《細(xì)胞免疫熒光》word版

1、.簡單實(shí)驗(yàn)步驟如下:1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小時(shí).2.-20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘3.PBS洗凈:3min34.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS5.PBS洗凈:25min6.羊血清封閉：度，分鐘.一抗，度過夜，一般要大于小時(shí)或者度小時(shí).度PBS洗凈，min次.二抗度小于一小時(shí).度PBS洗凈，min涼干封片（封閉液.）活細(xì)胞免疫熒光技術(shù)流式細(xì)胞儀標(biāo)本的制備（一）制備活性高的細(xì)胞懸液(培養(yǎng)細(xì)胞系、外周血單個(gè)核細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞等均可用于本法)用10FCSRPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度為5×1

2、0×10ml取40l細(xì)胞懸液加入預(yù)先有特異性McAb(550l)的小玻璃管或塑料離心管，再加50l 120(用DPBS稀釋)滅活正常兔血清4 30min用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右1000rpm×5min棄上清，加入50l工作濃度的羊抗鼠(或兔抗鼠)熒光標(biāo)記物，充分振搖4 30min用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min加適量固定液(如為FCM制備標(biāo)本，一般加入1ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，視細(xì)胞濃度加入100500l固定液)FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察(標(biāo)本在試管中可保存57天)（二）試劑和器材1.各種特異性單

3、克隆抗體。2.熒光標(biāo)記的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗體，滅活正常兔血清。3.10 FCS RPMI1640, DPBS、洗滌液、固定液(見附錄)。4.玻璃管、塑料管、離心機(jī)、熒光顯微鏡等。（三）注意事項(xiàng)1.整個(gè)操作在4下進(jìn)行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN，上述實(shí)驗(yàn)條件是防止一抗結(jié)合細(xì)胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。2.洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細(xì)胞膜上一抗相結(jié)合，出現(xiàn)假陰性。3.加適量正常兔血清可封閉某些細(xì)胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。4.細(xì)胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。附:1. DPBS (×10, 貯存液)NaCl 80gKCl 2g 蒸餾

4、水加至1000mlNaHPO 11.5g 臨用時(shí)用蒸餾水110稀釋KHPO 2g2.洗滌液DPBS900mlFCS 50ml (終濃度5)4NaN?50ml (終濃度0.2)3.固定液DPBS1000ml葡萄糖20g (終濃度2)甲醛10mlNaN0.2g (終濃度0.02)我做的大部分細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：1.取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過的細(xì)胞培養(yǎng)皿里，PBS洗三遍。注意：有的時(shí)候作的細(xì)胞爬片可能比較小，因此夾取的時(shí)候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比較方便，避免了來回夾取，另外洗的時(shí)候加PBS不要太沖，不要細(xì)胞沖下來。洗的時(shí)候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，沒有等5分

5、鐘或10分鐘。2. 4冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。3. 0.2Triton X100通透10分鐘，PBS洗三遍。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過夜，也可37度2小時(shí)，感覺前者效果好，PBS洗三遍。6.二抗室溫2小時(shí)（避光），或者37度1半小時(shí)，PBS洗三遍。7.最好用DAPI染核，然后直接照熒光片。8.蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因?yàn)楦视筒幌髽渲菢訒?huì)干，所以不用指甲油封的話會(huì)弄的一塌糊涂。建議：1.還是染完之后沒有封片前直接照一些，因?yàn)橛械臅r(shí)候可能封片會(huì)出現(xiàn)問題，再想照反而沒有了，另外不要拖太長時(shí)間，熒光會(huì)崔滅的。2

6、.熒光的片子一定要避光保存，保存的好的話，過一段時(shí)間仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定離心，不然有的時(shí)候有那種沉淀，在片子上就是一個(gè)很大的非特異性熒光光點(diǎn)，非常難看。直接免疫熒光法測抗原基本原理將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。試劑與儀器l          磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，p

7、H7.4l          熒光標(biāo)記的抗體溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋l          緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制l          搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）l   &#

8、160;      有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布?jí)|）l          熒光顯微鏡l          玻片架l          濾紙l          37溫箱等。實(shí)驗(yàn)步驟1.

