細(xì)胞培養(yǎng)的過程及注意事項(xiàng)

1、36細(xì)胞培養(yǎng)的過程及注意事項(xiàng)細(xì)胞的培養(yǎng)過程及注意事項(xiàng)；根據(jù)培養(yǎng)過程中是否需要分割培養(yǎng)物進(jìn)行再培養(yǎng)而將細(xì)；一、原代培養(yǎng)；（一）過程；原代培養(yǎng)的基本過程包括取材、培養(yǎng)材料的制備、接種；1、組織塊培養(yǎng)法；(1)基本操作過程；1）、用培養(yǎng)液濕潤(rùn)所取組織材料，并用鋒利的眼科剪；2）、用濕潤(rùn)的吸管吸取切碎的組織塊，清清吹到培養(yǎng)；3）、將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使瓶底朝上，在種植了組織塊一；4）、將種植了組織塊細(xì)胞的培養(yǎng)過程及注意事項(xiàng)根據(jù)培養(yǎng)過程中是否需要分割培養(yǎng)物進(jìn)行再培養(yǎng)而將細(xì)胞培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。一、原代培養(yǎng)（一）過程原代培養(yǎng)的基本過程包括取材、培養(yǎng)材料的制備、接種及培養(yǎng)等步驟。原代培養(yǎng)的方法很多，基本和

2、最常用的是組織塊培養(yǎng)法和分離細(xì)胞法。1、組織塊培養(yǎng)法(1)基本操作過程1）、用培養(yǎng)液濕潤(rùn)所取組織材料，并用鋒利的眼科剪將附在其上的脂肪和結(jié)締組織去除干凈。再用平衡液（PBS）或Hanks液漂洗；用鋒利的眼科彎剪將組織塊剪成小塊；再用PBS或Hanks液漂洗多次，直至液體不渾濁、無油滴、清亮為止。2）、用濕潤(rùn)的吸管吸取切碎的組織塊，清清吹到培養(yǎng)瓶皿中，并將其按一定間距均勻放在培養(yǎng)瓶底壁上，量不要過多，要將組織塊切面貼在培養(yǎng)瓶底壁上；3）、將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使瓶底朝上，在種植了組織塊一側(cè)的對(duì)側(cè)面加足培養(yǎng)液，勿使組織塊與培養(yǎng)液接觸，塞緊瓶塞；4）、將種植了組織塊的一側(cè)朝上，靜置于37培養(yǎng)箱中；待組織塊貼

3、壁1h到3h后翻瓶，使貼壁的組織塊浸沒與培養(yǎng)液中，靜置；5）、每隔2到3天更換一次培養(yǎng)液，或者根據(jù)培養(yǎng)瓶種顏色的變化確定換液時(shí)間。2、注意事項(xiàng)1）、組織塊接種后的前3天，從組織塊向外遷徙的細(xì)胞數(shù)很少，組織塊的黏附不牢固，在觀察和移動(dòng)的過程中，注意不要引起液體的振蕩。要避免經(jīng)常翻動(dòng)和振動(dòng)，否則組織塊不易附著于瓶壁上或附著后也會(huì)脫落飄起。2）、加入的培養(yǎng)液不宜過多，避免浸泡的組織塊受輕微的波動(dòng)而脫落下來。3）、用組織塊培養(yǎng)時(shí)，要及時(shí)觀察，當(dāng)細(xì)胞向外遷徙出來后要注意記錄并去除漂浮的組織塊和殘留的細(xì)胞，因?yàn)橐哑〉慕M織塊和那些細(xì)胞碎片已經(jīng)死亡，它們產(chǎn)生的有毒物質(zhì)會(huì)影響原代細(xì)胞的生長(zhǎng)，要及時(shí)清除。4）、

