂肪染色的原理、掌握脂類標本制片； 2.  學習用蘇丹III染色法進行脂肪細胞的染色技術； 3. 學會用斷頭法處理小白鼠以及小白鼠的解剖方法。【實驗材料與用品】 1. 試劑：蘇丹染液、70%乙醇溶液、甲醛鈣  2. 器具：顯微鏡，載玻片，蓋玻片，膠頭滴管，鑷子，剪刀，解剖盤  3.&

2、#160;材料：小白鼠【實驗原理】 脂類包括的范圍很廣，有單純脂、復合脂、衍生脂等。脂肪依其性質可分為中性脂肪、脂肪酸、膽固醇、鞘磷脂以及其他類脂質。脂肪是體內儲存能量和供給能量的重要物質。很多細胞都含有脂肪，游離狀態(tài)的脂肪呈小滴狀懸浮于細胞質內，比較顯著的如肝細胞。脂肪小滴可以集合，將細胞質及細胞核擠到一旁，如脂肪細胞。 脂肪與類脂類和蛋白質結合時，往往不易顯出，但用重鉻酸鉀、升汞、硝酸鈷或硝酸鈾氧化組織塊或切片，可以顯現(xiàn)出脂肪和類脂類。 脂類不溶于水，易溶于濃乙醇、苯、氯仿和乙醚等，因此脂類標本的制作，需用不含酒精或不能溶脂的液體固定，一般常用甲醛類固定劑。  脂溶性染料顯示法利

3、用蘇丹染料中的蘇丹III、蘇丹IV、蘇丹黑或者蘇丹紅等溶于脂類，而使脂類顯色的原理顯示脂類，使用時，要注意選擇溶劑，要求既要溶解蘇丹染料，又不溶掉脂肪。 蘇丹染料是偶氮染料，它對脂類的顯示是一種簡單的物理變化。 蘇丹染料也是一種脂溶性染料，易溶于乙醇但更易溶于脂肪，所以當含有脂肪的標本與蘇丹染料接觸時，蘇丹染料即脫離乙醇而溶于該含脂肪結構中而使其顯色。  脂肪染料一般選用有機溶劑做溶劑，丙酮和乙醇對染料和脂肪都是很好的溶劑，這樣可以染色大的脂肪積累塊，但是小的脂肪滴會溶解。60%異丙醇當溶劑，可以減輕脂類的溶解。丙二醇或磷酸三乙酯不會溶解脂類物質，但是能溶解染料，

4、是比較理想的溶劑。用這些溶劑配的染料溶液要過濾以去掉沉淀，防止蒸發(fā)，因蒸發(fā)會引起染料在材料中積累。常用相同溶劑洗掉多余的染料，然后再用水洗，可以防止多余的染料在材料中沉淀。  用鋨酸固定的脂肪不溶于無水乙醇、二甲苯等類似的液體，可用于石蠟切片，但是脂肪的標本一般不用石蠟切片或火棉膠包埋，而用如下方法： 冰凍切片、明膠包埋冰凍切片、鋪片法。【實驗步驟】 1、 大體流程處死小鼠找腸系膜甲醇鈣固定（20min) 制作裝片 蘇丹染色（30min)70%乙醇溶液 沖洗蒸餾水沖洗 鏡檢2、 具體操作1、  斷頭法處死小白鼠，置于解剖盤中，剪開腹腔，用鑷子提起小腸將蓋玻片緊貼于

5、腸系膜， 并在其下部置一載玻片，用剪刀將腸系膜連同小腸一同剪下。 2、  滴加甲醛鈣于有標本的載玻片處，使標本潤濕，固定20分鐘。3、  吸蒸餾水滴入載玻片與蓋玻片之間沖洗，用滴管不斷吸去液體以去除固定液。4、  用70%乙醇溶液代替蒸餾水重復步驟2的操作，再進行一次沖洗。 5、  用蘇丹染色30分鐘。 6、吸去溢出染液，擦凈蓋玻片表面及周邊，用顯微鏡觀察?！緦嶒灲Y果與分析】 I. 單個脂肪細胞是圓球形，內充滿桔紅（黃）色脂類物質。 圖1: 10×10II. 觀察到的細胞染色較淺，可能是滴加染液時進入到蓋玻片以下的

