植物體內(nèi)轉(zhuǎn)化酶活性的測定

1、植物體內(nèi)轉(zhuǎn)化酶活性的測定轉(zhuǎn)化酶又稱蔗糖酶（BA味喃型果糖甘一果糖水解酶），是一種水解酶。植物體的庫組織中，一般含有較高活性的轉(zhuǎn)化酶。它能將植物體內(nèi)的主要同化產(chǎn)物蔗糖不可逆地水解為葡萄糖和果糖， 為細胞的可溶性糖類貯庫提供可利用六碳糖， 以用于細胞壁、貯藏多糖及果聚糖的生物合成，并通過與呼吸作用偶聯(lián)的氧化磷酸化產(chǎn)生能量。所以， 轉(zhuǎn)化酶與植物組織的生長有密切關(guān)系，是衡量同化產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和利用，植物細胞代謝及生長強度的指標?！驹怼哭D(zhuǎn)化酶可將非還原性糖的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。將從植物組織中提取的酶液與蔗糖溶液保溫作用一定時間后，測定產(chǎn)生的還原糖的量來表示轉(zhuǎn)化酶活性的大小。在堿性條件下，還原糖與3,5

2、- 二硝基水楊酸共熱，3,5- 二硝基水楊酸被還原為 3-氨基 -5- 硝基水楊酸（棕紅色物質(zhì)），還原糖則被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色深淺的程度量呈一定的比例關(guān)系，在540nm波長下測定棕紅色物質(zhì)的消光值，查對標準曲線可求出樣品中還原糖的 含量。通常，在測定過程中，溶液的pH對酶活性影響很大。不同的酶及不同材料 中同一種酶都有其最適的pH值。轉(zhuǎn)化酶有兩個影響水解蔗糖能力的解離基團， 一個PKa約為7,另一個PKa約為3。不同植物材料的轉(zhuǎn)化酶中這兩個基團的含 量不同，它們的最適pH也不同（最適pH在左右的為中性轉(zhuǎn)化酶，最適pH在以下 的為酸性轉(zhuǎn)化酶）。所以，在

3、測定材料中轉(zhuǎn)化酶的活性之前，首先要選擇適宜的PH值?！静牧?、儀器與試劑】1材料：植物組織2試劑：（ 1） 提取緩沖液：100 mmol/L Tris-HCl 緩沖液， 內(nèi)含5 mmol/L MgCl2, 2 mmol/LEDTA-Na2,2% 乙二醇，%牛血清蛋白（BSA） ， 2%PV，P 5 mmol/LDTT。(2)透析緩沖液：25 mmol/L Tris-HCl緩沖液，內(nèi)含 mmol/L MgC2, 1 mmol/LEDTA-Na1% 乙二醇，1 mmol/L DTT。(3)酶反應(yīng)液：80 mmol/L乙酸-K3PO和緩沖液，內(nèi)含50 mmol/L蔗糖。(4)葡萄糖標準液：1 mg/m

4、L(5) 3, 5-二硝基水楊酸試劑：精確秤取1g 3, 5-二硝基水楊酸，溶于20 ml 2 mol/L NaOHg液中，加入50 ml蒸儲水，再加入30 g灑石酸鈉，待溶解后用蒸儲水定容 至100 ml 0蓋緊瓶塞，勿讓CO!入。若有渾濁可過濾后使用。材料：小麥葉片、籽粒。3.設(shè)備冷凍離心機，恒溫水浴，分光光度計，研缽一套，磁力攪拌器，天平(感量)，1 mL移液管5支，5 mL帶塞試管10支?！痉椒ㄅc步驟】1 .酶的提?。悍Q取1g植物葉片，置于預(yù)冷的研缽中，分批加入 5ml提取緩沖液，冰 浴研磨提取，2度下10000轉(zhuǎn)離心20分鐘，上清液3ml裝入透析袋中，透析袋置于透析緩沖液 中4度透析