4、為促進(jìn)組織塊盡快粘貼在培養(yǎng)瓶皿上，可以在種植前先將膠原薄層涂在培養(yǎng)瓶底壁上。細(xì)胞培養(yǎng)過程中，膠原中的促細(xì)胞貼附因子先吸附于培養(yǎng)瓶底壁上，懸浮的圓形細(xì)胞再與已吸附有促貼物質(zhì)的底壁附著。2、分離細(xì)胞培養(yǎng)法貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)（1）基本操作過程1）、首先用細(xì)胞分散法收獲細(xì)胞，隨時(shí)吸取少量消化液在鏡下觀察，并根據(jù)組織是否分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，采取終止消化措施。用篩網(wǎng)濾掉未消化的組織塊。2）、低速離心細(xì)胞懸液，棄掉上清液，加入含血清的培養(yǎng)液，輕輕吹打制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度。3）、根據(jù)培養(yǎng)的細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)要求，用吸管吸取一定量的細(xì)胞懸液，加到培養(yǎng)瓶中。對(duì)于需要特殊底物的細(xì)胞，要先將底物涂一層

5、于培養(yǎng)瓶皿底壁，然后接種細(xì)胞。4)、將培養(yǎng)瓶放入37恒溫箱中培養(yǎng)。5）、每隔2到3天更換培養(yǎng)液一次或根據(jù)培養(yǎng)液顏色的變化確定換液時(shí)間。（2）注意事項(xiàng)1)原代培養(yǎng)的分離細(xì)胞在初次接觸體外環(huán)境時(shí)，雖然被分散成單個(gè)細(xì)胞，但它們之間的互相影響還是存在的，而且這種影響對(duì)細(xì)胞能否存活是非常重要的。在這些細(xì)胞之間能產(chǎn)生一些促生長(zhǎng)的活性物質(zhì)，使細(xì)胞彼此互相促進(jìn)存活和生長(zhǎng)。如果接種的細(xì)胞密度過低，細(xì)胞之間的促生長(zhǎng)作用很小，雖然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)很充足，也很難使細(xì)胞適應(yīng)從體內(nèi)的組織環(huán)境到被分散后進(jìn)入獨(dú)立生存環(huán)境的變化過程。如果接種的細(xì)胞密度過大，會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，代謝廢物積累較快需要經(jīng)常換液和傳代。2）原代培養(yǎng)時(shí)初始

6、培養(yǎng)在組織分散和分離細(xì)胞時(shí)細(xì)胞可能會(huì)受到嚴(yán)重的損傷。適當(dāng)增大原代培養(yǎng)接種的細(xì)胞密度，給培養(yǎng)的細(xì)胞提供更多的類似于在體內(nèi)時(shí)細(xì)胞之間的相互作用，會(huì)極大提高原代培養(yǎng)的細(xì)胞在體外存活率。待細(xì)胞適應(yīng)體外環(huán)境后進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)再以較低的密度接種和培養(yǎng)。3）由于細(xì)胞之間的相互的內(nèi)在聯(lián)系被打破，分離細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)經(jīng)歷的生存環(huán)境改變很大，在體外存活和生長(zhǎng)的難度相應(yīng)增加。對(duì)于貼壁依賴性細(xì)胞來說，盡快使接種的細(xì)胞貼壁，是決定培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵?？梢栽诮臃N后先將培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3h到5h，由于細(xì)胞懸液中帶有少量培養(yǎng)液，細(xì)胞即可以維持存活，又可以很快接觸到培養(yǎng)瓶底壁，是細(xì)胞迅速黏附于底物，待細(xì)胞貼壁后，再補(bǔ)足培養(yǎng)液

7、繼續(xù)培養(yǎng)。3、分離細(xì)胞培養(yǎng)法懸浮型細(xì)胞培養(yǎng)（1）操作過程1）制備細(xì)胞懸濁液，計(jì)數(shù)并用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度。2）在培養(yǎng)皿中加入足夠的培養(yǎng)液。3）將欲接種的細(xì)胞接種到培養(yǎng)器皿中。4）在培養(yǎng)皿內(nèi)放入一個(gè)有聚四氟乙烯包被的磁棒。將培養(yǎng)皿封口，送入恒溫箱內(nèi)。在磁力攪拌器上邊攪拌邊培養(yǎng)。若接種培養(yǎng)瓶或試管中，封口后可將培養(yǎng)器皿固定在恒溫?fù)u床上，邊搖動(dòng)邊培養(yǎng)，無需放置磁棒。有些細(xì)胞也可以不用磁棒或磁力攪拌器，也不必使用恒溫?fù)u床，接種于預(yù)先用硅脂包被的培養(yǎng)器皿內(nèi)直接在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)即可。5）培養(yǎng)液略呈黃色換液。吸出部分舊培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液即可。（2）注意事項(xiàng)1）進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)必須保持細(xì)胞的懸浮狀態(tài)?？?/p>

