差示熱量分析

1、 微量熱技術(shù)微量熱技術(shù)(Microcalorimetry) 一、熱分析技術(shù)及分類一、熱分析技術(shù)及分類 熱分析是在程序控制溫度下，測量物質(zhì)的物理性質(zhì)隨溫度變化的一類技術(shù)。 程序控制溫度：指用固定的速率加熱或冷卻。 物理性質(zhì)：包括物質(zhì)的質(zhì)量、溫度、 熱焓、尺寸、機械、升學(xué)、電學(xué)及 磁學(xué)性質(zhì)等。 熱分析歷史熱分析歷史 1780年英國的Higgins使用天平研究石灰粘結(jié)劑和生石灰受熱重量變化。 1915年日本的本多光太郎提出“熱天平” 概念。 二戰(zhàn)以后，熱分析技術(shù)飛快發(fā)展。 40年代末商業(yè)化電子管式差熱分析儀問世。 1964年提出“差示掃描量熱”的概念。 熱分析已經(jīng)形成一類擁有多種檢測手段的儀器分析方

2、法。 熱分析技術(shù)的分類熱分析技術(shù)的分類: 等熱分析 差熱分析 示差掃描量熱分析 熱重分析 逸出氣體分析 熱膨脹儀 熱力法 熱光法 電磁熱分析 放射熱分析等 熱分析技術(shù)分類熱分析技術(shù)分類物理性質(zhì)物理性質(zhì)分析技術(shù)名稱分析技術(shù)名稱物理性質(zhì)物理性質(zhì)分析技術(shù)名稱分析技術(shù)名稱質(zhì)量質(zhì)量熱重法熱重法尺寸尺寸熱膨脹法熱膨脹法等壓質(zhì)量變化測定等壓質(zhì)量變化測定力學(xué)特性力學(xué)特性熱機械分析熱機械分析逸出氣體分析逸出氣體分析動態(tài)熱機械分析動態(tài)熱機械分析放射熱分析放射熱分析聲學(xué)特性聲學(xué)特性熱發(fā)聲法熱發(fā)聲法熱微粒分析熱微粒分析熱聲學(xué)法熱聲學(xué)法溫度溫度加熱曲線測定加熱曲線測定光學(xué)特性光學(xué)特性熱光學(xué)法熱光學(xué)法差熱分析差熱分析電學(xué)

3、特性電學(xué)特性熱電學(xué)法熱電學(xué)法焓焓差示掃描量熱法差示掃描量熱法磁學(xué)特性磁學(xué)特性熱磁學(xué)法熱磁學(xué)法 熱分析四大支柱：熱分析四大支柱： 等熱分析、差熱分析、 差示掃描量熱分析、熱機械分析 用于研究物質(zhì)的晶型轉(zhuǎn)變、融化、升華、吸附等物理現(xiàn)象以及脫水、分解、氧化、還原等化學(xué)現(xiàn)象。 快速提供被研究物質(zhì)的熱穩(wěn)定性、熱分解產(chǎn)物、熱變化過程的焓變、各種類型的相變點、玻璃化溫度、軟化點、比熱、純度、爆破溫度和高聚物的表征及結(jié)構(gòu)性能等。 微量熱法(包括等溫滴定量熱和差示掃描量熱)是近年來發(fā)展起來的一種研究生物熱力學(xué)與生物動力學(xué)的重要結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法.它通過高靈敏度、高自動化的微量量熱儀連續(xù)和準確地監(jiān)測和記錄一個變化過程

4、的量熱曲線，原位(in situ)、在線(on-line)和無損傷地同時提供熱力學(xué)和動力學(xué)信息 微量熱法具有以下特點：微量熱法具有以下特點： 它不干擾蛋白質(zhì)和核酸的生理功能，具有非特異性的獨特優(yōu)勢，即它不干擾蛋白質(zhì)和核酸的生理功能，具有非特異性的獨特優(yōu)勢，即對被研究蛋白質(zhì)和核酸體系的溶劑性質(zhì)、光譜性質(zhì)和電學(xué)性質(zhì)等沒有對被研究蛋白質(zhì)和核酸體系的溶劑性質(zhì)、光譜性質(zhì)和電學(xué)性質(zhì)等沒有任何限制條件。任何限制條件。 樣品用量小樣品用量小,方法靈敏度高，測量時不需要制成透明清澈的溶液。方法靈敏度高，測量時不需要制成透明清澈的溶液。 量熱實驗完畢的樣品未遭破壞，還可以進行后續(xù)生化分析。量熱實驗完畢的樣品未遭破

5、壞，還可以進行后續(xù)生化分析。 微量熱法缺乏特異性。但由于蛋白質(zhì)和核酸本身具有特異性，因此這微量熱法缺乏特異性。但由于蛋白質(zhì)和核酸本身具有特異性，因此這種非特異性方法有時可以得到用特異方法得不到的結(jié)果，這有助于發(fā)種非特異性方法有時可以得到用特異方法得不到的結(jié)果，這有助于發(fā)現(xiàn)新現(xiàn)象和新規(guī)律?，F(xiàn)新現(xiàn)象和新規(guī)律。微量熱法在生物大分子研究中的應(yīng)用主有微量熱法在生物大分子研究中的應(yīng)用主有：酶促反應(yīng)蛋白質(zhì)去折疊/折疊抗原-抗體相互作用分子伴侶-底物相互作用藥物-核酸相互作用物質(zhì)的三個基本性質(zhì)即能量、結(jié)構(gòu)和動力學(xué)性質(zhì)相互關(guān)聯(lián)物質(zhì)的三個基本性質(zhì)即能量、結(jié)構(gòu)和動力學(xué)性質(zhì)相互關(guān)聯(lián)例例. . 水分子中角水分子中角H-

6、O-HH-O-H為為105105 ，因為這樣分子能量最??；，因為這樣分子能量最??； 又如，多肽又如，多肽鏈在溶液中折疊成球蛋白，也是由于要使系統(tǒng)能量最小化。鏈在溶液中折疊成球蛋白，也是由于要使系統(tǒng)能量最小化。 波譜學(xué)方法可以探測不同能級之間的躍遷，即研究樣品分子在波譜學(xué)方法可以探測不同能級之間的躍遷，即研究樣品分子在光的作用下能量狀態(tài)的變化；而熱分析的方法可以直接量測樣光的作用下能量狀態(tài)的變化；而熱分析的方法可以直接量測樣品分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時能量的變化。品分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時能量的變化。原原 理理熱分析技術(shù)熱分析技術(shù)在升溫或降溫的過程中，物質(zhì)的結(jié)構(gòu)（如相態(tài)）和在升溫或降溫的過程中，物質(zhì)的結(jié)構(gòu)（如

7、相態(tài)）和化學(xué)性質(zhì)會發(fā)生變化，其質(zhì)量、尺寸及聲、光、電化學(xué)性質(zhì)會發(fā)生變化，其質(zhì)量、尺寸及聲、光、電、磁、熱、力等物理性質(zhì)也會發(fā)生相應(yīng)的變化、磁、熱、力等物理性質(zhì)也會發(fā)生相應(yīng)的變化熱分析技術(shù)就是在溫度程序控制的條件下測量物質(zhì)熱分析技術(shù)就是在溫度程序控制的條件下測量物質(zhì)的物理性質(zhì)與溫度關(guān)系的一類技術(shù)的物理性質(zhì)與溫度關(guān)系的一類技術(shù)在程序控制溫度下，在程序控制溫度下，測量物質(zhì)質(zhì)量的變化，產(chǎn)生了熱重法、等壓質(zhì)量變化測測量物質(zhì)質(zhì)量的變化，產(chǎn)生了熱重法、等壓質(zhì)量變化測定和逸出氣檢測等技術(shù)；定和逸出氣檢測等技術(shù)；測量樣品幾何尺寸的變化，則有了熱膨脹法；測量樣品幾何尺寸的變化，則有了熱膨脹法；測量樣品的光學(xué)特性，

