酶類實(shí)驗(yàn)測定方法

1、實(shí) 驗(yàn) 方 法李菁華2016.6一葉片相對(duì)含水量（RWC）采用烘干稱重法測定將葉片稱鮮重（Fw）等量兩份，然后一份浸入去離子水8h后稱其飽和鮮重（Tw），將另一份材料于105烘箱中殺青30min，再在80下烘干48h至恒重記為干重（Dw），按如下公式計(jì)算 （Fw-Dw） 葉片相對(duì)含水量（%）=×100% （Tw-Dw）鄒琦.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)M .北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000二根系活力采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法測定一、原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是標(biāo)準(zhǔn)氧化電位為80mV的氧化還原色素，溶于水中成為無色溶液，但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比較穩(wěn)定，不會(huì)

2、被空氣中的氧自動(dòng)氧化，所以TTC被廣泛地用作酶試驗(yàn)的氫受體，植物根系中脫氫酶所引起的TTC還原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，蘋果酸得到增強(qiáng)，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC還原量能表示脫氫酶活性并作為根系活力的指標(biāo)。二、試劑 1）乙酸乙酯（分析純）2）連二亞硫酸鈉（Na2S2O4），分析純，粉末，俗稱保險(xiǎn)粉。3）0.4%TTC（又名 紅四氮唑、2,3,5-氯化三苯基四氮唑）溶液：準(zhǔn)確稱取TTC 0.4g，溶于少量水中，定容到100ml。4）磷酸緩沖液（1/15mol·L-1，pH7.0）:A液：稱取純Na2HPO4·2H2O 11.876g溶于蒸餾水中成1000ml。B液

3、：稱取純KH2PO4 9.078g溶于蒸餾水中成1000ml。用時(shí)取A液60ml，B液40ml混合即成。5）1mol·L-1硫酸：用量筒取比重1.84的濃硫酸5.5ml，邊攪拌邊加入盛有100ml蒸餾水的燒杯中，冷卻定容至100ml。三、實(shí)驗(yàn)步驟 1）TTC標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取0.4%TTC溶液0.2ml放入10ml容量瓶中，加少許Na2S2O4粉搖勻后立即產(chǎn)生紅色的TTF。再用乙酸乙酯定容至刻度，搖勻。然后分別取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF25g、50g、100g、150g、200g的

4、標(biāo)準(zhǔn)比色系列，以乙酸乙酯作參比，在485nm波長下測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2）取出大豆根系洗凈，用濾紙吸干水分，稱取1cm長的根尖樣品0.2g，放入10ml燒杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸緩沖液各5ml，把根充分浸沒在溶液內(nèi)，在37下暗保溫13h（2h），此后加入1mol·L-1硫酸2ml，以停止反應(yīng)。（與此同時(shí)做一空白實(shí)驗(yàn)，先加硫酸，再加根樣品，10min后其他操作同上）。3）把根取出，吸干水分后與乙酸乙酯3-4ml和少量石英砂一起在研缽內(nèi)磨碎，以提出TTF。紅色提取液移入試管，并用少量乙酸乙酯把殘?jiān)礈?-3次，皆移入試管，最后加乙酸乙酯使總量為10ml，用分光光度計(jì)在波

5、長485nm下比色，以空白實(shí)驗(yàn)作參比讀出吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出四氮唑還原量四、結(jié)果計(jì)算 四氮唑還原強(qiáng)度（mg·g-1根鮮重h-1）四氮唑還原量（mg）/根重（g）×時(shí)間（h）王晶英，敖紅，張杰，曲桂琴.植物生理生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)與原理M .哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)出版社，2003.7三氮藍(lán)四唑（NBT）法測定超氧化物岐化酶（SOD）一、原理SOD是含金屬輔基的酶。高等植物含有兩種類型的SOD：MnSOD和Cu.ZnSOD，它們都催化下列反應(yīng)：由于超氧自由基（O2.）為不穩(wěn)定自由基，壽命極短，測定SOD活性一般為間接方法。并利用各種呈色反應(yīng)來測定SOD的活力。核黃素在有氧條件下能

6、產(chǎn)生超氧自由基負(fù)離子O2.，當(dāng)加入NBT后，在光照條件下，與超氧自由基反應(yīng)生成單甲臜（ 黃 色 ），繼而還原生成二甲臜，它是一種藍(lán)色物質(zhì)，在560nm波長下有最大吸收。當(dāng)加入SOD時(shí)，可以使超氧自由基與H+結(jié)合生成H2O2和O2，從而抑制了NBT光還原的進(jìn)行，使藍(lán)色二甲臜 生成速度減慢。通過在反應(yīng)液中加入不同量的SOD酶液，光照一定時(shí)間后測定560nm波長下各液光密度值，抑制NBT光還原相對(duì)百分率與酶活性在一定范圍內(nèi)呈正比。反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說明酶活性愈低。二、試劑1. 0.05mol/L磷酸緩沖液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液: 取Na2HPO4·12