8、以通過增加培養(yǎng)液的黏度來幫助細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，如給培養(yǎng)液中加入低濃度的透明質(zhì)酸復(fù)合物。在有攪拌裝置的培養(yǎng)器皿內(nèi)加入培養(yǎng)液是，以5ml為最低限度，否則攪拌時(shí)會(huì)產(chǎn)生氣泡對(duì)細(xì)胞造成傷害。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過快，否則即可使培養(yǎng)液溢出又容易造成污染。如果培養(yǎng)液的量在5ml以下，可以采用旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。給懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞換液時(shí)要注意不要吸出細(xì)胞。2）能夠進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，其生命力一般都比較旺盛，體外分裂增殖的速度較快，營(yíng)養(yǎng)成分消耗大，換液時(shí)間隔一般較短。（二）原代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)1、在原代培養(yǎng)的1天到2天內(nèi)，要特別注意觀察是否有細(xì)菌、真菌的污染，一旦發(fā)現(xiàn)，要及時(shí)清除，防止造成其它細(xì)胞的交叉感染；2、隨

9、著培養(yǎng)的進(jìn)程，培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被逐漸的消耗，營(yíng)養(yǎng)成分越來越少，細(xì)胞代謝產(chǎn)物越來越多，有細(xì)胞呼吸過程中釋放出來的CO2及其它產(chǎn)物如乳酸、丙酮酸等也逐漸增加。隨著酸性物質(zhì)的增加，培養(yǎng)液中的pH值越來越低，培養(yǎng)液的顏色也越來越黃。因此，在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，要注意培養(yǎng)液顏色的變化，并根據(jù)培養(yǎng)液的顏色來決定換液時(shí)間。正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色；當(dāng)培養(yǎng)液呈橙黃色時(shí)，細(xì)胞一般生長(zhǎng)情況良好；呈淡黃色時(shí)，可能培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)不足，死亡細(xì)胞較多；呈紫紅色時(shí)，可能是細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不好或已經(jīng)死亡。所以，應(yīng)在培養(yǎng)液略黃時(shí)吸出部分舊培養(yǎng)液，然后補(bǔ)加同等數(shù)量的新鮮培養(yǎng)液。換液過程中，不要吸出細(xì)胞，不要使培養(yǎng)液溢出培養(yǎng)瓶，

10、避免各種微生物的污染。換液時(shí)，應(yīng)將培養(yǎng)液事先預(yù)溫至37。一般培養(yǎng)一天，組織細(xì)胞即可在培養(yǎng)瓶皿底壁黏附并貼壁生長(zhǎng)。2天到3天后，細(xì)胞恢復(fù)增殖活動(dòng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，消耗的營(yíng)養(yǎng)物越來越多，需要換液的時(shí)間越來越短，當(dāng)細(xì)胞逐漸長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶壁并形成一單層細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞之間相互發(fā)生接觸和聯(lián)系，逐漸產(chǎn)生接觸抑制作用，培養(yǎng)物生長(zhǎng)速度減慢。當(dāng)培養(yǎng)物最后形成一層完整的細(xì)胞單層時(shí)，生長(zhǎng)幾乎停止。在細(xì)胞高達(dá)80%融合時(shí)就需要進(jìn)行傳代了。二、傳代培養(yǎng)(一)傳代培養(yǎng)的過程1、組織塊培養(yǎng)物的傳代過程基本操作過程：（1） 將原代培養(yǎng)物連同底物蓋玻片一同取出，置于無菌的培養(yǎng)皿上。（2） 用刀將培養(yǎng)物分割，刮去多