8、有熱光學(xué)法；測量樣品的光學(xué)特性，有熱光學(xué)法；測量樣品的電學(xué)特性，有熱電學(xué)法；測量樣品的電學(xué)特性，有熱電學(xué)法；測量樣品的磁學(xué)特性，有熱磁學(xué)法；測量樣品的磁學(xué)特性，有熱磁學(xué)法；測量樣品的力學(xué)特性，有熱機械分析和動態(tài)熱機械測量樣品的力學(xué)特性，有熱機械分析和動態(tài)熱機械法；法；測量樣品的熱力學(xué)性質(zhì)，則有等溫滴定量熱、差熱測量樣品的熱力學(xué)性質(zhì)，則有等溫滴定量熱、差熱分析和差示掃描量熱法分析和差示掃描量熱法(DSC)(DSC)差熱分析、等溫滴定量熱和差示掃描量熱技術(shù)應(yīng)用差熱分析、等溫滴定量熱和差示掃描量熱技術(shù)應(yīng)用得最廣泛。得最廣泛。差熱分析（差熱分析（DTA）是在程序控溫下測量樣品和參比是在程序控溫下測量樣

9、品和參比物的物的溫度差溫度差與溫度的關(guān)系的技術(shù)。與溫度的關(guān)系的技術(shù)。等溫滴定量熱（等溫滴定量熱（ITC）通過滴定反應(yīng)熱放出或吸收通過滴定反應(yīng)熱放出或吸收的熱力學(xué)分析，提供結(jié)合反應(yīng)相關(guān)的能量過程的定的熱力學(xué)分析，提供結(jié)合反應(yīng)相關(guān)的能量過程的定量特征。量特征。差示掃描量熱（差示掃描量熱（DSC）技術(shù)是在程序控溫下測量輸技術(shù)是在程序控溫下測量輸入到位置與參比物的入到位置與參比物的功率差功率差與溫度的關(guān)系的技術(shù)。與溫度的關(guān)系的技術(shù)。熱分析所測定的熱力學(xué)參數(shù)主要是熱焓的變化熱分析所測定的熱力學(xué)參數(shù)主要是熱焓的變化（ H H）。由于在給定溫度下每個體系總是趨向于）。由于在給定溫度下每個體系總是趨向于達到自

10、由能最小的狀態(tài)，所以樣品升溫或降溫的達到自由能最小的狀態(tài)，所以樣品升溫或降溫的過程中，它可轉(zhuǎn)變成具有不同自由能的另一種結(jié)過程中，它可轉(zhuǎn)變成具有不同自由能的另一種結(jié)構(gòu)狀態(tài)。分析伴隨著結(jié)構(gòu)變化所發(fā)生的熱焓變化，構(gòu)狀態(tài)。分析伴隨著結(jié)構(gòu)變化所發(fā)生的熱焓變化，就可以得到樣品結(jié)構(gòu)變化的某些信息。這就是用就可以得到樣品結(jié)構(gòu)變化的某些信息。這就是用差示掃描量熱法來分析生物大分子結(jié)構(gòu)變化的基差示掃描量熱法來分析生物大分子結(jié)構(gòu)變化的基礎(chǔ)。礎(chǔ)。差示掃描量熱法能精確、快速、方便地同時提供差示掃描量熱法能精確、快速、方便地同時提供樣品物理性質(zhì)和能量性質(zhì)相關(guān)信息，這是其它技樣品物理性質(zhì)和能量性質(zhì)相關(guān)信息，這是其它技術(shù)難以

11、做到的。術(shù)難以做到的。熱分析既可以用于研究物理性質(zhì)的變化，也可研究化學(xué)變熱分析既可以用于研究物理性質(zhì)的變化，也可研究化學(xué)變化；不僅可測量熱力學(xué)參數(shù)，也可提供一定的動力學(xué)信息。化；不僅可測量熱力學(xué)參數(shù)，也可提供一定的動力學(xué)信息。因此熱分析在物質(zhì)組分和結(jié)構(gòu)研究及熱力學(xué)和動力學(xué)研究因此熱分析在物質(zhì)組分和結(jié)構(gòu)研究及熱力學(xué)和動力學(xué)研究上都是重要的分析手段。上都是重要的分析手段。熱分析所研究的物質(zhì)可以是無機物（包括金屬、礦物、陶熱分析所研究的物質(zhì)可以是無機物（包括金屬、礦物、陶瓷材料等），也可以是有機物；既可以是小分子物質(zhì)，也瓷材料等），也可以是有機物；既可以是小分子物質(zhì)，也可以研究生物大分子；因此，其研

12、究的對象遍及物理、化可以研究生物大分子；因此，其研究的對象遍及物理、化學(xué)、生物、醫(yī)藥、食品、化工、材料、地礦、航天、環(huán)保學(xué)、生物、醫(yī)藥、食品、化工、材料、地礦、航天、環(huán)保、考古等多個領(lǐng)域。在生物學(xué)研究中，研究比較早的是生、考古等多個領(lǐng)域。在生物學(xué)研究中，研究比較早的是生物膜、膜脂及模擬生物膜的模型膜；隨著熱分析儀器測量物膜、膜脂及模擬生物膜的模型膜；隨著熱分析儀器測量精度的提高，對生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸的研究也越來精度的提高，對生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸的研究也越來越普遍，越來越深入。越普遍，越來越深入。 熱量的測量與量熱儀熱量的測量與量熱儀熱量是不能直接測量的，只能通過熱效應(yīng)間接測量。例如熱

13、量是不能直接測量的，只能通過熱效應(yīng)間接測量。例如測量溫差隨時間的變化或溫差隨地點測量溫差隨時間的變化或溫差隨地點(位置位置) 的變化，即的變化，即 T=T(t1)-T(t2)或或 T=T(x1)T(x2)通過測量不同時間的溫差間接測量熱量的最古老的方法就通過測量不同時間的溫差間接測量熱量的最古老的方法就是測量一定質(zhì)量的水的溫度變化是測量一定質(zhì)量的水的溫度變化: Q = Ck T T=T(t1)T(t2)是水溫在是水溫在t1到到t2這段時間內(nèi)的變化，這段時間內(nèi)的變化， Q是是熱量，熱量，Ck是熱容（假定它在測量范圍內(nèi)是不變的）。是熱容（假定它在測量范圍內(nèi)是不變的）。通過測量不同地點的溫差也可以測

14、量熱量通過測量不同地點的溫差也可以測量熱量:QK(T)T(t)dt這里這里T表示溫度，表示溫度，t表示時間，表示時間， T是時間是時間t時地點時地點x1和和x2的的溫差，溫差， TT(x1，t)T(x2，t)， K是比例系數(shù)。是比例系數(shù)。 不同的量熱儀所依據(jù)的測量熱量的原理千差萬別，不同的量熱儀所依據(jù)的測量熱量的原理千差萬別，量熱儀的分類也有各種方法。量熱儀的分類也有各種方法。根據(jù)測量原理的不同，可以分為根據(jù)測量原理的不同，可以分為相變補償型、相變補償型、熱電熱電效應(yīng)補償型效應(yīng)補償型、測量溫差隨時間變化型、測量溫差隨、測量溫差隨時間變化型、測量溫差隨地點變化型等；地點變化型等；根據(jù)運行模式不同