7、H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。分別用蒸餾水定容到1000ml。0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分別取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸餾水定容至1000ml。2. 14.5mM甲硫氨酸溶液：稱取1.0818g Met用磷酸緩沖液（pH7.8）定容至500ml。3. 3mM EDTA-Na2溶液：稱取0.1117g EDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至100ml。4. 60M核黃素溶液：稱取0.0023g 核

8、黃素用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存。5. 2.25mM 氮藍(lán)四唑(NBT)溶液：稱取0.092g NBT用PBS定容至50ml，避光保存。三、實(shí)驗(yàn)步驟1. 酶液提取 稱取0.5g（可視情況調(diào)整）樣品（新鮮葉片或根系）洗凈后置于預(yù)冷的研缽中，分三次加入10ml 50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4、12000g下離心20min，上清夜即為SOD粗提液。2. 酶活性測定（1）反應(yīng)混合液配制(以60個(gè)樣為準(zhǔn))：分別取配好的Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液6ml， NBT溶液6ml，核黃素溶液6ml,混合后充分搖勻；（2）分別取2.9ml

9、反應(yīng)混合液和0.1ml（可視情況調(diào)整）酶液于指形管中此即反應(yīng)管；同時(shí)做兩支對(duì)照管，其中1支試管加2.9ml反應(yīng)混合液和0.1ml PBS（不加酶液）作為最大光還原管，另1支加2.9ml反應(yīng)混合液和0.1ml PBS同時(shí)用錫箔紙包好遮光用于測定時(shí)調(diào)零。（3）將試管置于光照培養(yǎng)箱中在4000 lux光照25下反應(yīng)20min；（4）反應(yīng)結(jié)束后以不照光的對(duì)照管調(diào)零，分別測定各管在560nm下的吸光度（OD560）3. 計(jì)算結(jié)果已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50為一個(gè)酶活單位（U），按下式計(jì)算活性n=(ODmax-OD560)/ODmax/2SOD總活性 ( Ack-AE )×V/（

10、1/2Ack×W×Vt） SOD比活力SOD總活性/蛋白質(zhì)含量SOD總活性以鮮重酶單位每克表示（u/g FW）；比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示；Ack為照光對(duì)照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積（ml）；Vt為測定時(shí)的酶液用量（ml）；W為樣品鮮重（g）；蛋白質(zhì)含量單位為mg/g。四、注意事項(xiàng)1. 酶液提取須在4下進(jìn)行，提取后立即進(jìn)行測定，冰箱中放幾小時(shí)活性也會(huì)下降；2. 植物中的酚類物質(zhì)對(duì)測定有干擾，制備粗酶液時(shí)可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或pvpp等，盡可能除去植物組織中的酚類等次生物質(zhì)。3. NBT反應(yīng)液配好后過濾除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要

11、避光保存，充分搖勻然后使用。4. 加反應(yīng)液時(shí)最好在暗光下進(jìn)行；5. 核黃素產(chǎn)生O2.，NBT還原為藍(lán)甲臜都與光照密切相關(guān)，照光強(qiáng)度和時(shí)間要嚴(yán)格控制。光照培養(yǎng)箱內(nèi)壁裱糊錫箔紙，使箱內(nèi)均勻光照約達(dá)40molm-2s-1，同時(shí)使照光時(shí)間一樣，選擇試管盡量一致，照光結(jié)束后測一個(gè)拿一個(gè)（最好晚上做）（溫度高時(shí)照光時(shí)間縮短，溫度低時(shí)延長）；6. 測定活性時(shí)加入的酶量，以能抑制反應(yīng)的50為佳。（一個(gè)酶單位相當(dāng)于引起反應(yīng)液達(dá)到半抑制時(shí)酶的用量，即以能抑制反應(yīng)50的酶量為一個(gè)SOD酶活性單位。）（反應(yīng)液中加酶液與PBS調(diào)零差異不大，反應(yīng)液調(diào)零與其它兩個(gè)則有一定差異。李合生方法：2支CK管均以緩沖液代替酶液。）五

12、、參考文獻(xiàn)王晶英，敖紅，張杰，曲桂琴.植物生理生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)與原理M .哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)出版社，2003.7李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)M.高等教育出版社，2000：267268四愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）一、原理在過氧化物酶催化下，H2O2將愈創(chuàng)木酚氧化成茶褐色產(chǎn)物。此產(chǎn)物在470nm處有最大光吸收，故可通過測470nm下吸光值變化測定過氧化物酶活性。二、試劑1. 0.2mol/L磷酸緩沖液(pH6.0)：A母液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：取NaH2PO4&

13、#183;2H2O（分子量156.01）31.2g。分別用蒸餾水定容到1000ml。0.2mol/L磷酸緩沖液(pH6.0)的配制：分別取A母液(Na2HPO4 )12.3ml和B母液(NaH2PO4 ) 87.7ml混勻即為100mlPBS(0.2M，pH6.0)。2. 30H2O23. 愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基酚）三、步驟1. 酶液提取 稱取0.5g（可視情況調(diào)整）樣品（新鮮葉片或根系）洗凈后置于預(yù)冷的研缽中，分三次加入10ml 50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4、12000g下離心20min，上清夜即為酶粗提液。2. 酶活性測定（1）反應(yīng)混合液