11、余的部分，剩余繼續(xù)培養(yǎng)的部分。一般是分割刮去組織塊外圍的部分組織，留下中央的部分組織繼續(xù)培養(yǎng)?；虿糠址指畈⑻羧ソM織塊，留下遷移出來的細(xì)胞于底物蓋玻片上繼續(xù)培養(yǎng)。也可以將組織塊挑出，再種植于新的底物蓋玻片上繼續(xù)培養(yǎng)。（3） 給剩余的培養(yǎng)物加上培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。2、分離細(xì)胞培養(yǎng)物貼壁型細(xì)胞的傳代過程：有兩項(xiàng)核心工作：一是分割培養(yǎng)物，二是再接種?；静僮鬟^程：（1） 取出培養(yǎng)瓶，打開瓶蓋，用吸管吸出舊的培養(yǎng)液。（2） 用無Ca、Mg的平衡鹽溶液輕輕漂洗培養(yǎng)物1次到2次，洗去殘余血清后棄去平衡鹽溶液。（3） 在培養(yǎng)皿內(nèi)加入胰蛋白酶溶液，室溫下消化5min到15min顯微鏡下觀察細(xì)胞突起縮回

12、近似圓形、細(xì)胞之間的間隙增大時(shí)停止消化。（4） 吸管吸去消化液后立即加入含血清培養(yǎng)液或蛋白酶抑制劑，抑制胰蛋白酶的活性，使消化終止。（5） 用彎頭吸管吸取培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶皿底壁，使已經(jīng)消化的細(xì)胞脫離瓶皿底壁。（6） 低速離心，棄去上清液。（7） 用新鮮培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀重新懸浮，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度。 2+2+（8） 根據(jù)傳代目的將細(xì)胞懸浮液接種到一個(gè)或多個(gè)新的培養(yǎng)器皿中。3、分離細(xì)胞培養(yǎng)物懸浮型細(xì)胞的傳代過程基本操作過程：（1） 將培養(yǎng)物移入離心管低速離心。根據(jù)傳代目的將細(xì)胞懸液接種在一個(gè)或多個(gè)新的培養(yǎng)皿中。（2） 用吸管吸去上清液，加入新鮮培養(yǎng)液使細(xì)胞沉淀重新懸?。?） 根據(jù)傳代目的

13、將細(xì)胞懸液接種在一個(gè)或多個(gè)新的培養(yǎng)皿中。（4） 加足培養(yǎng)液，加蓋封口，加入恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。（二）傳代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)1、離體培養(yǎng)的細(xì)胞生命力比較脆弱，因此傳代時(shí)細(xì)胞沒有生長(zhǎng)到培養(yǎng)瓶底壁面積的80%以前，不要急于傳代。2、首次傳代，由于原代培養(yǎng)中各種類型的細(xì)胞常混雜生長(zhǎng)，傳代時(shí)不同細(xì)胞又不同的消化時(shí)間，因而要根據(jù)需要注意及時(shí)處理。3、對(duì)貼壁細(xì)胞消化后的吹打過程要有序進(jìn)行，要從一邊開始到另一邊結(jié)束，尤其是器皿的四角處，確保瓶皿底壁各處的細(xì)胞都被吹打脫離。吹打時(shí)動(dòng)作不宜過猛，吹出液體的力度要適中，否則會(huì)直接損傷細(xì)胞并產(chǎn)生能傷害細(xì)胞的氣泡。4、對(duì)于貼壁能力較弱，容易脫壁的細(xì)胞，可以不經(jīng)蛋白酶原消化處理和終止消化這兩步，直接對(duì)原代培養(yǎng)物或經(jīng)漂洗后用吸管進(jìn)行吹打使細(xì)胞脫離瓶皿底壁。這種直接吹大的方法對(duì)生命力旺盛的細(xì)胞如某些腫瘤細(xì)胞較為合適。高強(qiáng)度機(jī)械吹打易對(duì)細(xì)胞造成傷害較大，細(xì)胞也常有較大數(shù)量的丟失，因而絕大部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞需消化后才能吹打，一般不單獨(dú)采用高強(qiáng)度機(jī)械吹打。5、首次傳代時(shí)適當(dāng)增大接種的細(xì)胞密度，使培養(yǎng)的細(xì)胞間盡快發(fā)生相互作用，有利于傳代細(xì)胞的存活。6、傳代數(shù)是指對(duì)培養(yǎng)物傳代的次數(shù)，它不等于細(xì)胞分裂的