15、，可分為等溫靜態(tài)運行、恒溫環(huán)根據(jù)運行模式不同，可分為等溫靜態(tài)運行、恒溫環(huán)境靜態(tài)運行、絕熱靜態(tài)運行、絕熱動態(tài)掃描運行、境靜態(tài)運行、絕熱靜態(tài)運行、絕熱動態(tài)掃描運行、恒溫環(huán)境掃描動態(tài)運行等恒溫環(huán)境掃描動態(tài)運行等；根據(jù)構(gòu)造原理分類：如雙量熱儀、單量熱儀等。根據(jù)構(gòu)造原理分類：如雙量熱儀、單量熱儀等。用人名命名，如用人名命名，如BunsenBunsen量熱儀、量熱儀、CalvetCalvet量熱儀等。量熱儀等。無論采用哪一種分類方法，都可能會有某些量熱儀難無論采用哪一種分類方法，都可能會有某些量熱儀難以明確歸入某一類中去。例如，以明確歸入某一類中去。例如，CalvetCalvet量熱儀，可用量熱儀，可用電

16、補償熱效應(yīng)方式工作在恒溫模式下，也可用恒溫環(huán)電補償熱效應(yīng)方式工作在恒溫模式下，也可用恒溫環(huán)境方式測量不同地點的溫差。境方式測量不同地點的溫差。還有某些量熱儀不在上述分類的范圍以內(nèi)。還有某些量熱儀不在上述分類的范圍以內(nèi)。 一一、等溫滴定量熱法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC） 等溫滴定量熱法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年來發(fā)展起來的一種研究生物熱力學(xué)與生物動力學(xué)的重要方法，它通過高靈敏度、高自動化的微量量熱儀連續(xù)、準確地監(jiān)測和記錄一個變化過程的量熱曲線，原位、在線和無損傷地同時提供熱力學(xué)和動力學(xué)信息。

17、 等溫滴定微量量熱法（ITC）可以檢測滴定反應(yīng)過程中熱量變化，用來表征生物分子間的相互作用，ITC 迅速成為研究生物大分子結(jié)合反應(yīng)的有力工具。 通過滴定反應(yīng)物到含有反應(yīng)所必須的另一反應(yīng)物的樣品溶液中。每次滴定后，反應(yīng)熱放出或吸收，這些都可以被ITC所檢測到。檢測到的熱效應(yīng)的熱力學(xué)分析提供了結(jié)合反應(yīng)相關(guān)的能量過程的定量特征，可以直接測量與常溫下發(fā)生的反應(yīng)過程相關(guān)的能量學(xué)參數(shù)。 ITC的用途：的用途：獲得生物分子相互作用的完整熱力學(xué)參數(shù)，包括結(jié)合常數(shù)KB 、結(jié)合位點數(shù)（n） 、摩爾結(jié)合焓變（H） 、摩爾結(jié)合熵變（S） 、摩爾恒壓熱容，和動力學(xué)參數(shù)(如酶活力、酶促反應(yīng)米氏常數(shù)和酶轉(zhuǎn)換數(shù))等化學(xué)熱力學(xué)

18、參數(shù)描述一個結(jié)合反應(yīng)ITC的應(yīng)用范圍：的應(yīng)用范圍：蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(包括抗原-抗體相互作用和分子伴侶-底物相互作用)；蛋白質(zhì)折疊/去折疊；蛋白質(zhì)-小分子相互作用以及酶-抑制劑相互作用； 酶促反應(yīng)動力學(xué)；藥物-DNA/RNA相互作用；RNA折疊；蛋白質(zhì)-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-細胞相互作用； ITC的特點 ITC能測量到的熱效應(yīng)最低可達125 nJ， 最小可檢測熱功率2 nW， 生物樣品最小用量0.4 g， 靈敏度得到提高，響應(yīng)時間（小于10 s） ITC不需要固定或改變反應(yīng)物，因為結(jié)合熱的產(chǎn)生是自發(fā)的。獲得物質(zhì)相互作用完整的熱力學(xué)數(shù)據(jù)包括結(jié)合常數(shù)

19、（Ka）、結(jié)合位點數(shù)（n），結(jié)合焓（H）、恒壓熱容（Cp）和動力學(xué)數(shù)據(jù)（如酶促反應(yīng)的Km和kcat）ITC 結(jié)構(gòu)原理示意圖 ITC 獲取的結(jié)果示意圖 峰底與峰尖之間的峰面積為每次注射時釋放或吸收的總熱量峰底與峰尖之間的峰面積為每次注射時釋放或吸收的總熱量 以產(chǎn)生或吸收的總熱量為縱坐標，以加入杯中的兩反應(yīng)物之摩爾比為坐標作圖，以產(chǎn)生或吸收的總熱量為縱坐標，以加入杯中的兩反應(yīng)物之摩爾比為坐標作圖，可得整個反應(yīng)過程的結(jié)合等溫曲線可得整個反應(yīng)過程的結(jié)合等溫曲線 ITC的應(yīng)用的應(yīng)用 1）蛋白質(zhì)）蛋白質(zhì)-小分子和酶小分子和酶-抑制物相互作用；抑制物相互作用；2）蛋白質(zhì)）蛋白質(zhì)-糖類相互作用；糖類相互作用；

20、3）蛋白質(zhì)）蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用：如蛋白質(zhì)相互作用：如Jacobson等用等用ITC研究了人細胞研究了人細胞RNA聚合酶聚合酶轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子TFIID的最大亞單位的最大亞單位TAFII250的組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶活性的組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性(Jacobson et al., 2000)。日本。日本Kanagawa科學(xué)技術(shù)研究所的科學(xué)技術(shù)研究所的Tahirov等利用等利用ITC、CD和和UV研究了研究了AML1/Runx-1小結(jié)構(gòu)域識別的小結(jié)構(gòu)域識別的DNA結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)及CBF控制的控制的構(gòu)象調(diào)整，闡明了構(gòu)象調(diào)整，闡明了CBF與與CBF間的相互作用模式及前者調(diào)控后者結(jié)合到間的相互作用模式及前者調(diào)

21、控后者結(jié)合到DNA上的機制上的機制(Tahirov, et al., 2001)。3）蛋白質(zhì)）蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用；脂質(zhì)相互作用；4）脂質(zhì)間以及脂質(zhì)）脂質(zhì)間以及脂質(zhì)-小分子相互作用；小分子相互作用；5）核酸）核酸-小分子相互作用；小分子相互作用；6）蛋白質(zhì)）蛋白質(zhì)-核酸相互作用；核酸相互作用；7）核酸）核酸-核酸相互作用；核酸相互作用； 8）抗體研究：美國）抗體研究：美國Johns Hopkins大學(xué)生物系的生物量熱學(xué)中心是目大學(xué)生物系的生物量熱學(xué)中心是目前世界上從事生物量熱學(xué)最活躍和處于領(lǐng)先水平的實驗室，該中心的前世界上從事生物量熱學(xué)最活躍和處于領(lǐng)先水平的實驗室，該中心的Freire小組小組

22、(Murphy et al., 1993, 1995)應(yīng)用高靈敏度應(yīng)用高靈敏度ITC分別研究了分別研究了血管緊縮素與其單克隆抗體和酸誘導(dǎo)去折疊細胞色素血管緊縮素與其單克隆抗體和酸誘導(dǎo)去折疊細胞色素c與其單克隆抗與其單克隆抗體的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)上述結(jié)合過程均為焓和熵同時驅(qū)動的反應(yīng)，實驗結(jié)果體的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)上述結(jié)合過程均為焓和熵同時驅(qū)動的反應(yīng)，實驗結(jié)果表明，這些過程中溶劑釋放所導(dǎo)致的熵增過量補償了因結(jié)合而引起的表明，這些過程中溶劑釋放所導(dǎo)致的熵增過量補償了因結(jié)合而引起的構(gòu)象熵的損失。構(gòu)象熵的損失。9）受體相互作用；）受體相互作用；10）蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性：如美國的）蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性：如美國的Wright