5、過夜，期間更換透析液 3次，透析后酶液定容5ml備用。2 .酶反應(yīng)：取3支5 mL具有試管，加入mL反應(yīng)液和50 L透析后的酶液， 30c水浴中反應(yīng)10 min中止反應(yīng)。用煮死酶液作對照(煮沸 10min)。3 .還原糖含量的測定：往各反應(yīng)試管中再加 3, 5-二硝基水楊酸試劑1 mL 沸水浴5 min,冷卻至室溫，于540nm比色測定生成的還原糖量。4 .標準曲線制作：取7支5 ml具塞試管，編號，按下表配置加入各種試劑3, 5-二硝基水楊酸（ml）葡錮糖含量（mg）0A5405.結(jié)果計算：酶活力以mg葡萄糖 g-1FW h-1表示。酶活力（mg 葡萄糖 g-1 FW h-1） =一C Vt

6、- n FW t Vs【結(jié)果與計算】轉(zhuǎn)化酶的活性用還原糖量（mg/ g - fw h）表示，計算公式如下:C表示從標準曲線查得的葡萄糖量（mg ;FW1示組織鮮重（g）;t表示反應(yīng)時間（h）;Vt表示提取酶液的總體積（mD ;VS表示測定時取用酶液體積（ml）;n表示提取液測定中的稀釋倍數(shù)。轉(zhuǎn)化酶的測定轉(zhuǎn)化酶又稱蔗糖酶，是一種水解酶，植物體的庫組織中，一般含有較高活性的轉(zhuǎn)化酶，它能將植物體內(nèi)的主要同化產(chǎn)物一一蔗糖不可逆的水解為葡萄糖和果糖，為細胞的可溶性糖貯庫提供可利用六碳糖，以用于細胞壁、貯藏多糖及果聚糖的生物合成，并通過與呼吸作用偶聯(lián)的氧化磷酸化產(chǎn)生能量，所以，轉(zhuǎn)化酶與植物組織的生長有密切

7、關(guān)系，是衡量同化產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和利用、植物細胞代謝及生長強度的指標。試齊I：1、10姍糖溶液2、葡萄糖標準液（500g/ml ）3、l的磷酸緩沖液4、（DNS 3, 5二硝基水楊酸：將 6.3g二硝基水楊酸和 262 ml 2mol/l NaOH 溶液，加到500ml含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加 5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻 后加蒸儲水定容至1000ml,貯于棕色瓶中備用。方法：1、酶的提?。?g樣品剪碎后，用預(yù)冷的蒸儲水在冰浴中研磨成勻漿，定容至100ml,在冰箱中浸提3小時，4000轉(zhuǎn)離心15分鐘，上清液即為酶的粗提液。2、酶活性的測定：吸酶液 2ml,放入試管中，再加

8、入的緩沖液5ml及10滯糖溶液1ml,在37度水浴中保溫30分鐘，取出后立即按 3, 5二硝基水楊酸法測定還原糖的含量。以煮沸酶?夜10分鐘鈍化酶的試管作對照。3、還原糖標準曲線的制作及還原糖含量的測定標準曲線：取 6支20ml刻度試管，編號，按下表配置不同濃度的葡萄糖標準液:2 口 呂勺123456葡萄糖原液量（ml）0加蒸儲水量（ml）0葡萄糖濃度（w0100200300400500g/ml )在上述各管中分別加入 3 , 5二硝基水楊酸試劑，在沸水浴中加熱5分鐘，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，加蒸儲水定容至20ml,混勻，以1號管為空白，測 540nm波長下的OD值。以O(shè)D值為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標，繪制標準曲線。酶反應(yīng)液中還原糖的含量的測定：吸取 2ml反應(yīng)液，加入3, 5二硝基水楊酸試劑，沸 水浴中煮沸5分鐘，冷卻定容至 20ml ,測定540nm波長下的OD值，查標準曲線得