9、 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標(biāo)本片上，10min后棄去，使標(biāo)本保持一定濕度。2. 滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液，使其完全覆蓋標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫一定時(shí)間（參考：30min）。3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗后，再按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不時(shí)振蕩。4. 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。5. 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度，一般可用“+”表示：（-）無熒光；（±）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可

10、見；（+）熒光明亮；（+ -+）熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“+”以上，而各種對(duì)照顯示為（±）或（-），即可判定為陽性。注意事項(xiàng)1. 對(duì)熒光標(biāo)記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過1：20，抗體濃度過低，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察。2. 染色的溫度和時(shí)間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化，染色時(shí)間可以從10 min到數(shù)小時(shí)，一般30 min已足夠。染色溫度多采用室溫（25左右），高于37可加強(qiáng)染色效果，但對(duì)不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2的低溫，延長染色時(shí)間。低溫染色過夜較3730 min效果好的多。3. 為了保證熒光染色

11、的正確性，首次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。（1）   標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。（2）   特異性對(duì)照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。（3）   陽性對(duì)照：已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無熒光或弱熒光，陽性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽性染色。4. 一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本最好在當(dāng)天觀察，隨著時(shí)間的延長，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。 

12、;間接免疫熒光法測抗體基本原理染色程序分為兩步，第一步，用未知未標(biāo)記的抗體（待檢標(biāo)本）加到已知抗原標(biāo)本上，在濕盒中37保溫30min，使抗原抗體充分結(jié)合，然后洗滌，除去未結(jié)合的抗體。第二步，加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果第一步發(fā)生了抗原抗體反應(yīng)，標(biāo)記的抗球蛋白抗體就會(huì)和已結(jié)合抗原的抗體進(jìn)一步結(jié)合，從而可鑒定未知抗體。試劑與儀器l          磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4l      

13、60;   緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制。l          熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋 。l          搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）l          有蓋搪

14、瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布?jí)|）l          熒光顯微鏡l          玻片架l          濾紙l          37溫箱等。實(shí)驗(yàn)步驟1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片，10min后棄

15、去，使標(biāo)本片保持一定濕度。2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本，覆蓋已知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37保溫30min。3. 取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時(shí)振蕩 。4. 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。5. 將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37保溫30min。6. 重復(fù)操作3。7. 取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。8. 熒光顯微鏡高倍視野下觀

16、察，結(jié)果判定同直接法。注意事項(xiàng)1. 熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4保存4h，時(shí)間過長 ，會(huì)使熒光減弱。2. 每次試驗(yàn)時(shí) ，需設(shè)置以下三種對(duì)照：（1）   陽性對(duì)照：陽性血清+熒光標(biāo)記物（2）   陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物（3）   熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物3. 已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。4. 所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。1、問：用免疫熒光方法做組織切片和培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的蛋白，兩者操作過程有哪些不

17、同？參考見解：只是固定方法不同。細(xì)胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一樣的。2、問：近期要做免疫熒光雙標(biāo)，不知哪位有免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)的詳細(xì)步驟及其注意事項(xiàng)？參考見解：我正在做冰凍組織切片的免疫熒光雙染。我的經(jīng)驗(yàn)是：（1）選取一抗時(shí)要來源于兩種不同的動(dòng)物，我用的是來源于rabbit和rat的抗體，二抗則是不同熒光信號(hào)標(biāo)記的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（綠）和donkey anti-rat-Tex-Red（紅）。（2）我的做法是兩種一抗同時(shí)孵育，然后兩種二抗同時(shí)孵育?？贵w濃度、孵育時(shí)間要仔細(xì)摸索，我感覺一抗4度孵育過夜比較好，背景比較清晰。（3）我的陽性對(duì)照

18、用的是陽性組織切片，陰性對(duì)照則分別是家兔和大鼠的IgG，熒光標(biāo)記物對(duì)照是PBS+熒光標(biāo)記物。（4）封閉血清與二抗來源動(dòng)物一致，我用的是10%的正常donkey血清。（5）其余步驟同一般免疫熒光單標(biāo)操作。3、問：本人擬做Brdu標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞免疫熒光，二抗為FITC標(biāo)記，想請教各位大俠：（1）抗體分裝和熒光顯微鏡觀察時(shí)是否一定要在暗室中進(jìn)行？（2）封片時(shí)是否用甘油緩沖液即可，還是用甘油和0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氫鹽緩沖液等量混合封片？（3）免疫酶染色中的3%過氧化氫及2N鹽酸是否還需要用？參考見解：（1）你的二抗是用FITC標(biāo)記的，為避免熒光分解，分裝及熒光顯微鏡觀察時(shí)均要避