23、小組應(yīng)用小組應(yīng)用ITC和核磁共振和核磁共振(NMR)等技術(shù)研究了核激素受體蛋白的一個結(jié)構(gòu)域與甲狀腺素及類纖等技術(shù)研究了核激素受體蛋白的一個結(jié)構(gòu)域與甲狀腺素及類纖維素維素A受體相互作用的熱力學(xué)，發(fā)現(xiàn)雖然分開的結(jié)構(gòu)域本身很凌亂，受體相互作用的熱力學(xué)，發(fā)現(xiàn)雖然分開的結(jié)構(gòu)域本身很凌亂，但是它們之間有高的親和力而且是焓驅(qū)動的，并以一種獨特的協(xié)同折但是它們之間有高的親和力而且是焓驅(qū)動的，并以一種獨特的協(xié)同折疊的機制形成螺旋異二聚體。疊的機制形成螺旋異二聚體。 11）酶分析：應(yīng)用等溫滴定微量熱法）酶分析：應(yīng)用等溫滴定微量熱法(ITC)結(jié)合高靈敏度差示掃描量熱法結(jié)合高靈敏度差示掃描量熱法(DSC)和和分光光度

24、法研究酵母細胞色素分光光度法研究酵母細胞色素C氧化酶催化氧化其生理底物氧化酶催化氧化其生理底物亞鐵細胞色素亞鐵細胞色素c的的熱力學(xué)和動力學(xué)，并分析原鹽效應(yīng)對該酶活性的影響。應(yīng)用等溫微量熱法研究熱力學(xué)和動力學(xué)，并分析原鹽效應(yīng)對該酶活性的影響。應(yīng)用等溫微量熱法研究了超氧化物歧化酶催化歧化超氧陰離子等反應(yīng)體系，獲得了這些酶促反應(yīng)的各了超氧化物歧化酶催化歧化超氧陰離子等反應(yīng)體系，獲得了這些酶促反應(yīng)的各種熱力學(xué)和動力學(xué)信息種熱力學(xué)和動力學(xué)信息,探討了相關(guān)催化機理，同時用該法研究了博萊霉素催化探討了相關(guān)催化機理，同時用該法研究了博萊霉素催化切割切割DNA的反應(yīng)，從熱力學(xué)和動力學(xué)的角度嚴格地證明了博萊霉素在

25、催化機制的反應(yīng)，從熱力學(xué)和動力學(xué)的角度嚴格地證明了博萊霉素在催化機制上類似于上類似于DNA切割酶，但其催化效率低于切割酶，但其催化效率低于DNA切割酶，并用等溫滴定微量熱法切割酶，并用等溫滴定微量熱法研究了不同濃度鹽酸胍存在時肌酸激酶催化研究了不同濃度鹽酸胍存在時肌酸激酶催化ATP與肌酸間轉(zhuǎn)磷酸化反應(yīng)的熱力與肌酸間轉(zhuǎn)磷酸化反應(yīng)的熱力學(xué)，從熱力學(xué)的觀點確定了該酶促反應(yīng)為快速平衡的隨機順序反應(yīng)，還建立了學(xué)，從熱力學(xué)的觀點確定了該酶促反應(yīng)為快速平衡的隨機順序反應(yīng)，還建立了新的肌酸激酶和超氧化物歧化酶活力測定方法新的肌酸激酶和超氧化物歧化酶活力測定方法微量熱測活法。微量熱測活法。值得指出的是，值得指出

26、的是，ITC不僅被應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)折疊不僅被應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)折疊/去折疊，而且被應(yīng)用于核酸去折疊，而且被應(yīng)用于核酸折疊，英國的折疊，英國的Hammann等人利用等人利用ITC研究了鎂離子誘導(dǎo)錘頭狀核酶折疊的熱力研究了鎂離子誘導(dǎo)錘頭狀核酶折疊的熱力學(xué)，發(fā)現(xiàn)鎂離子與天然序列核酶的結(jié)合是一個強烈的放熱反應(yīng)，和鎂離子與錘學(xué)，發(fā)現(xiàn)鎂離子與天然序列核酶的結(jié)合是一個強烈的放熱反應(yīng)，和鎂離子與錘頭狀核酶不同序列變異體的結(jié)合有很大的區(qū)別，這些工作對于核酸折疊的熱力頭狀核酶不同序列變異體的結(jié)合有很大的區(qū)別，這些工作對于核酸折疊的熱力學(xué)研究是良好的開端。學(xué)研究是良好的開端。ITC 應(yīng)用示例應(yīng)用示例ITC法測量結(jié)合法

27、測量結(jié)合/解離常數(shù)解離常數(shù):Christian Herrmann等運用等運用ITC研究了研究了Ras與效應(yīng)物和與效應(yīng)物和Cdc42與效應(yīng)物的相互與效應(yīng)物的相互作用。作用。Ras是一種在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用的蛋白質(zhì)?？梢韵蚱湎掠蔚脑S多信是一種在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用的蛋白質(zhì)。可以向其下游的許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑輸送細胞內(nèi)調(diào)控信號。號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑輸送細胞內(nèi)調(diào)控信號。Ras在非激活態(tài)，與在非激活態(tài)，與GDP結(jié)合，當(dāng)結(jié)合，當(dāng)GDP被被GTP取代時被激活，與其效應(yīng)物（取代時被激活，與其效應(yīng)物（Raf，RalGDS，3-磷脂酰肌醇激酶）呈現(xiàn)磷脂酰肌醇激酶）呈現(xiàn)更緊密的結(jié)合。更緊密的結(jié)合。Cdc42是一種是一種

28、GTPase，也是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白。它參與細，也是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白。它參與細胞增殖調(diào)控和肌動蛋白細胞骨架的調(diào)控。胞增殖調(diào)控和肌動蛋白細胞骨架的調(diào)控。Cdc42在參與細胞骨架調(diào)控的過程在參與細胞骨架調(diào)控的過程中，很重要的一步是與中，很重要的一步是與WASP蛋白的相互作用。蛋白的相互作用。Ras及其效應(yīng)物（及其效應(yīng)物（Raf，RalGDS）的結(jié)合方式都很類似，包括富含親水氨基）的結(jié)合方式都很類似，包括富含親水氨基酸側(cè)鏈的反平行酸側(cè)鏈的反平行折疊。折疊。Cdc42及其效應(yīng)物及其效應(yīng)物(WASP)的結(jié)合區(qū)則富含疏水氨的結(jié)合區(qū)則富含疏水氨基酸，其復(fù)合物也比基酸，其復(fù)合物也比Ras/效應(yīng)物復(fù)合物大得多

29、。效應(yīng)物復(fù)合物大得多。濃度依賴的濃度依賴的Ras/RalGDS相互作用相互作用 利用基于熒光的利用基于熒光的GDI法測得法測得Kd2.4 M()和和1.2 M() 利用利用ITC測得測得Kd1.73 M()和和0.83 M(） ITC可以直接測量焓變可以直接測量焓變H，結(jié)合常數(shù)，結(jié)合常數(shù)Ka，而不對反應(yīng)體系產(chǎn)生影響，也不引入修飾而不對反應(yīng)體系產(chǎn)生影響，也不引入修飾基團，因此測得的結(jié)果更加可信基團，因此測得的結(jié)果更加可信 ITC探測生物分子結(jié)構(gòu)信息探測生物分子結(jié)構(gòu)信息: 運用運用ITC研究了研究了DNA結(jié)合蛋白的分子識別結(jié)合蛋白的分子識別一般認為：形成二聚體是酵母轉(zhuǎn)錄因子一般認為：形成二聚體是酵