6、蘇丹III染液的量偏少，或者是用蒸餾水沖洗后沒有用酒精沖洗干凈，不利于染色。此外，觀察到的細胞有些不是一層，而是多層細胞重疊在一起，可能是取腸系膜時，沒有將腸系膜展平，導致腸系膜聚集在一起。 圖2: 10×40III. 細胞核呈指環(huán)狀偏靠細胞膜邊緣，細胞外也有散在的脂肪滴。但大部分細胞內的脂肪滴已完全充滿整個細胞，可能是觀察的時間拖得過長。單個細胞的染色效果不明顯，可能是染色時間不足。 圖3： 10×40【注意事項】1. 小鼠腸系膜很脆弱，易破損，因此找腸系膜時應盡量小心，以免將腸系膜扯破；2. 要找有血管的腸系膜，因為血管周圍一般有脂肪組織保護；3. 制作裝片時盡量用蓋玻

7、片撐開腸系膜，可以將小腸連同腸系膜一起剪下來；4. 不要用力按壓蓋玻片，以免壓破脂肪細胞，影響觀察；5.染色時間要足夠長，否則會染色不徹底，橘紅色不明顯；6.在染色過程中，要防止裝片干燥，隨時添加蘇丹III染液，防止影響實驗結果；7.在進行觀察之前，應當用吸水紙盡可能地吸取染液后再進行觀察，這樣只有脂肪細胞呈橘 紅色，對比較明顯。 附： 課外拓展知識 1、 石蠟切片制備石蠟切片的制作過程主要包括：取材 固定 脫水 透明 透蠟 , 封藏 透明 染色 貼片 切片 包埋1取材 材料的好壞直接影響到切片的質量,無論取哪一種動植物材料,以下幾點是必須注意的.（1）植物材料選擇時須盡可能不損傷植

8、物體或所需要的部分；動物材料取用時常對動物施以 麻醉,常用的麻醉劑有氯仿和乙醚,或將動物殺死后迅速取出所需要的組織.（2）取材必須新鮮,這一點對于從事細胞生物學研究尤為重要,應該盡可能割取生活著的組織 塊,并隨即投入固定液.（3）切取材料時刀要銳利,避免因擠壓細胞使其受到損傷.（4）切取的材料應該小而薄,便于固定劑迅速滲入內部.一般厚度不超過2mm,大小不超過 5×5mm2.2固定 組織和細胞離開機體后,在一定時間內仍然延續(xù)著生命活動,會引起病理變化直至歸于死亡.為了使標本能反映它生前的正常狀態(tài),必須盡早地用某些化學藥品迅速地殺死組織和細胞,阻抑上述變化,并將結構成分轉化為不溶性物質

9、,防止某些結構的溶化和消失.這種處理就是固定.除了上述作用外,固定劑會使組織適當硬化以便于隨后的處理,還會改變細胞內部的折射系數并使某些部分易于染色.固定劑的作用對象主要是蛋白質,至于其他成分如脂肪和糖,在一般制作時不加考慮,如要觀察這些物質,可用特殊的方法將其固定下來。固定劑有簡單固定劑和混合固定劑的劃分。 簡單固定劑即單一的固定劑,常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸.其中,苦味酸、升汞、鉻酸既能凝固細胞清蛋白,又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白,而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、餓酸和重鉻酸鉀對這兩種蛋白質都不凝固。簡單固定劑的局限性較大,如將其適當混合,制成復合固定

10、劑可以取得更好的效果。常用的混合固定劑有：Bouin液（70份苦味酸飽和水溶液+25份4甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（升汞5g重鉻酸鉀2.5g硫酸鈉1.0g5ml冰醋酸100ml蒸鎦水）、Carnoy改良液（3份無水乙醇+1份冰醋酸）等.固定劑的種類甚多,我們必須依據各種固定劑的性能及制片的不同要求來加以選擇。固定時,須注意以下幾點：（1）固定劑應有足夠的量,一般為組織塊體積的1015倍.（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物質,可將材料先在含乙醇的溶液中固定幾分鐘,再移 入水溶性的固定液.（3）材料固定后如不立即下沉,可將其中氣泡抽出.（4）固定時間依材料大小、固定劑種類而異,可從1小

11、時到幾十小時,有時中間需要更新固定 劑.某些固定劑對組織的硬化作用較強,作用時間應嚴加控制,不能過長.（5）一般固定劑都以新配制的為好,用過的不能再用.有些混合固定劑由甲、乙兩液合并者, 一定要在使用前才混合.（6）固定完畢,根據所用固定劑的不同,用水或乙醇沖掉殘留的固定劑,以免固定劑形成沉淀, 影響以后組織塊的染色.3脫水 .脫水劑有兩類：一類是非石蠟溶劑,如乙醇、丙酮等,脫水后必須再經過透明,才能透蠟包埋； 另一類是兼石蠟溶劑,如正丁醇,脫水后即可直接透蠟。 常用的脫水劑是乙醇,因為它價格便宜,易于得到。為了避免劇烈的擴散引起的組織的強烈收縮,脫水步驟應從低到高以一定的濃度梯度來進行,一般