14、的配制：取50mlPBS（pH6.0，0.2M）緩沖液于燒杯中，加入28l愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基酚）于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至溶解，待溶液冷卻后加入19l 30的H2O2，混勻后保存于冰箱中備用。（2）酶活性測定：取3ml反應(yīng)液并加入40l酶液后測定OD470值每30s的變化，記4次數(shù)。以PBS代替酶液為對(duì)照調(diào)零，3. 計(jì)算結(jié)果以每min OD值變化（升高）0.01為1個(gè)酶活性單位（u）。，按下式計(jì)算活性POD活性=（A470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） (u/g FW)A470：為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反應(yīng)時(shí)間(min

15、)；Vt為提取酶液總體積（ml）；Vs為測定時(shí)取用酶液體積（ml）。四、注意事項(xiàng)1. 反應(yīng)液配制時(shí)由于愈創(chuàng)木酚難溶，應(yīng)加熱一段時(shí)間。加入H2O2前注意溶液冷卻，防止H2O2的揮發(fā)。2. 由于該反應(yīng)迅速，加入酶液要立即進(jìn)行吸光值的測定。五、參考文獻(xiàn)李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)M.高等教育出版社，2000：267268五過氧化氫酶（CAT）的測定一、原理過氧化氫酶(Catalase,CAT),是一種廣泛存在于生物組織中的氧化還原酶，它能催化H2O2分解為水和氧氣,清除組織中的過氧化氫。H2O2在240nm處有一個(gè)吸收高峰,其吸光度與H2O2的含量成正比,過氧化氫酶能分解過氧化氫,使反應(yīng)溶液吸

16、光度(A240)隨反應(yīng)時(shí)間而降低。單位時(shí)間內(nèi)吸收的差值就是過氧化氫酶的活性。二、試劑1 0.15mol/L磷酸緩沖液（pH7.0）： 取A母液(Na2HPO4) 228.75 ml 和B母液(NaH2PO4) 146.25 ml混合后用蒸餾水定容至500ml。2. 30H2O2三、步驟1. 酶液提取 稱取0.5g（可視情況調(diào)整）樣品（新鮮葉片或根系）洗凈后置于預(yù)冷的研缽中，分三次加入10ml 50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4、12000g下離心20min，上清液即為CAT粗提液。2 酶活性測定（1）反應(yīng)混合液的配制：取100ml PBS（0.1

17、5M，pH7.0），加入0.05ml 30%的H2O2搖勻即可。（2）取2.9 ml反應(yīng)液加入0.1ml酶液，以PBS為對(duì)照調(diào)零，測定OD240值每30s的變化，記4次數(shù)。3 結(jié)果計(jì)算：酶活性計(jì)算：以每min OD值減少0.01為1個(gè)酶活性單位（u）。CAT=A240×Vt /（W×Vs×0.01×t） (u/g FW)A240：為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反應(yīng)時(shí)間(min)；Vt為提取酶液總體積（ml）；Vs為測定時(shí)取用酶液體積（ml）。四、注意事項(xiàng)H2O2易分解，應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。五、參考文獻(xiàn)李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)M.高等

18、教育出版社，2000：267268六抗壞血酸過氧化物酶（APX）的測定一、原理AsA-POD是葉綠體內(nèi)專一的清除H2O2的酶，催化抗壞血酸(AsA)與H2O2反應(yīng)，使AsA氧化成單脫氫抗壞血酸（MDAsA）。隨著AsA被氧化，溶液的OD290值下降，根據(jù)單位時(shí)間內(nèi)OD290的減少值，計(jì)算AsA-POD活性。AsA氧化量按消光系數(shù)2.8/(mmol/L)·cm（2.8mM-1.cm-1）計(jì)算，酶活性用µmol AsA·g/FW·h 表示。二、試劑（按50個(gè)樣計(jì)算）：1. 0.05 mol/L 磷酸緩沖液（pH7.0）的配制：母液的配制方法同前取A母液Na2

19、HPO4 61.0ml，加入B母液NaH2PO4 39.0ml，用去離子水定容到400ml。2. 0.1 mM EDTA-Na2：取0.0093g EDTA-Na2用PBS（pH7.0）緩沖液定容到250ml（372.24 g/M×0.1mM×500ml=0.01861 g）；3. 5 mM AsA：取0.044g抗壞血酸用PBS（pH7.0）緩沖液緩沖液定容到50ml（現(xiàn)用現(xiàn)配）；4. 20 mM H2O2：取0.2ml30% H2O2用去離子水稀釋到100ml。三、步驟1. 酶液提取方法同SOD.2. 酶活性的測定以3 ml體系測定，則取0.10 ml 酶液（可視情況調(diào)