30、母轉(zhuǎn)錄因子GCN4特異性識別其特異性識別其DNA結(jié)合位點的前提。結(jié)合位點的前提。以天然以天然GCN4的堿性區(qū)（的堿性區(qū)（226252）作為單體肽）作為單體肽GCN4M，以二硫鍵，以二硫鍵SS連連接的肽作為二聚體肽接的肽作為二聚體肽GCN4D，研究他們與天然蛋白，研究他們與天然蛋白GCN4的結(jié)合位點的結(jié)合位點AP1和和CRE的相互識別作用。發(fā)現(xiàn)：單體肽的相互識別作用。發(fā)現(xiàn)：單體肽GCN4M與與DNA的結(jié)合力較弱，但的結(jié)合力較弱，但是能夠特異性識別是能夠特異性識別DNA結(jié)合位點結(jié)合位點AP1和和CRE。 CCN4bZIP：天然肽：天然肽226281的一段序列；的一段序列； CCN4M：合成的從：合

31、成的從226252的一段序列，單體肽；的一段序列，單體肽； CCN4D：合成的從：合成的從226252的一段序列，二聚體肽；的一段序列，二聚體肽； AP1與與CRE：GCN4的兩個主要識別位點；的兩個主要識別位點； CONT：非特異性識別，作為參照的寡聚核苷酸序列。：非特異性識別，作為參照的寡聚核苷酸序列。 20時時GCN4-D和和GCN4-M與與AP-1的滴定反應(yīng)和擬合曲線的滴定反應(yīng)和擬合曲線 (a) GCN4-D滴定滴定AP-1； (b) GCN-M滴定滴定AP-1 ITC測定的反應(yīng)熱既包含結(jié)合反應(yīng)又包含折測定的反應(yīng)熱既包含結(jié)合反應(yīng)又包含折疊反應(yīng)。肽與疊反應(yīng)。肽與DNA結(jié)合過程伴隨著肽的構(gòu)

32、結(jié)合過程伴隨著肽的構(gòu)象折疊和疏水表面包埋。肽的構(gòu)象中熵的損象折疊和疏水表面包埋。肽的構(gòu)象中熵的損失對熵變的不利貢獻大于溶劑效應(yīng)產(chǎn)生的有失對熵變的不利貢獻大于溶劑效應(yīng)產(chǎn)生的有利貢獻，由于包埋疏水表面時所引起的結(jié)合利貢獻，由于包埋疏水表面時所引起的結(jié)合水的損失對熵變產(chǎn)生有利貢獻，因此肽與水的損失對熵變產(chǎn)生有利貢獻，因此肽與DNA結(jié)合過程中總的熵變對結(jié)合是不利的結(jié)合過程中總的熵變對結(jié)合是不利的 產(chǎn)生熵變的因素有：產(chǎn)生熵變的因素有：1）疏水作用產(chǎn)生的有利貢獻；）疏水作用產(chǎn)生的有利貢獻；2）肽與）肽與DNA形成復(fù)合物由于轉(zhuǎn)動和平移自由度形成復(fù)合物由于轉(zhuǎn)動和平移自由度 的減小引起的熵損失；的減小引起的熵損

33、失；3）結(jié)合過程中肽與）結(jié)合過程中肽與DNA的折疊或其他構(gòu)象變化的折疊或其他構(gòu)象變化 產(chǎn)生的不利貢獻產(chǎn)生的不利貢獻 GCN4和和GCN4M與與AP1和和CRE反應(yīng)是焓驅(qū)動。反應(yīng)是焓驅(qū)動。熵變對反應(yīng)不利，而負的焓變補償了不利的熵變。熵變對反應(yīng)不利，而負的焓變補償了不利的熵變。與熵的變化類似，反應(yīng)自由能也包含肽鏈折疊所引與熵的變化類似，反應(yīng)自由能也包含肽鏈折疊所引起的總的自由能的變化和結(jié)合反應(yīng)自由能的變化。起的總的自由能的變化和結(jié)合反應(yīng)自由能的變化。結(jié)合作用對自由能變化的貢獻主要來自于肽與結(jié)合作用對自由能變化的貢獻主要來自于肽與DNA間形成的氫鍵作用、間形成的氫鍵作用、van der waals作

34、用以及作用以及靜電作用等靜電作用等 其它應(yīng)用其它應(yīng)用 美國的Todd小組提出了用功率補償型ITC測定酶動力學(xué)參數(shù)的兩種新技術(shù)：(1) 將底物溶液不斷滴入酶溶液中，以將底物溶液不斷滴入酶溶液中，以維持準一級反應(yīng)的條件；維持準一級反應(yīng)的條件；(2) 將底物溶液一次滴入酶溶液將底物溶液一次滴入酶溶液中，連續(xù)監(jiān)測底物被消耗時的熱功率變化。這兩種技術(shù)均中，連續(xù)監(jiān)測底物被消耗時的熱功率變化。這兩種技術(shù)均基于反應(yīng)速率和反應(yīng)熱功率成正比的原理，而且只需一次基于反應(yīng)速率和反應(yīng)熱功率成正比的原理，而且只需一次實驗即可獲得高度精確的動力學(xué)參數(shù)實驗即可獲得高度精確的動力學(xué)參數(shù)(如米氏常數(shù)、酶轉(zhuǎn)如米氏常數(shù)、酶轉(zhuǎn)換數(shù)和抑

35、制常數(shù)換數(shù)和抑制常數(shù))。這些技術(shù)被成功應(yīng)用于測定二氫葉酸還原酶的氧化還原活力、己糖激酶的轉(zhuǎn)換酶活力、幽門螺桿菌脲酶、胰蛋白酶和HIV-1蛋白酶的水解活力、肝素酶的裂解酶活力、丙酮酸羧化酶的連接酶活力 DSC &ITC 在藥物研發(fā)中的應(yīng)用在藥物研發(fā)中的應(yīng)用 藥物研究開發(fā)周期簡單劃分為初篩、分析、設(shè)計、藥物研究開發(fā)周期簡單劃分為初篩、分析、設(shè)計、合成和復(fù)篩，一個成功的新藥上市平均需要合成和復(fù)篩，一個成功的新藥上市平均需要15 年年的時間和巨額資金投入，約為的時間和巨額資金投入，約為8.8 億美元。在開億美元。在開發(fā)過程中，許多藥物在臨床發(fā)過程中，許多藥物在臨床II 期和期和III 期慘遭淘

36、汰，期慘遭淘汰，其主要原因是藥物沒有到達預(yù)期的靶點，從而產(chǎn)其主要原因是藥物沒有到達預(yù)期的靶點，從而產(chǎn)生毒副作用。生毒副作用。 在藥物設(shè)計過程中在藥物設(shè)計過程中,提前對藥物的熱力學(xué)性質(zhì)進行提前對藥物的熱力學(xué)性質(zhì)進行合理的評估和篩選合理的評估和篩選,避免在開發(fā)過程中、后期才發(fā)避免在開發(fā)過程中、后期才發(fā)現(xiàn)問題現(xiàn)問題,以減少藥物開發(fā)成本。以減少藥物開發(fā)成本。DSC 和和ITC 在新藥在新藥的研發(fā)過程中許多環(huán)節(jié)發(fā)揮篩選功能的研發(fā)過程中許多環(huán)節(jié)發(fā)揮篩選功能差示掃描量熱技術(shù)（Differential Scanning Calorimetry） 差示掃描量熱法是六十年代以后研制出的一種差示掃描量熱法是六十年代