12、組織從30乙醇開始,經過50、70、80、95、100至完全脫水；對于一些柔軟的組織應從15開始.脫水時間依據組織的類型和大小而定，一般各級乙醇中放置45min到1h，如果中間須停頓，應使材料停留在70乙醇中,因為低濃度乙醇易使組織變軟、解體,高濃度乙醇有脆化組織作用,放置時間不能過長,另外,脫水必須在有蓋瓶中進行,以防止高濃度乙醇吸收空氣中水分導致濃度降低而使脫水不徹底.需要保存的材料可脫水至70%乙醇時停留其中,如需長期保存,可加入等量的甘油. 4透明 組織塊用非石蠟溶劑脫水后必須經過透明.透明劑能同時與脫水劑和石蠟混合,它取代了脫水劑后,石蠟便能順利地滲入組織。 透明劑的種類很多,較常用

13、的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。5透蠟和包埋 包埋用的石蠟,熔點在5060之間,應根據材料本身的硬度、切片的厚薄和當時的氣溫條件來選用.一般動物材料最常用的石蠟熔點為5256,植物材料的用5458的；切片薄的用5860的,切片厚的則用5254的；室溫1019時選用5254的石蠟可順利切片,冬季可用熔點4648的石蠟,夏季可選5658的. 透蠟須在恒溫箱中進行,恒溫箱的溫度調節(jié)至高于石蠟熔點3度,使經過透明的組織塊依次用石蠟與二甲苯的等量混合液、純石蠟處理.純石蠟應處理23次,透蠟的時間依材料性質而定,一般每次需1530min。 包埋具體做法；先準備好紙盒，,將熔蠟倒入盒內,迅速用

14、預溫的鑷子夾取組織塊平放在紙盒底部,切面朝下,再輕輕提起紙盒,平放在冷水中,待表面石蠟凝固后立即將紙盒按入水中,使其迅速冷卻凝固,30min后取出。 包埋用蠟的溫度應略高于透蠟溫度,保證組織塊與周圍石蠟完全融為一體.石蠟的迅速冷卻也很重要,否則包埋塊中將會產生結晶.以后切片時引起碎裂。6切片 在包埋以后,就可進行切片.包埋好的石蠟塊裝上切片機進行切片前還須進行固著和整修. 切片方法： 切片前,將刀口置放大鏡下觀察,選擇刀口平整無缺刻的部分來進行切削.將所要切的包埋塊固定在標本臺上,使包埋塊外切面與標本夾截面平行,并讓包埋塊稍露出一截.將刀臺推至外緣后松開刀片夾的螺旋,上好刀片,使切片刀平面與組

15、織切面間呈15°左右的夾角,包埋塊上下邊與刀口平行.在微動裝置上調節(jié)切片要求的厚度,將刀臺移至近標本臺處,讓刀口與組織切面稍稍接觸,這時就可以開始切片了。具體操作：右手轉動轉輪,左手持毛筆在刀口稍下端接隹切好的片子,并托住切下的蠟帶,待蠟帶形成一定長度后,右手停止轉動,持另一枝毛筆輕輕將蠟帶挑起,平放于襯有黑紙的紙盒內,注意切片速度不宜太快,搖動轉輪用力應均勻,防止切片機震動厲害引起切片厚薄不均勻,還應注意轉動的方向,以防標本臺后移而切不到片子.切片完畢,應及時用氯仿將切片機的有關部分擦凈。7貼片 切好的切片必須貼附于載玻片上才能作進一步處理,但是切片常有細小的橫紋,必須經展平后才能

16、貼附,否則影響染色和觀察.貼片一般有撈片法和燙板法. 撈片法：首先將切片分割開,投入到48的溫水浴中,這時切片都浮在水面上,由于表面張力的作用使切片自然展平,然后用涂有甘油蛋白溶液（將雞蛋一個打破入杯中,去除蛋黃留下蛋白,用筷子充分調打成雪花狀泡沫,然后用雙層紗布過濾至容器中,加入等量的甘油,混合,最后加入百分之一體積的麝香草酚（thymol）作防腐用,可保存幾個月到一年.）或5明膠水溶液的載玻片傾斜著插入水面去撈取切片,使切片貼附在載玻片的合適位置,于室溫下放置一晝夜后使其徹底干燥。 燙板法：是將涂有粘片劑的載玻片上涂上水,把已分割好的切片貼上去,再置載玻片于35恒定的燙板上讓切片攤干,并傾