20、整），加入2.60 ml 含0.1mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.15ml 5 mM的AsA，最后加入0.15 ml 20mM H2O2，立即在20下測定OD290值每30s的變化（測定時(shí)間內(nèi)變化大可測定的時(shí)間短點(diǎn)，否則長點(diǎn)），共計(jì)四次。3. 酶活性計(jì)算以1min內(nèi)A290變0.01定義為一個(gè)酶活性單位u，酶活性以u(píng)/g(FW)表示APX活性（u/g）= A290.VT/0.01VS.t.WA290表示在290nm處吸光值的變化VT 提取液總體積；VS 酶液的體積；W葉片的鮮重 ；t反應(yīng)時(shí)間VC-POD活性（umolVC.g-1FW.h-1）=（A

21、*Vt*v*60*1000)/(FW*Vs*2.8*t) 式中：Vt：酶液總體積（ml）；FW;樣品鮮重（g）；Vs：測定時(shí)取酶液的量（ml）；v：反應(yīng)液體積（ml）；A;A290 0-30s的差值；t：反應(yīng)時(shí)間min；2.8：VC的毫摩爾消光系數(shù)（2.8mM-1.cm-1）四、注意事項(xiàng)加入H2O2后應(yīng)混勻反應(yīng)液然后快速進(jìn)行比色測定。五、參考文獻(xiàn)高俊鳳.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)M.高等教育出版社，2006：221223計(jì)算公式：    OD/t×Vr×VT     

22、60;A×d×Vt×W OD為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化（40秒吸光度0秒吸光度）；t為反應(yīng)時(shí)間（40秒）；Vr為反應(yīng)液體積（2mL）；VT提取液體積（1.6mL）；A為消光系數(shù)（2.8mM-1.cm-1）；d為比色杯厚度（1cm）；Vt測定液體積（0.1mL）；W為樣品鮮重（0.2g）。七羥胺氧化法測定超氧陰離子產(chǎn)生速率一、原理O2-與羥胺反應(yīng)產(chǎn)生NO2，NO2在對(duì)氨基苯磺酸和-萘胺作用下，生成粉紅色的偶氮染料，該染料在530nm處有最大光吸收，根據(jù)OD530可計(jì)算出樣品中的O2-的含量。二、試劑1. 0.05mol/L磷酸緩沖液(PBS，pH7.8)：A

23、母液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。分別用蒸餾水定容到1000ml。0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分別取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸餾水定容至1000ml。2. 10mM鹽酸羥胺：稱取0.05g鹽酸羥胺用蒸餾水定容至100ml。3. 17mM對(duì)氨基苯磺酸(磺胺酸、4-苯胺磺酸) C6H7NO3S，173.20：稱取0.2944g對(duì)氨

24、基苯磺酸用冰醋酸溶液（冰醋酸：水=1：3）定容至100ml4. 7mM -萘胺：稱取0.1002g萘胺用冰醋酸溶液（冰醋酸：水=3：1）定容至100ml。5. 亞硝酸鈉三、步驟1. 酶液提取 稱取0.5g（可視情況調(diào)整）樣品（新鮮葉片或根系）洗凈后置于預(yù)冷的研缽中，分三次加入10ml 50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4、12000g下離心20min，上清液即為酶粗提液。2. 亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作2.1系列濃度NaNO2溶液的配制取50nmol·ml1NaNO2母液，分別稀釋成0、10、20、30、40和50、nmol·ml1

25、的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液。2.2取7支試管，編06號(hào)，分別加10、15、20、30、40、50、nmol·ml1NaNO2標(biāo)準(zhǔn)稀釋液1ml，0號(hào)管加蒸餾水1ml，然后各管再加50mmol·L1磷酸緩沖液1ml，17 mmol·L1對(duì)氨基苯磺酸1ml和7 mmol·L1-萘胺1ml，置于25顯色20min后，以0號(hào)管作空白對(duì)照，在530nm波長處測定吸光度（A）值。方法二：標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取亞硝酸鈉6.9 g定容至1000ml，為0.1 mol/L亞硝酸鈉溶液，分別取2.5、5、7.5、10、12.5 ml定容至50 ml，制成5、10、15、20、25 mmol/L

26、的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取各標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，重復(fù)以上測定的步驟，于波長530 nm測定OD值，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，亞硝酸鈉濃度（mmol/L）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。高俊鳳：稱取NaNO2（AR級(jí)）0.1g蒸餾水定容至100ml，搖勻后取5ml用蒸餾水定容至1000ml即為5mg/l的標(biāo)準(zhǔn)液。2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制以16號(hào)管亞硝酸根（NO2）濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值作縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3. O2-產(chǎn)生速率測定（1）取0.5ml提取液中加入0.5ml PBS(0.05M，pH7.8)，1ml 10mM鹽酸羥胺溶液后搖勻，同時(shí)做一對(duì)照管以PBS代替樣品提取液；（2）在25下保溫1小時(shí)，若測定葉片保溫后需加入2