37、以后研制出的一種分析方法分析方法 年，美國的年，美國的WastonWaston和和ONeillONeill在分析化學(xué)在分析化學(xué)雜志上提出了差示掃描量熱法（雜志上提出了差示掃描量熱法（DSCDSC）的概念，并）的概念，并自制了自制了DSCDSC儀器不久，儀器不久， 美國美國Perkin-ElmerPerkin-Elmer公司公司生產(chǎn)了生產(chǎn)了DSCDSC商品儀器目前，商品儀器目前， DSCDSC堪稱熱分析三大堪稱熱分析三大技術(shù)中的主要技術(shù)之一技術(shù)中的主要技術(shù)之一差示掃描量熱技術(shù)差示掃描量熱技術(shù): :在樣品和參比同時程序升溫度或降在樣品和參比同時程序升溫度或降溫且保持兩者溫度相等的條件下，測量流入或

38、流出樣品溫且保持兩者溫度相等的條件下，測量流入或流出樣品和參比物的熱量差與溫度關(guān)系的一種技術(shù)和參比物的熱量差與溫度關(guān)系的一種技術(shù)通過對試樣因熱效應(yīng)而發(fā)生的能量變化進行及時補償，通過對試樣因熱效應(yīng)而發(fā)生的能量變化進行及時補償，保持試樣與參比物之間溫度始終保持相同，無溫差、無保持試樣與參比物之間溫度始終保持相同，無溫差、無熱傳遞，使熱損失小，檢測信號大。靈敏度和精度大有熱傳遞，使熱損失小，檢測信號大。靈敏度和精度大有提高，可進行定量分析提高，可進行定量分析DSC儀器結(jié)構(gòu)：儀器結(jié)構(gòu)：1. 溫度程序控制系統(tǒng)；2. 測量系統(tǒng)，用于樣品物理量轉(zhuǎn)換成電信號并放大；3. 數(shù)據(jù)記錄、處理和顯示系統(tǒng)；4. 樣品室

39、，提供適當(dāng)環(huán)境 DSC分析生物大分子結(jié)構(gòu)變化的基礎(chǔ)：分析生物大分子結(jié)構(gòu)變化的基礎(chǔ)： 在給定溫度下每個體系總是趨向于達到自由能最小的狀態(tài)，樣品升溫或降溫的過程中，它可以轉(zhuǎn)變成具有不同自由能的另一種結(jié)構(gòu)狀態(tài)。分析伴隨著結(jié)構(gòu)變化所發(fā)生的焓變化，就可以得到樣品結(jié)構(gòu)變化的某些信息兩種主要類型兩種主要類型(根據(jù)測量方法根據(jù)測量方法)：熱流型（熱流型（heat flow) DSC功率補償型功率補償型(power compensation)DSC用爐子控制環(huán)境溫度，測量用爐子控制環(huán)境溫度，測量通過康銅片流向試樣和參比通過康銅片流向試樣和參比物的熱流之差。物的熱流之差。熱流型熱流型DSC是屬于熱交換型是屬于熱交

40、換型的量熱計，與環(huán)境的熱量交的量熱計，與環(huán)境的熱量交換是通過熱阻進行測量，測換是通過熱阻進行測量，測量的信號是溫差，其值表示量的信號是溫差，其值表示交換的強度，并與熱流速率交換的強度，并與熱流速率 (=dQ/dt) 成正比。成正比。熱流式差示掃描量熱儀熱流式差示掃描量熱儀(heat flow DSC)：將試樣焓變的將試樣焓變的熱通量幾乎沒熱通量幾乎沒有什么損失地有什么損失地被多重?zé)犭娕急欢嘀責(zé)犭娕妓鶞y得所測得熱通量式差示掃描量熱儀熱通量式差示掃描量熱儀(heat flux DSC)Calvet熱通量熱通量DSC在試樣支架和參比物支架附近的薄壁氧化鋁管壁上安在試樣支架和參比物支架附近的薄壁氧化鋁

41、管壁上安放幾十對乃至幾百對互相串聯(lián)著的熱電偶，一端緊貼著管壁，另一端則放幾十對乃至幾百對互相串聯(lián)著的熱電偶，一端緊貼著管壁，另一端則緊貼著銀均熱塊，將試樣側(cè)多重?zé)犭娕寂c參比物側(cè)多重?zé)犭娕挤唇哟?lián)緊貼著銀均熱塊，將試樣側(cè)多重?zé)犭娕寂c參比物側(cè)多重?zé)犭娕挤唇哟?lián)在普通在普通DSC的程序控制加熱的基礎(chǔ)上，是在線性升、降溫的程序控制加熱的基礎(chǔ)上，是在線性升、降溫的基礎(chǔ)上疊加一個正弦振蕩溫度程序，產(chǎn)生與之相應(yīng)的循的基礎(chǔ)上疊加一個正弦振蕩溫度程序，產(chǎn)生與之相應(yīng)的循環(huán)熱流。按此種方式，不僅可以測定總熱流，并可將其分環(huán)熱流。按此種方式，不僅可以測定總熱流，并可將其分解成可逆成分與不可逆成分兩部分?？偀崃魇莻鹘y(tǒng)解

42、成可逆成分與不可逆成分兩部分?？偀崃魇莻鹘y(tǒng)DSC的的熱流信號，可逆熱流是熱流的熱容成分熱流信號，可逆熱流是熱流的熱容成分溫度調(diào)制型差示掃描量熱儀溫度調(diào)制型差示掃描量熱儀(Temperature Modulated DSC, TMDSC)：按試樣相變按試樣相變(或反應(yīng)或反應(yīng))而形成的試樣和參比物間溫差的方而形成的試樣和參比物間溫差的方向來提供電功率，以使溫差低于額定值，通常是小于向來提供電功率，以使溫差低于額定值，通常是小于0.01 K功率補償型功率補償型DSC是屬熱補償型量熱計，待測的熱量幾乎是屬熱補償型量熱計，待測的熱量幾乎全部是由電能來補償?shù)娜渴怯呻娔軄硌a償?shù)墓β恃a償型差示掃描量熱儀功率

43、補償型差示掃描量熱儀(power compensation DSC)：熱流型熱流型DSCDSC熱流型量熱儀的起源可以追溯到熱流型量熱儀的起源可以追溯到18991899年年Roberts-Roberts-AustenAusten開發(fā)的開發(fā)的DTADTA。DTADTA技術(shù)是將樣品和一種熱惰性參技術(shù)是將樣品和一種熱惰性參比物一起承受同樣的溫度變化，在溫度變化的時間范比物一起承受同樣的溫度變化，在溫度變化的時間范圍內(nèi)連續(xù)測量樣品和參比物的溫度差。圍內(nèi)連續(xù)測量樣品和參比物的溫度差。19551955年，年，BoersmaBoersma將熱電偶裝在儀器中將熱電偶裝在儀器中( (而不是樣品中而不是樣品中) )

44、，得到了，得到了可重復(fù)的定量結(jié)果。樣品產(chǎn)生的熱通過一個儀器內(nèi)部可重復(fù)的定量結(jié)果。樣品產(chǎn)生的熱通過一個儀器內(nèi)部的固定的熱通路流動，熱量通過溫度差來計算得到。的固定的熱通路流動，熱量通過溫度差來計算得到。 杜邦杜邦910熱流型熱流型DSC杜邦杜邦910910熱流型熱流型DSCDSC是以是以BoersmaBoersma的設(shè)計原理為基礎(chǔ)的的設(shè)計原理為基礎(chǔ)的熱流型熱流型DSCDSC。該儀器的特點是樣品和參比物平臺都在一個完整的康該儀器的特點是樣品和參比物平臺都在一個完整的康銅盤上，在相同的功率下由一個熱源加熱，利用康銅銅盤上，在相同的功率下由一個熱源加熱，利用康銅盤把熱量傳輸?shù)綐悠泛蛥⒈任?，康銅盤同時還