17、斜或用吸水紙吸去水分,最后將載玻片再度放燙板上晾干.要注意,不管是使用撈片法還是燙板法,所用的載玻片必須潔凈,不能有油污（檢驗法：已涂有粘片劑的載玻片上滴加數滴蒸餾水,若發(fā)現(xiàn)水不均勻分散而聚成滴狀,即表示載玻片不清潔,有殘留油脂等物在上面）；切片的光面應朝下,否則染色過程中切片容易脫落。8染色 染色方法很多,但是染色劑往往是水溶液,因此切片必須經過脫蠟而再度復水.這方法即為脫水、透明的逆過程。由于切片十分薄,處理的時間大大減少,一般每級停留約25min。 染色是一個復雜的過程,研究細胞器和細胞內的重要組分都有很多現(xiàn)成的方法，例如顯示DNA的Feulgen反應,顯示RNA的Brachet反應,顯

18、示多糖的PAS反應,顯示蛋白質的Millon反應和顯示某些酶的鈣鈷法等,可以根據不同的要求來選用。9透明 染色后的切片須再次經過脫水、透明.標本經二甲苯透明后,折射率改變,透明度提高,使得染上色的部位更清晰地顯示出來。10封藏 封藏的目的是使制成的切片能夠永久保存,封藏劑必須能與透明劑互溶,對染色無影響,折射率近似玻璃和具有粘性的物質,常用的封藏劑有加拿大樹膠和中性樹膠。 封片方法：將載玻片從二甲苯中吸出后,吸去多余的二甲苯,在標本上的二甲苯尚未干透之前加一滴樹膠,仔細覆蓋上蓋玻片,避免產生氣泡,也不得拖動蓋玻片,以免將標本破壞.樹膠量視蓋玻片大小而定,勿使過多過少。貼上標簽,注明材料、染色法

19、,待封藏劑凝固后便成為一張石蠟切片.2、 糖類細胞化學Ø PAS法顯示糖類 原理：過碘酸能使細胞內的多糖乙二醇基氧化成二醛，再與Schiff氏液的無色品紅結合， 紅色，定位于胞漿上。 結果：PAS陽性為紅色，細胞核藍色。三、核酸細胞化學Ø Feulgen反應法 原理：標本經稀鹽酸水解后，DNA分子中的嘌呤堿基被解離，從而在核糖的一端出現(xiàn)了醛基。Schiff試劑中的無色品紅可與醛基反應，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基為發(fā)色團，故可呈現(xiàn)出紫紅色。DNA經稀酸水解后產生的醛基，具有還原作用，可與無色品紅結合形成紫紅色化合物，從而顯示出DNA的分布。Ø 甲基綠-派洛寧

20、法 原理：甲基綠派洛寧（methyl green-pyronin）為堿性染料，它分別能與細胞內的DNA、RNA結合呈現(xiàn)不同顏色。當甲基綠與派洛寧作為混合染料時，甲基綠與染色質中DNA選擇性結合顯示綠色或藍色；派洛寧與核仁、細胞質中的RNA選擇性結合顯示紅色。其原因可能是兩種染料的混合染液中有競爭作用，同時兩種核酸分子都是多聚體，而其聚合程度有所不同。甲基綠易與聚合程度高的DNA結合呈現(xiàn)綠色。而派洛寧則與聚合程度較低的RNA結合呈現(xiàn)紅色（但解聚的DNA也能和派洛寧結合呈現(xiàn)紅色）。即RNA對派洛寧親和力大，被染成紅色，而DNA對甲基綠親和力大，被染成綠色。Ø Giemsa染色法 原理：Giemsa染液由天青，伊紅組成，染色原理和結果與瑞特染色法基本相同。 嗜酸性顆粒堿性蛋白質，與酸性染料伊紅結果染成粉紅色，稱為嗜酸性物質； 細胞核蛋白和淋巴細胞胞漿為酸性，與堿性染料美藍或天青結合染成紫藍色，稱為 嗜堿性物質； 中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍均可結合，染淡紫色，稱為中性物質。 結果：MGG染色將細胞核染成紫紅色，細胞質和核仁染成藍紫色。Ø 蘇木精-伊紅（HE)染色原理：DNA兩條鏈上的磷酸基向外，帶負電荷呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性 染料以離子鍵結合而被