27、ml乙醚萃取Chl；（3）依次先加入1ml 17mM對(duì)氨基苯磺酸，再加入1ml 7mM-萘胺，混合后渦旋；（4）在25下保溫20min后在3000g離心3min，（或置于冰箱待測）；（5）以對(duì)照管調(diào)零,取粉紅色水相液測定OD530。4. 計(jì)算結(jié)果根據(jù)測得的OD530，查NO2-標(biāo)準(zhǔn)曲線得到NO2-，依照羥胺與O2-的反應(yīng)式：NH2OH2O2-H+NO2-H2O2 H2O 計(jì)算O2-，即NO2-×2=O2-。再根據(jù)樣品與羥胺反應(yīng)的時(shí)間和樣品中的蛋白質(zhì)含量，求得O2-產(chǎn)生速率（nmol min-1mg-1蛋白，也可用nmol min-1g-1鮮重）。根據(jù)所測得的A530值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查

28、得樣品中NO2濃度，按公式（1）即可計(jì)算出樣品中NO2濃度。然后依據(jù)羥胺與O2的上述反應(yīng)，從NO2對(duì)O2進(jìn)行化學(xué)計(jì)量，按公式（2）計(jì)算，即將按公式（1）計(jì)算得到的NO2濃度乘2，得O2濃度。也可根據(jù)被測樣品與羥胺反應(yīng)的時(shí)間和樣品中蛋白質(zhì)含量，按公式（3）求得O2的生產(chǎn)率。 從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得NO2（nmol）×提取液總量（ml）NO2含量（nmol·g1Fw）=（1） 樣品重（g）×測定時(shí)提取液用量（ml） 將所得NO2含量代入下式計(jì)算，即求出O2含量。O2含量= NO2（nmol·g1Fw）×2 （2）將公式（2）所得的O2濃度及樣品中蛋白質(zhì)含量

29、，依下式計(jì)算出O2產(chǎn)生速率。 O2（nmol）O2產(chǎn)生速率（nmol·mg1蛋白·min1）= （3） 蛋白質(zhì)（mg）× 反應(yīng)時(shí)間（min） 四、注意事項(xiàng)1. 樣品中若含有大量葉綠素將干擾測定，可在樣品與羥胺溫浴后，加入等體積的乙醚萃取葉綠素，再加入對(duì)氨基苯磺酸和-萘胺作NO2-的顯色反應(yīng)；2. 應(yīng)用羥胺反應(yīng)來檢測生物材料的含量，必須嚴(yán)格控制反應(yīng)系統(tǒng)的pH（8.0，并盡可能降低反應(yīng)液中的溶解氧和Fe的含量。因?yàn)榱u胺自動(dòng)氧化隨反應(yīng)系統(tǒng)的pH值升高而加強(qiáng)，同時(shí)隨反應(yīng)液的溶解氧和Fe含量的增加而加強(qiáng)。3. 加樣的順序不能顛倒，25是它的反應(yīng)溫度。五、參考文獻(xiàn)王愛國，羅廣

30、華植物的超氧物自由基與羥胺的反應(yīng)J植物生理學(xué)通訊，1990，(6)：55-57高俊鳳.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)M.高等教育出版社，2006：221223八考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定可溶性蛋白質(zhì)含量一、原理考馬斯亮藍(lán)G-250（Coomassie brilliant blue G-250）測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。該染料在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中當(dāng)它與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，前者最大光吸收?65 nm，后者在595 nm。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（1-1000 mg），蛋白質(zhì)與色素結(jié)合物在595nm波長下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。二、試劑1. 0.

31、05mol/L磷酸緩沖液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。分別用蒸餾水定容到1000ml。0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分別取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸餾水定容至1000ml。2. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱取0.01g牛血清蛋白，溶于蒸餾水并定容至10ml，制成1000g/ml的原液（必須是牛血清蛋白向水中溶

32、解，不能顛倒）。3. 考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑：稱取0.1g考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50ml 95乙醇中，加入100 ml 85（W/V）的磷酸，再用蒸餾水定容到1L。在黑暗中靜置2小時(shí)后用漏斗過濾并貯于棕色瓶中，常溫下可在暗中保存一個(gè)月。4. 95乙醇5. 85磷酸三、步驟1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作（蛋白質(zhì)含量為0100ug/ml）取6支具塞試管（10ml），編號(hào)后，按下表加入試劑。管號(hào) 1 2 3 4 5 61000ug/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白液：ml 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1蒸餾水：ml 1.00 0.98 0.96 0.94 0.92 0.90G-250試劑：ml 5 5

33、 5 5 5 5蛋白質(zhì)含量：g 0 20 40 60 80 100A595nm蓋上塞子，將各管中溶液縱向倒置混合，搖勻。放置5min后在595nm波長下比色測定（比色應(yīng)在1h內(nèi)完成）。記錄各管測定的OD595 nm 光密度值，并以牛血清蛋白含量（ug）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線（或者計(jì)算回歸方程）。2. 酶液提取 稱取0.5g（可視情況調(diào)整）樣品（新鮮葉片或根系）洗凈后置于預(yù)冷的研缽中，分三次加入10ml 50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4、12000g下離心20min，上清液即為蛋白粗提液。3. 酶活性測定取1ml酶液，加入5ml