45、作為測盤把熱量傳輸?shù)綐悠泛蛥⒈任铮点~盤同時還作為測量溫度的熱電偶結(jié)點的一部分（一極）。量溫度的熱電偶結(jié)點的一部分（一極）。傳輸?shù)綐悠泛蛥⒈任锏臒崃鞑钔ㄟ^樣品和參比物平臺傳輸?shù)綐悠泛蛥⒈任锏臒崃鞑钔ㄟ^樣品和參比物平臺下的鎳鉻板與康銅板的結(jié)點所構(gòu)成的鎳鉻下的鎳鉻板與康銅板的結(jié)點所構(gòu)成的鎳鉻- -康銅熱電康銅熱電偶進行監(jiān)控記錄樣品和參比物的溫差。偶進行監(jiān)控記錄樣品和參比物的溫差。樣品溫度由鎳鉻板下方的鎳鉻樣品溫度由鎳鉻板下方的鎳鉻- -鎳鋁熱電偶直接監(jiān)控。鎳鋁熱電偶直接監(jiān)控。 這樣熱流型DSC實際上測定的量是樣品與參比物的溫差（T=TS-TR），然后根據(jù)熱流方程，將T換算成dH/dt （熱功率差）

46、作為信號的輸出 熱流型DSC特點：基線穩(wěn)定；高靈敏度 圖圖 杜邦杜邦910910型型DSCDSC的原理圖的原理圖1.1.康銅板；康銅板； 2.2.熱電偶結(jié)點；熱電偶結(jié)點；3.3.鎳鉻合金板；鎳鉻合金板；4.4.鎳鋁絲；鎳鋁絲；5.5.鎳鉻絲；鎳鉻絲；6.6.加熱塊。加熱塊。 這種熱流型這種熱流型DSCDSC的等效熱路示于下圖。的等效熱路示于下圖。R R為樣品和參比物的為樣品和參比物的臂熱阻，臂熱阻，R Rb b為橋式熱阻，為橋式熱阻，R Rg g為通過凈化氣體的泄漏熱阻，為通過凈化氣體的泄漏熱阻，i iS S和和i iR R分別為樣品和參比物的熱流分別為樣品和參比物的熱流 杜邦杜邦910910

47、型型DSCDSC的等效熱路的等效熱路 根據(jù)根據(jù)Kirchoff定律，可得下列方程式定律，可得下列方程式:式中，式中，T T為爐溫，為爐溫，T TS S、T TR R分別為樣品和參比物的溫度。分別為樣品和參比物的溫度。 SbSRgSSiRTTRTTRTTRbRSgRRiRTTRTTRTT由上面兩個式子可推出：由上面兩個式子可推出： 其中其中 T=TT=TR R-T-TS S 從上式可以看出，樣品和參比物的溫度差從上式可以看出，樣品和參比物的溫度差 T T與熱流差與熱流差成正比。這樣，經(jīng)過適當(dāng)?shù)臉硕ǎ纯蓮臏y量到的溫差成正比。這樣，經(jīng)過適當(dāng)?shù)臉硕ǎ纯蓮臏y量到的溫差推算出熱流差。推算出熱流差。bg

48、RsRRRiiT211Calvet DSC也是一類有代表性的熱流型也是一類有代表性的熱流型DSC。在在Calvet DSC中，樣品和參比樣品室均由溫差電堆環(huán)中，樣品和參比樣品室均由溫差電堆環(huán)繞，這兩個溫差電堆連接在一起，方向相反，即可直接繞，這兩個溫差電堆連接在一起，方向相反，即可直接測量熱流。測量熱流。特點：樣品與參照物之間的熱通路及樣品和環(huán)境之間的特點：樣品與參照物之間的熱通路及樣品和環(huán)境之間的通路都是由測量溫度的傳感器熱電堆構(gòu)成的。環(huán)境和樣通路都是由測量溫度的傳感器熱電堆構(gòu)成的。環(huán)境和樣品及環(huán)境和參照樣品間的熱流由熱電堆分別測量。品及環(huán)境和參照樣品間的熱流由熱電堆分別測量。這兩個等同的系

49、統(tǒng)放在一個均熱塊中，按照差熱成對原這兩個等同的系統(tǒng)放在一個均熱塊中，按照差熱成對原則來使用位于測量系統(tǒng)和塊之間的溫差電堆，以此來抵則來使用位于測量系統(tǒng)和塊之間的溫差電堆，以此來抵銷均熱塊的溫度波動，并通過降低基線的波動來提高儀銷均熱塊的溫度波動，并通過降低基線的波動來提高儀器的靈敏度。器的靈敏度。 溫差電堆本身既可以作為系統(tǒng)和環(huán)境之間的熱傳導(dǎo)通道，溫差電堆本身既可以作為系統(tǒng)和環(huán)境之間的熱傳導(dǎo)通道，又可以從其接點的溫差電勢得到產(chǎn)生沿線圈的熱流的溫又可以從其接點的溫差電勢得到產(chǎn)生沿線圈的熱流的溫度差，由溫度差求出熱流。度差，由溫度差求出熱流。實際儀器中使用了大量的實際儀器中使用了大量的( (上千的

50、上千的) )溫差電堆，這樣不溫差電堆，這樣不僅可以減少熱阻，而且可以從一系列溫差電堆熱流的總僅可以減少熱阻，而且可以從一系列溫差電堆熱流的總和得到總熱流，提高信號強度。和得到總熱流，提高信號強度。在新型的在新型的Calvet DSCCalvet DSC中，大量的半導(dǎo)體溫差電偶均勻中，大量的半導(dǎo)體溫差電偶均勻分布在樣品和參比樣品室周圍，半導(dǎo)體溫差電偶同時起分布在樣品和參比樣品室周圍，半導(dǎo)體溫差電偶同時起溫度測量和溫度控制的作用。溫度測量和溫度控制的作用。CalvetCalvet量熱儀的分辨率高量熱儀的分辨率高( (對應(yīng)于對應(yīng)于1010 5 5K K的的 T T ，分辨率，分辨率為為1010 5

51、5W W或或1010 2 2J J以上以上) )，其缺點是時間常數(shù)比較大。其詳，其缺點是時間常數(shù)比較大。其詳細的測量原理這里就不再介紹了。細的測量原理這里就不再介紹了。功率補償型功率補償型DSC功率補償型功率補償型DSC的主要特點是分別用獨立的加熱器的主要特點是分別用獨立的加熱器和傳感器來測量和控制樣品和參比物的溫度并使之相和傳感器來測量和控制樣品和參比物的溫度并使之相等?；蛘哒f，根據(jù)樣品和參比的溫度差對流入或流出等。或者說，根據(jù)樣品和參比的溫度差對流入或流出樣品和參比的熱量進行功率補償使之相等。樣品和參比的熱量進行功率補償使之相等。它所測量的參數(shù)是兩個加熱器它所測量的參數(shù)是兩個加熱器輸入功率

52、之差輸入功率之差d(Q)/dt或或dH/dt。功率補償型功率補償型DSCDSC的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu) 功率補償式差示掃描量熱儀示意圖功率補償式差示掃描量熱儀示意圖零點平衡原理： Dynamic Sample ChamberReference PanSample PanLidGas Purge InletChromel DiscHeating BlockChromel DiscAlumel WireChromel WireThermocouple JunctionThermoelectric Disc (Constantan) 功率補償型功率補償型DSC 工作基于工作基于 “零位平衡零位平衡”原原理理 零