19、光；（2）封片最好用甘油加0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氫鹽緩沖液，后者能使玻片透明；（3）關(guān)于免疫酶染色，如果是用過氧化物酶做標(biāo)記，就必須用3%H2O2以去除內(nèi)源性過氧化物酶；2N鹽酸需要使用，目的是使DNA變性，讓Brdu抗體能夠充分地與已經(jīng)摻入的Brdu結(jié)合。4、問：做間接法免疫熒光染色，如何設(shè)置對(duì)照？參考見解：最好是同一視野在未用熒光激發(fā)下進(jìn)行對(duì)照，看是否非特異性染色。（1）空白對(duì)照：如果你做的是石蠟切片免疫組化，這個(gè)對(duì)照必須有，目的是看自發(fā)熒光，脫蠟后直接在熒光顯微鏡下觀察。（2）陰性對(duì)照：標(biāo)本直接滴加二抗，呈陰性反應(yīng)。（3）抗原對(duì)照：標(biāo)本加同種動(dòng)物的未免疫血清，以PB

20、S沖洗后，在加抗免疫球蛋白熒光抗體。因未免疫動(dòng)物的血清中無特異性抗體，應(yīng)呈陰性反應(yīng)。5、問：我做乳腺組織的免疫熒光染色，結(jié)果用激光共聚焦顯微鏡看很好：有陽性信號(hào)，陰性對(duì)照組也沒有熒光，但是拿到熒光顯微鏡下看，我的陰性對(duì)照組一片綠，像非特異性染色，到底哪個(gè)結(jié)果才是真實(shí)的呢？參考見解：激光共聚焦顯微鏡的分辨率比普通熒光顯微鏡要高的多，出現(xiàn)上述現(xiàn)象首先要排除熒光顯微鏡的問題，如是不是紫外燈泡壽命到期了或者別的原因，熒光顯微鏡沒有問題，那就以共聚焦顯微鏡的結(jié)果為主。免疫熒光技術(shù)基本原理（圖）免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展

21、最早的一種免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique），又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。Coons等于1941年首次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)（fluorescentantibodytechnique）。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免

22、疫熒光技術(shù)，因?yàn)闊晒馍夭坏芘c抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測或定位抗體，但是在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù)，或稱為免疫熒光技術(shù)。以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）化學(xué)技術(shù)。該技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡便，便于推廣。國外生產(chǎn)的TDM用

23、試劑盒，有相當(dāng)一部分即屬于此類，并且還有專供TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生產(chǎn)。由于一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術(shù)用于定量測定有一定困難。近年來發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用。1原理免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，只要知道其中的一個(gè)因素，就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。直接法：將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間

24、的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。間接法：如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗原抗體抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則說明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此，制備標(biāo)記抗體適用于雞任何抗原的診斷。2技術(shù)分類： 熒光抗體技術(shù)（熒光顯微鏡技術(shù)）抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢

25、測方法。 免疫熒光測定技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測定熒光強(qiáng)度而推算被測物濃度的檢測方法。（1）熒光物質(zhì)1）熒光色素許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：(1)異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長為490495nm，最大發(fā)射光波長520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，

26、在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：人眼對(duì)黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。(2)四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。結(jié)構(gòu)式如下：最大吸收光波長為570nm，最大發(fā)射光波長為595600nm，呈橘紅色熒光。(3)四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結(jié)構(gòu)式如下：最大吸引光波長為550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧Ｆ洚惲蚯杌膳c蛋白質(zhì)結(jié)合

27、，但熒光效率較低。（2）其他熒光物質(zhì)1）酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-D半乳糖苷受-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對(duì)羥基苯乙酸等。2）鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+ ）、鈰（Ce3+ ）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3+應(yīng)用最廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時(shí)間長，最適合用于分辨熒光免疫測定。（3）常見熒光素：1）

28、FITC2）RB2003）TRITC24）鑭系：Eu3+、Tb3+ 5）PE6）其它常見熒光素的特性：1）FITC：黃色結(jié)晶粉末，吸收光：490495nm，發(fā)射光：520530nm，明亮的黃綠色熒光。2）RB200： 橘紅色粉末, 吸收光570nm，發(fā)射光 595600nm，橘紅色熒光。3）TRITC： 紫紅色粉末，吸收550nm，發(fā)射光 620nm，橙紅色熒光。4）鑭系：Eu3+、Tb3+5）PE：吸收光490560nm，發(fā)射光 595nm，紅色熒光。6）其它：酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)。酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)：（4）合適熒光素的選擇1）具有與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)。2）熒光效率高，標(biāo)記后下降不

