[建筑]蛋白質(zhì)放射性碘化標(biāo)記實驗

1、.蛋白質(zhì)放射性碘化標(biāo)記實驗 【目的】1. 掌握最常用的氯胺-T法碘化蛋白的要領(lǐng)2. 學(xué)會用柱分離純化碘化蛋白的方法3. 學(xué)會標(biāo)記率、比放射性、放射性化學(xué)純度的計算【原理】NaCl蛋白質(zhì)碘化是利用蛋白質(zhì)分子上的酪氨酸殘基和碘正離子的置換反應(yīng)，Na 125I中的125I在氧化劑（氯胺-T或Iodogen、過氧化物酶等）作用下，被氧化成125I2，將酪氨酸殘基中酚基鄰位氫置換下來，即獲得碘化的蛋白質(zhì)。氯胺-T化學(xué)名稱為N-氯代對甲苯碘酰胺鈉鹽，分子式為CH3- -SO2N它在水中產(chǎn)生次氯酸，是一溫和的氧化劑。161616······

2、3;···········222A1 B1 C1121 11121 11121 1116121 11 2 2 2圖3. 放射紙層析圖（單位：cm）【試劑與器材】 1、試劑：1% BSA（pH 7.5 0.05 MPD配制）0.4 ml10%三氯乙酸（TCA）10 ml74 KBq/50 l Na 125I 50 l50 g/50 l BSA(pH 7.5，0.5 MPB配制)50 l氯胺T、偏重亞硫酸鈉各10 mg臨用前1 ml pH 7.5, 0.5 MPB溶解10% KI 250

3、l0.5 MPB pH7.5 50 l0.05 MPB pH 7.5 100 ml葡聚糖凝膠 Sephadex G-50 5010 g1% NaI 20 ml2、器材：1 ml玻璃移液管 2支尖頭滴管 2支一次性塑料試管 80支10 l微量注射器 2支200 l 微量加樣器 2支200 l微量加樣器頭 10個青霉素小瓶（帶塞） 1個（內(nèi)裝1小磁棒）分離柱（1×20 cm） 1個電磁攪拌器 1臺18×6 cm濾紙（Whatman I或新華1號）1條用鉛筆如圖1所示做好標(biāo)記，A、B、C三處用前各滴5 l 1% NaI，冷風(fēng)稍微吹干。層析缸 1個 吹風(fēng)機 1個 剪子 1

4、把 鑷子 1把 計數(shù)儀 1臺 圖4 . Sephadex 柱層析圖【操作步驟】1.Sephadex G-50柱的制備：稱Sephadex G-50 510 g, 50 ml蒸餾水泡過夜或沸水浴中煮40，傾去上清，沉淀加入pH 7.5, 0.05 M PB 50 ml混勻使成懸液，裝入清潔的層析柱，如圖2所示，使Sephadex G-50均勻沉積至20 cm，多余的吸出，勿使柱干掉。加0.4 ml 1% BSA飽和柱，以減少Sephadex對125I-蛋白質(zhì)的物理吸附，提高過柱后125I-蛋白質(zhì)的利用率。在1%BSA通過柱的同時，用1% TCA檢查BSA流出柱的情況，以供收集125I-蛋白峰作參

5、考。1、 取裝有磁棒的青霉素小瓶1個，在電磁攪拌機上依次加入以下試劑：50 ug/50 ul BSA 50 ul74 KBq/50 l Na 125I 50 l10 mg/ml氯胺-T 50l電磁攪拌下反應(yīng)210 mg/ml偏重亞硫酸鈉100 ul終止反應(yīng)10% KI 250 l用微量注射器從500 l反應(yīng)混合物中準(zhǔn)確吸出5 l點于濾紙A處，冷風(fēng)稍吹干。另取5l加入一小試管中，測量投入125I的總量。3剩余反應(yīng)混合液用微量加樣器移至預(yù)先用1% BSA飽和的Sephadex G-50柱，再用250l 10%溶液洗反應(yīng)瓶，追加上柱，待全部反應(yīng)液完全進柱后，開始用pH7.5，0.05 M PB洗脫，流速約每分鐘10滴，每管收集10滴（約0.5 ml），逐管收集。為防止125I-蛋白在收集管上吸附，各管可預(yù)先用BSA或與標(biāo)記蛋白無關(guān)的動物血清飽和，如凍干馬血清。4放射性測量：依次測定各收集管的放射性計數(shù)，以計數(shù)率為縱坐標(biāo)，管數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，可得兩個放射性峰，第一個峰為125I-BSA，第二個峰為125I。將第一峰各管集中，用微量注射器準(zhǔn)確取出5l點于濾紙B處，冷風(fēng)稍吹干余者存冰箱待用。另取約5l Na 125I滴于濾紙C處，冷風(fēng)吹干。5展層：以10% TCA為展開劑，液面稍低于樣品位置