34、考馬斯亮藍(lán)溶液，搖勻，反應(yīng)2min后測OD595。3. 計(jì)算結(jié)果蛋白質(zhì)含量（mg/g）=（查得的蛋白質(zhì)含量/ug×提取液總體積/ml）/（樣品鮮重/g×測定時(shí)所用提取液體積/ml）Protein content(mg/g)=(C/ug×VT/ml)/(W/g×Vs/ml×1000)C為可溶性蛋白質(zhì)含量（mg/g ），VT為提取液總體積（ml）；Vs為測定時(shí)所用提取液體積（ml）；W為樣品鮮重（g）。四、注意事項(xiàng)1.制作通過原點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以含0g蛋白質(zhì)液調(diào)零。2.還原物質(zhì)，其他酚類物質(zhì)及檸檬酸對(duì)此反應(yīng)有影響。3.此方法反應(yīng)十分迅速，2分鐘即達(dá)到

35、平衡，其結(jié)合物在室溫下1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。五、參考文獻(xiàn)鄒琦.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)M .北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000九硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛（MDA）含量一、原理MDA在高溫、酸性條件下與硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)，形成在532nm波長處有最大光吸收的有色三甲基復(fù)合物。二、試劑1.10%的三氯乙酸（TCA）溶液：稱取10g三氯乙酸用少量蒸餾水溶解后定容于100ml容量瓶中；20.6%（w/v）硫代巴比妥酸（TBA）溶液：稱取0.6g硫代巴比妥酸加少量1mol/LNAOH（0.6g-15ml）溶解或磁力攪拌器微熱，再用10%三氯乙酸溶液溶解后定容于100ml容量瓶中。三、步驟1. 取0.

36、5g樣品（葉片或根系）剪碎放入研缽中，加入10ml磷酸緩沖液 (0.05mM PBS,pH7.8)(或10%TCA作為提取液)研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入離心管中在6000r/min下離心20min；2. 取上清液1ml于離心管中，加入2ml 0.6%TBA（硫代巴比妥酸）混和后在100沸水浴中煮15min，用冷水迅速冷卻后在4000 r/min下離心20min；3. 取上清液在450nm、532nm、600nm下測OD值（用不加上清液加1ml去離子水其余步驟相同取得的溶液調(diào)零）；4. 計(jì)算組織中MDA含量：反應(yīng)混合液MDA濃度CMDA(mol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450

37、反應(yīng)液體積（ml） CMDA × 1000 提取液中MDA濃度（mol·ml1）= 測定時(shí)提取液用量（ml） 提取液中MDA濃度（mol·ml1）×提取液總量（ml） MDA含量（mol·g1 Fw）= 植物組織鮮重（g）四、注意事項(xiàng)煮沸后要再進(jìn)行一次離心五、參考文獻(xiàn)中國科學(xué)院上海植物生理研究所，上海市植物生理學(xué)會(huì). 現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南M. 北京：科學(xué)出版社， 1999. 127十蒽酮法測定可溶性糖含量一、原理在作物的碳素營養(yǎng)中，作為營養(yǎng)物質(zhì)主要是指可溶性糖和淀粉。它們在營養(yǎng)中的作用主要有:合成纖維素組成細(xì)胞壁；轉(zhuǎn)化并組成其他有機(jī)物如核苷酸

38、、核酸等；分解產(chǎn)物是其他許多有機(jī)物合成的原料，如糖在呼吸過程中形成的有機(jī)酸，可作為NH 3的受體而轉(zhuǎn)化為氨基酸；糖類作為呼吸基質(zhì)，為作物的各種合成過程和各種生命活動(dòng)提供了所需的能量。由于碳水化合物具有這些重要的作用，所以是營養(yǎng)中最基本的物質(zhì)，也是需要量最多的一類。原理：糖在濃硫酸作用下，可經(jīng)脫水反應(yīng)生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應(yīng)生成藍(lán)綠色糠醛衍生物，在一定范圍內(nèi)，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用于糖的定量測定。該法的特點(diǎn)是幾乎可以測定所有的碳水化合物，不但可以測定戊糖與己糖含量，而且可以測所有寡糖類和多糖類，其中包括淀粉、纖維素等(因?yàn)榉磻?yīng)液中的濃硫酸可以把多糖水解

39、成單糖而發(fā)生反應(yīng))，所以用蒽酮法測出的碳水化合物含量，實(shí)際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。在沒有必要細(xì)致劃分各種碳水化合物的情況下，用蒽酮法可以一次測出總量，省去許多麻煩，因此，有特殊的應(yīng)用價(jià)值。但在測定水溶性碳水化合物時(shí)，則應(yīng)注意切勿將樣品的未溶解殘?jiān)尤敕磻?yīng)液中，不然會(huì)因?yàn)榧?xì)胞壁中的纖維素、半纖維素等與蒽酮試劑發(fā)生反應(yīng)而增加了測定誤差。此外，不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺，故測定糖的混合物時(shí)，常因不同糖類的比例不同造成誤差，但測定單一糖類時(shí)，則可避免此種誤差。 糖類與蒽酮反應(yīng)生成的有色物質(zhì)在可見光區(qū)的吸收峰為620 nm