53、位平衡的原理零位平衡的原理: DSC 熱系統(tǒng)可分為兩個控制環(huán)路，其中一個環(huán)路作為平均溫度控制，以保證按照一定的速率去升高樣品和參比物的溫度；第二個環(huán)路是用來保證當(dāng)樣品和參比物之間一旦出現(xiàn)溫度差時能夠調(diào) 節(jié)功率輸入以消除 這種溫度差 試樣在加熱的過程中，由于熱效應(yīng)與參比物之間出現(xiàn)溫差時，通過差試樣在加熱的過程中，由于熱效應(yīng)與參比物之間出現(xiàn)溫差時，通過差熱放大電路和差熱補償放大器，使得流入補償電熱絲的電流發(fā)生變化：熱放大電路和差熱補償放大器，使得流入補償電熱絲的電流發(fā)生變化： 當(dāng)試樣吸熱時，補償放大器使得試樣一邊的電流立即增大；當(dāng)試樣吸熱時，補償放大器使得試樣一邊的電流立即增大；反之則是反之則是參

54、比物一邊的電流增大，直到兩邊的熱量平衡，試樣與參比物的溫差參比物一邊的電流增大，直到兩邊的熱量平衡，試樣與參比物的溫差消失為止。消失為止。 這樣通過連續(xù)不斷地自動調(diào)節(jié)加熱器的功率，總是可以使這樣通過連續(xù)不斷地自動調(diào)節(jié)加熱器的功率，總是可以使樣品托架的溫度與參比托架的溫度保持相同。樣品托架的溫度與參比托架的溫度保持相同。 這時，有一個與輸入到樣品池的熱流和輸入到參比池的熱流之間的差這時，有一個與輸入到樣品池的熱流和輸入到參比池的熱流之間的差值成正比的信號值成正比的信號dH/dt 被饋送到記錄儀中，同時記錄樣品和參比物的被饋送到記錄儀中，同時記錄樣品和參比物的平均溫度，將信號平均溫度，將信號dH/

55、dt 對時間或平均溫度作圖就得到了功率補償型對時間或平均溫度作圖就得到了功率補償型DSC 曲線。曲線。 功率補償型功率補償型DSC特點：特點：精確的溫度控制和測量；更快的響應(yīng)時間和冷卻速度；精確的溫度控制和測量；更快的響應(yīng)時間和冷卻速度；高分辨率高分辨率 整個儀器由兩個控制系統(tǒng)進行監(jiān)控。整個儀器由兩個控制系統(tǒng)進行監(jiān)控。（1）控制溫度，使樣品和參比物在預(yù)定的速率下升）控制溫度，使樣品和參比物在預(yù)定的速率下升溫或降溫。溫或降溫。（2）用于補償樣品和參比物之間所產(chǎn)生的溫差，這）用于補償樣品和參比物之間所產(chǎn)生的溫差，這個溫差是由樣品的放熱或吸熱效應(yīng)產(chǎn)生的。個溫差是由樣品的放熱或吸熱效應(yīng)產(chǎn)生的。通過功率

56、補償使樣品和參比物的溫度保持相同通過功率補償使樣品和參比物的溫度保持相同 W=dQs/dt dQR/dt=dH/dt其中，其中， W為所補償?shù)墓β蕿樗a償?shù)墓β? Qs為樣品的熱量；為樣品的熱量；QR 為為參比物的熱量參比物的熱量; dH/dt為單位時間內(nèi)的焓變，即熱流率，為單位時間內(nèi)的焓變，即熱流率，單位一般為單位一般為mJ/s。 儀器樣品和參比物的加熱器電阻相等，儀器樣品和參比物的加熱器電阻相等，RS=RR，當(dāng)樣，當(dāng)樣品沒有任何熱效應(yīng)時品沒有任何熱效應(yīng)時IS2 RSIR2 RR如果樣品產(chǎn)生熱效應(yīng)，樣品和參比物之間產(chǎn)生溫差，如果樣品產(chǎn)生熱效應(yīng)，樣品和參比物之間產(chǎn)生溫差，儀器立即進行功率補償。

57、所補償?shù)墓β蕿閮x器立即進行功率補償。所補償?shù)墓β蕿? W=IS2RS IR2RR令令RS=RR=R，即得，即得: W=R(IS + IR)( IS IR)定義定義IS + IR = IT上式化為上式化為 W= IT(ISR IRR) W= IT(VS VR)=IT V式中，式中， IT為總電流，為總電流， V為電壓差。為電壓差。如果如果IT為常數(shù)，則為常數(shù)，則 W與與 V成正比。因此用成正比。因此用 V可直接表示可直接表示dH/dt。熱量變化與曲線峰面積的關(guān)系熱量變化與曲線峰面積的關(guān)系 考慮到樣品發(fā)生熱量變化（吸熱或放熱）時，此種變化除考慮到樣品發(fā)生熱量變化（吸熱或放熱）時，此種變化除傳導(dǎo)到溫

58、度傳感裝置（熱電偶、熱敏電阻等）以實現(xiàn)樣品傳導(dǎo)到溫度傳感裝置（熱電偶、熱敏電阻等）以實現(xiàn)樣品（或參比物）的熱量補償外，尚有一部分傳導(dǎo)到溫度傳感（或參比物）的熱量補償外，尚有一部分傳導(dǎo)到溫度傳感裝置以外的地方，裝置以外的地方，因而差示掃描量熱曲線上吸熱峰或放熱因而差示掃描量熱曲線上吸熱峰或放熱峰面積實際上僅代表樣品傳導(dǎo)到溫度傳感器裝置的那部分峰面積實際上僅代表樣品傳導(dǎo)到溫度傳感器裝置的那部分熱量變化。熱量變化。 樣品真實的熱量變化與曲線峰面積的關(guān)系為mH=KA m樣品質(zhì)量； H單位質(zhì)量樣品的焓變； A與H相應(yīng)的曲線峰面積； K修正系數(shù)，稱儀器常數(shù)。 典型的差示掃描量典型的差示掃描量熱（熱（DSC

59、）曲線以熱）曲線以熱流率（流率（dH/dt）為縱坐）為縱坐標、以時間（標、以時間（t）或溫）或溫度（度（T）為橫坐標，）為橫坐標，dH/dt-t（或（或T）曲線。）曲線。 曲線離開基線的位曲線離開基線的位移即代表樣品吸熱或移即代表樣品吸熱或放熱的速率（放熱的速率（mJs-1），而曲線中峰或），而曲線中峰或谷包圍的面積即代表谷包圍的面積即代表熱量的變化。熱量的變化。 因而因而差示掃描量熱差示掃描量熱法可以直接測量樣品法可以直接測量樣品在發(fā)生物理或化學(xué)變在發(fā)生物理或化學(xué)變化時的熱效應(yīng)化時的熱效應(yīng)。典典型型的的DSC曲曲線線在在DSC 分析中蛋分析中蛋白質(zhì)變性過程的白質(zhì)變性過程的基本參數(shù)有基本參數(shù)有

60、: 蛋白質(zhì)的變性溫度Tm ,蛋白質(zhì)變性的熱容Cp,蛋白質(zhì)變性的焓H（見右圖）。 此外,曲線上峰面積與峰高的比值可用于表示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中間態(tài)的情況 DSC曲線圖 差示掃描量熱儀結(jié)構(gòu)差示掃描量熱儀結(jié)構(gòu)熱分析儀大致由下列幾部分組成：熱分析儀大致由下列幾部分組成：溫度程序控制系統(tǒng)：整個實驗過程中溫度變化的順溫度程序控制系統(tǒng)：整個實驗過程中溫度變化的順序、變溫的起始溫度和終止溫度、變溫速率、恒溫序、變溫的起始溫度和終止溫度、變溫速率、恒溫溫度及恒溫時間等的控制溫度及恒溫時間等的控制測量系統(tǒng)測量系統(tǒng)( (物理性能的測量物理性能的測量) )：將樣品的某種物理量：將樣品的某種物理量轉(zhuǎn)換成電信號，進行放大，用來進一步處理