29、明顯。3）熒光色澤與背景色澤對(duì)比鮮明。4）標(biāo)記后能保持生物學(xué)活性和免疫活性5）標(biāo)記方法簡單、快速。6）安全無毒。免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)中操作要點(diǎn)和注意事項(xiàng)一、免疫熒光技術(shù)中標(biāo)本制作的基本程序近似于酶免疫組化，不同點(diǎn)如下：1、免疫熒光不需要使用雙氧水處理，封閉和一抗孵育與其相同。2、免疫熒光的二抗使用不同熒光標(biāo)記的二抗孵育，孵育時(shí)間根據(jù)抗體的工作濃度確定。3、二抗孵育之后充分洗片后即可貼片、封片和觀察。4、免疫熒光在封片時(shí)常使用專用封片劑或甘油：0.01M PBS （1：1）。條件許可，建議購買抗淬滅的封片液，使標(biāo)本可以保存更久。5、熒光抗體的孵育以及后續(xù)處理需要避光。6、熒光抗體染色假陽性可能會(huì)多，

30、需要分別設(shè)定陽性和陰性對(duì)照。二、注意事項(xiàng)1、熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4保存4h，時(shí)間過長，可能會(huì)使熒光提前衰退。2、每次試驗(yàn)均需設(shè)置以下三種對(duì)照：（1） 陽性對(duì)照：陽性血清+熒光標(biāo)記物；（2） 陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物；（3） 熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物。 三、免疫熒光雙標(biāo)的經(jīng)驗(yàn)之談1、選取一抗時(shí)，要求來源于兩種不同的動(dòng)物，我用的是來源于家兔和大鼠的抗體，二抗則是不同熒光信號(hào)標(biāo)記的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（綠）和donkey anti-rat-Tex-Red（紅）。2、我的做法是兩種一抗同時(shí)孵育，然后兩種二抗同時(shí)孵育。抗體濃度、孵育時(shí)間

31、要自我摸索，我感覺一抗4孵育過夜比較好，背景比較清晰。3、我的陽性對(duì)照采用的是陽性組織切片，陰性對(duì)照則分別是家兔和大鼠的IgG，熒光標(biāo)記物對(duì)照是PBS+熒光標(biāo)記物。4、封閉血清是二抗來源動(dòng)物的正常血清，我用的是10%正常donkey血清。5、其余事項(xiàng)同免疫熒光單標(biāo)操作。 免疫組化中抗體選擇要求1、一抗選擇要點(diǎn)（1）選擇單克隆還是多克隆抗體。由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體，單克隆抗體能目標(biāo)明確地與單一特異抗原決定簇結(jié)合，就象導(dǎo)彈精確地命中目標(biāo)一樣。另一方面，即使是同一個(gè)抗原決定簇，在機(jī)體內(nèi)也可以由好幾種克隆產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應(yīng)中，一般單克

32、隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對(duì)小，檢測抗原靈敏度相對(duì)較低；而多克隆抗體特異性稍弱，抗體的親和力強(qiáng)，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過封閉等有所避免）。（2）種屬來源。一般家兔來源的抗體多是多克?。欢∈髞碓吹目贵w多是單克隆，但也有另外。這條主要要與后面的二抗來源相匹配。（3）實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菣z測什么種屬的抗原，即species reactivity。這一點(diǎn)很重要，一般說明書上都有注明，如小鼠Ms、大鼠Rat、人Hum等等。（4）能否做免疫組化。一般一抗說明書都會(huì)注明做WB、IHC、ICC、IF等，建議最好選擇注明的抗體，因?yàn)橐话愣际墙?jīng)過文章證明。（5）檢測標(biāo)本類型。用于檢測石蠟切片還是冰凍切片，一般能做石蠟切片的抗體，可能都可以用來檢測冰凍切片，但能做冰凍切片的抗體，不一定能檢測石蠟切片中的抗原。（6）生產(chǎn)廠家。我的經(jīng)驗(yàn)是國外著名抗體生產(chǎn)商原裝抗體質(zhì)量一般沒問