40、，故在此波長下進(jìn)行比色。二、試劑1. 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液( 100 g/mL ):準(zhǔn)確稱取 100mg 分析純無水葡萄糖，溶于蒸餾水并定容至100mL，使用時(shí)再稀釋 10 倍( 100 g/mL )。 2 .蒽酮試劑:稱取1.0g 蒽酮，溶于 80% 濃硫酸(將 98% 濃硫酸稀釋，把濃硫酸緩緩加入到蒸餾水中) 1000mL中，冷卻至室溫，貯于具塞棕色瓶內(nèi)，冰箱保存，可使用2-3周。三、步驟1、 樣品中可溶性糖的提取稱取剪碎混勻的新鮮樣品0.5-1.0g (或干樣粉末 5-100mg )，放入大試管中，加入15mL蒸餾水，在沸水浴中煮沸20min ，取出冷卻，過濾入100mL容量瓶中，用蒸餾水沖洗

41、殘?jiān)鼣?shù)次，定容至刻度。2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取6支大試管，從1-6分別編號(hào)，按下表加入各試劑。 蒽酮法測可溶性糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的試劑量 。管號(hào) 1 2 3 4 5 6100 g/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液:ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蒸餾水：ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0蒽酮試劑：ml 5 5 5 5 5 5葡萄糖含量：g 0 20 40 60 80 100A620nm將各管快速搖動(dòng)混勻后，在沸水浴中煮 10min ，取出冷卻，在620nm波長下，用空白調(diào)零測定光密度，以光密度為縱坐標(biāo)，含葡萄糖量( g )為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 3. 樣品測定 取待測樣品提取液 1.0

42、mL 加蒽酮試劑5mL，同以上操作顯色測定光密度。重復(fù)3次。 4. 結(jié)果計(jì)算 溶性糖含量(%)=從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得糖的量(g)×提取液體積(ml)×稀釋倍數(shù)/測定用樣品液的體積(ml)×樣品重量(g)×106×100 四、文獻(xiàn)1. Fairbairn N J. A modified anthrone reagent J.Chem.and Ind., 1953(4):862. 中國科學(xué)院上海植物生理研究所，上海市植物生理學(xué)會(huì). 現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南M. 北京：科學(xué)出版社， 1999. 127十一磺基水楊酸法測定游離脯氨酸含量一、目的在逆境條件下（旱

43、、熱、冷、凍），植物體內(nèi)脯氨酸的含量顯著增加，植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強(qiáng)的品種積累的脯氨酸多。因此測定脯氨酸含量可以作為抗旱育種的生理指標(biāo)。另外，由于脯氨酸親水性極強(qiáng)，能穩(wěn)定原生質(zhì)膠體及組織內(nèi)的代謝過程，因而能降低冰點(diǎn)，有防止細(xì)胞脫水的作用。在低溫條件下，植物組織中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作為抗寒育種的生理指標(biāo)。二、原理磺基水楊酸對(duì)脯氨酸有特定反應(yīng)，當(dāng)用磺基水楊酸提取植物樣品時(shí)，脯氨酸便游離于磺基水楊酸溶液中。然后用酸性茚三酮加熱處理后，茚三酮與脯氨酸反應(yīng)，生成穩(wěn)定的紅色化合物，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，色素的深淺即表示脯氨酸含量的

44、高低。在520nm波長下測定吸光度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出脯氨酸的含量。三、試劑1.2.5酸性茚三酮溶液配制：將1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol·L1磷酸（37.7ml磷酸加入水定容至100ml）（濃度為85%的磷酸大約是14mol/l,如果要配置6M的磷酸大約稀釋到原來體積的2.3倍即可）中，攪拌加熱（70）溶解，貯于冰箱中，此液在4下2-3d有效。2.3磺基水楊酸配配制：3g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100ml。3.10g·ml-1脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)母液配制：精確稱取20mg脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸餾水定容至

45、刻度（為100g·ml1脯氨酸母液），再吸取該溶液10ml, 加蒸餾水稀釋定容至100ml, 即為10g·ml-1脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。4.冰醋酸。5.甲苯。四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1.1取6支試管，編號(hào)，按下表配制每管含量為012g的脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。加入表中試劑后，置于沸水浴中加熱30min。取出冷卻，各試管再加入4ml甲苯，振蕩30秒鐘，靜置片刻，使色素全部轉(zhuǎn)至甲苯溶液。試 劑管 號(hào)01234510g·ml-1脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液（ml）蒸餾水（ml）冰醋酸（ml）2.5酸性茚三酮（ml）0222or3or40.21.8220.41.6220.61.4220.81

46、.2221.01.022每管脯氨酸含量（g）02468101.2用注射器輕輕吸取各管上層脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液為空白對(duì)照，在520mm波長處測定吸光度（A）值。1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以15號(hào)管脯氨酸含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2. 樣品的測定2.1脯氨酸的提取稱取不同處理的植物葉片各0.5g，分別置大試管中，然后向各管分別加入5ml 3的磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取過程中要經(jīng)常搖動(dòng)），冷卻后過濾于干凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。2.2測定吸取2ml提取液于帶玻塞試管中，加入2ml冰醋酸及2ml或3ml或4ml 2.5酸性茚三酮試劑，在沸水浴

