1株油茶真菌病害拮抗菌株的篩選鑒定及其拮抗作用

1、1 株油茶真菌病害拮抗菌株的篩選鑒定及其拮抗作用收稿日期： 2016-04-24基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31200488）；湖北省教育廳中青年人才項(xiàng)目（編號(hào)：Q20152707）；湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：D20102704）；特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：2016K07）。芽孢桿菌（ Bacillus）是一類(lèi)理想的生防菌，在目前生防細(xì)菌中研究較多。周盈等報(bào)道了1 種對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌具有抑菌活性的枯草芽孢桿菌BSn5及其產(chǎn)生的抑菌蛋白APn5，但該菌只能拮抗胡蘿卜軟腐歐文氏菌亞種，其生防范圍較窄 3 。劉君昂等公開(kāi)了1 種拮抗油茶病害的短芽孢桿菌

2、Z26，它能有效抑制油茶炭疽病病菌、根腐病病菌、半邊瘋病菌等病原菌的生長(zhǎng)，該生防菌劑對(duì)油茶炭疽病的最大抑制率達(dá)到 83.4%4 。陳瓊珍等利用枯草芽孢桿菌對(duì)有害真菌的生防作用及最佳發(fā)酵條件進(jìn)行研究，結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌只對(duì)紅鐮刀菌的拮抗作用明顯 5 。目前，關(guān)于解淀粉芽孢桿菌能同時(shí)在油茶主要真菌性病害及細(xì)菌性軟腐病上的防治研究及應(yīng)用報(bào)道較少。本研究從油茶根部土壤分離獲得1 株能拮抗油茶主要病害真菌的解淀粉芽孢桿菌D2WM。采用平板對(duì)峙法和發(fā)酵培養(yǎng)法研究該拮抗菌對(duì)油茶6 種病害真菌的拮抗作用。另外，使用管碟法測(cè)定該拮抗菌的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)細(xì)菌性軟腐病病菌的拮抗作用。最后本研究對(duì)拮抗菌發(fā)酵菌液的理化性

3、質(zhì)進(jìn)行了初步研究，為油茶真菌病害及蔬菜細(xì)菌性軟腐病的無(wú)公害防治提供了一定的理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。1 材料與方法1.1試驗(yàn)材料菌株來(lái)源：油茶炭疽病病菌（Colletotrichumnicotianae）、油茶膠孢炭疽病病菌 （ C. gloeosporioides）、油茶葉斑病病菌（Phyllosticta capitalensis）、油茶軟腐病病菌（Agaricodochium camellia）、油茶黑斑病病菌（ Altermaria alternate）、油茶潰瘍病病菌（ Bothyosphaeria dothidea ），均分離自湖北孝感大悟油茶林地；胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜亞種 （ Er

4、winia carotovorassp. carotovora）、胡蘿卜軟腐歐文氏菌黑脛亞種（E.carotovora ssp. atroseptica）、菊歐文氏菌（E.chrysanthemi），均分離自湖北孝感當(dāng)?shù)厥卟颂镏懈癄€的蔬菜。所有菌株均保存于湖北工程學(xué)院特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。1.2培養(yǎng)基 6 及主要試劑和儀器LB 培養(yǎng)基（篩選培養(yǎng)基） ：1 L 中含有 10 g 蛋白胨、 5 g 酵母粉、 10 g NaCl 、 15 20 g 瓊脂， pH 值 7.0 7.2 ，用去離子水調(diào)至總體積為1 L ；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（分離培養(yǎng)基）：1 L 中含有 3.0 g 牛肉膏

5、， 10.0 g 蛋白胨， 5.0 g NaCl，15.0 g 瓊脂，pH 值 7.2 7.4 ，用去離子水調(diào)至總體積為1 L。上述培養(yǎng)基分裝后于121 滅菌20 min ，備用。DNA凝膠回收試劑盒、PCR反應(yīng)用的各種試劑，均購(gòu)自生工生物工程 （上海）股份有限公司； 蛋白胨、酵母粉、NaCl、瓊脂等，均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。1.3拮抗菌的篩選、分離及拮抗作用研究采用稀釋分離法7 從油茶根部土壤分離拮抗細(xì)菌，取10 g健康油茶根際土樣加入到盛有90 mL無(wú)菌水和玻璃珠（直徑0.5 cm，每瓶3050個(gè)）的三角瓶中，在28 、180 r/min搖床中振蕩20 min后，將菌懸液放

6、置在80 水浴中保持15 min 。將1 mL 土壤懸浮液移入盛有9 mL 無(wú)菌水的試管中， 制成 10-1 菌懸液，依此類(lèi)推， 獲得 10-2 、10-3 、 10-4 、10-5 、 10-6 菌懸液。梯度稀釋后，吸取 100 L稀釋度為 10-6 10-3 的菌懸液均勻涂布在分離培養(yǎng)基上，將涂布有菌懸液的平板置于30 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h 后觀察分離培養(yǎng)基上菌落的狀態(tài)，用三步劃線法進(jìn)行分離純化，統(tǒng)一編號(hào)登記。接種斜面后，可在4 短暫保藏，用50%甘油作為保護(hù)劑，可在- 80 長(zhǎng)久保藏。采用平板對(duì)峙法8 篩選能同時(shí)拮抗各油茶病原真菌的拮抗細(xì)菌， 將直徑為 7 mm的病原菌餅置于 PDA平

7、板中心， 然后用無(wú)菌牙簽蘸取待測(cè)菌，于等距離點(diǎn) （距平板中央1.5 cm）接拮抗菌， 置于 28 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，5 d 后觀察抑菌帶的大小，每個(gè)處理重復(fù)3 次，篩選抑菌帶寬大于5 mm的菌株。將初篩有拮抗作用的菌株在LB 液體培養(yǎng)基中于150r/min適溫培養(yǎng) 24 h，發(fā)酵菌液以8 000 r/min 離心 10 min，上清用0.22m微孔濾膜過(guò)濾至滅菌EP管中。將初篩拮抗菌濾液與約50 的PDA固體培養(yǎng)基按體積比1 19混勻后倒入培養(yǎng)皿，冷卻后在平板中央放入直徑為7 mm的油茶病原真菌菌餅，以無(wú)菌水為對(duì)照，每個(gè)處理3 次重復(fù)，5 d后測(cè)量病原菌菌落直徑。無(wú)菌濾液抑菌率=（對(duì)照菌落直徑-

8、處理菌落直徑）/ （對(duì)照菌落直徑-0.7 ）× 100%。采用平板對(duì)峙法分析拮抗菌對(duì)真菌主要病害的拮抗作用 8 ：將打好的直徑為 7 mm的油茶炭疽病等病原菌菌餅置于 PDA平板中心，然后用無(wú)菌牙簽蘸取待測(cè)菌，于等距離點(diǎn)（距平板中央 1.5 cm ）接拮抗菌，置于 28 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 5 d 后觀察抑菌帶的大小，每個(gè)處理重復(fù) 3 次。采用管碟法 9 分析拮抗菌對(duì)歐文氏菌的拮抗作用： 在涂布有 100L病原菌（約 1×107 CFU/mL）的 LB 瓊脂平板上等距離用打孔器打直徑為 7 mm的孔。每個(gè)孔中接入 50 L發(fā)酵液 10 倍稀釋液，以無(wú)菌水為對(duì)照， 每個(gè)處理設(shè)置 3 次重復(fù)。在 30 恒溫箱中培養(yǎng) 20 28 h 后測(cè)量抑菌圈直徑，根據(jù)數(shù)值大小確定拮抗程度。1.4拮抗菌株鑒定拮抗菌的形態(tài)特征和生理生化