47、中加熱30min，溶液即呈紅色。冷卻后加入4ml甲苯，搖蕩30秒鐘，靜置片刻，待分層（取上層液至10ml離心管中，在3000r/min離心5min），用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液為空白對(duì)照，在520mm波長處測定吸光度（A）值。五、計(jì)算結(jié)果從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品測定液中脯氨酸的含量，按下公式計(jì)算樣品中脯氨酸含量： X × 提取液總量（ml）脯氨酸含量（g·g1Fw） 樣品鮮重（g）× 測定時(shí)提取液用量（ml）公式中：X 從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的脯氨酸含量（g）六、文獻(xiàn)王晶英，敖紅，張杰，曲桂琴.植物生理生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)與原理M .哈爾濱：東北林業(yè)

48、大學(xué)出版社，2003.7十二抗壞血酸（ASA）一、原理維生素C（抗壞血酸）具有較強(qiáng)的還原力，可以把鐵離子（Fe3+）還原成亞鐵離子（Fe2+），亞鐵離子與紅菲啰啉（4,7-二苯基-1,10-菲啰啉，BP）反應(yīng)形成紅色螯合物。此化合物在波長534nm（有的指導(dǎo)525nm）處具有強(qiáng)的吸收峰，且吸光度與反應(yīng)液中抗壞血酸含量呈正相關(guān)。因此，可用比色法來測定抗壞血酸含量。二、試劑1100g/ml標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液：稱取1mg抗壞血酸（應(yīng)為潔白色，如變?yōu)辄S色則不能用），用5%偏磷酸溶液溶解，定容至10ml，即1ml溶液含100g抗壞血酸。現(xiàn)用現(xiàn)配，保存于棕色瓶中，低溫冷藏。2. 無水乙醇3. 5% TCA（

49、50g/L TCA）：稱取5g三氯乙酸，用蒸餾水定容于100ml容量瓶中。40.4%磷酸-乙醇溶液：量取0.47ml 85%磷酸溶液加入到無水乙醇中，并用無水乙醇稀釋至100ml。50.5%BP-乙醇：稱取0.5g紅菲羅啉（BP，純度>97%），用無水乙醇定容于100ml容量瓶中。60.3g/L 0.03%FeCl3-乙醇溶液：稱取0.03g FeCl3加入到100ml無水乙醇中，搖勻。7. 5% 偏磷酸：稱取5g偏磷酸（HPO3），定容于100ml蒸餾水（需加熱溶解，溫度在50-60）偏磷酸有劇毒。（或者偏磷酸難溶解，先得用研缽提前研碎，后用磁力攪拌器溶解一到兩天后再定容）三、步驟1.

50、 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線配制濃度為2mg/L（0.02ml標(biāo)準(zhǔn)液+0.98ml 5%偏磷酸），4mg/L（0.04ml標(biāo)準(zhǔn)液+0.96ml 5%偏磷酸），6mg/L（0.06ml標(biāo)準(zhǔn)液+0.94ml 5%偏磷酸），8mg/L（0.08ml標(biāo)準(zhǔn)液+0.92ml 5%偏磷酸），10mg/L（0.10ml標(biāo)準(zhǔn)液+0.90ml 5%偏磷酸），12mg/L（0.12ml標(biāo)準(zhǔn)液+0.88ml 5%偏磷酸），14mg/L（0.14ml標(biāo)準(zhǔn)液+0.86ml 5%偏磷酸）的AsA系列標(biāo)準(zhǔn)液。取各濃度標(biāo)準(zhǔn)液1.0ml于試管中，加入1.0ml 5%TCA、1.0ml乙醇，搖勻。再依次加入0.5ml 0.4%H3PO4乙醇、1

51、.0ml 0.5%BP乙醇、0.5ml 0.03%FeCl3乙醇，總體積5.0ml。將溶液置于30下反應(yīng)90min，然后測定OD525。以AsA濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D525為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出線性方程。2. 提取取植物葉片1.0g，加5ml的5%偏磷酸溶液，在4下研磨，20000r/min離心15min，上清液供測定，5保存。（偏磷酸可顯著沉淀蛋白質(zhì)和保護(hù)ASA）3. 測定AsA測定取1.0ml樣品提取液于試管中，按上述相同的方法進(jìn)行測定，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算AsA含量。4. 計(jì)算根據(jù)吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出響應(yīng)的混合液中抗壞血酸質(zhì)量，按下式計(jì)算植物組織中抗壞血酸含量。植物組織中抗壞血酸含量以100g樣品（鮮重）中含有的抗壞血酸的質(zhì)量表示，即mg/100g。  V×m抗壞血酸含量= ×100 (mg/100g) Vs×M×1000式中，m為由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的抗壞血酸的質(zhì)量（g）；Vs為