Real-timePCR

1、2011級(jí)級(jí)目錄四.熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（掌握）六.參照系統(tǒng)（熟悉）二.實(shí)時(shí)PCR的定義（掌握）三.DNA交聯(lián)熒光染料技術(shù)（掌握）一.實(shí)時(shí)PCR的簡(jiǎn)介與發(fā)展歷程（了解）五.幾個(gè)概念（掌握）七.應(yīng)用、優(yōu)點(diǎn)、局限性（了解）實(shí)時(shí)PCR的簡(jiǎn)介與發(fā)展歷程 1986年末年末 Russ Higuchi來(lái)到來(lái)到PCR的誕生地的誕生地Cetus公司工作公司工作 ，探，探討討“閉管閉管PCR”的可能的可能“溴化乙錠溴化乙錠”的使用，光導(dǎo)纖維的使用。的使用，光導(dǎo)纖維的使用。1991年年Cetus公司的公司的Holland等在等在Proc Natl Acad Sci U S A 上發(fā)表了上發(fā)表了TaqMan prob

2、es技術(shù)。技術(shù)。 1993年美國(guó)年美國(guó)Applied Biosystems, Division of Perkin-Elmer 的的Lee 等在等在Nucleic Acids Research雜志上雜志上發(fā)表了使用雙熒光標(biāo)記的實(shí)時(shí)熒發(fā)表了使用雙熒光標(biāo)記的實(shí)時(shí)熒光光PCR方法。方法。 1996年美國(guó)紐約公共衛(wèi)生研究年美國(guó)紐約公共衛(wèi)生研究所所(Public Health Research Institute) Tyagi和和Kramer在在Nat Biotechnol上發(fā)表了分子信標(biāo)上發(fā)表了分子信標(biāo)(Molecular beacons)方法。方法。實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCR技術(shù)的概念技術(shù)的概念又稱熒光定量又稱

3、熒光定量PCRPCR（FQ-PCRFQ-PCR）技術(shù)，）技術(shù)，指能實(shí)時(shí)檢測(cè)指能實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增周期每個(gè)時(shí)間擴(kuò)增周期每個(gè)時(shí)間點(diǎn)（通常事每個(gè)循環(huán)結(jié)束后）的熒光點(diǎn)（通常事每個(gè)循環(huán)結(jié)束后）的熒光強(qiáng)度，通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系中熒光信號(hào)的強(qiáng)度，通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系中熒光信號(hào)的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR過(guò)程中產(chǎn)物量的過(guò)程中產(chǎn)物量的實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)監(jiān)測(cè)，并根據(jù)參照系統(tǒng)較為精確地計(jì)，并根據(jù)參照系統(tǒng)較為精確地計(jì)算出算出PCR的初始模板量。的初始模板量。熒光定量熒光定量PCR與常規(guī)與常規(guī)PCR的區(qū)別的區(qū)別常規(guī)常規(guī)PCR技術(shù)：技術(shù)： 對(duì)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定性及定量分析性及定量分析熒光定量熒光定量PCR

4、技術(shù)：技術(shù)： 對(duì)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行定量分析產(chǎn)物進(jìn)行定量分析Real Time PCRReal Time PCR的原理的原理激激發(fā)發(fā)光光發(fā)發(fā)射射光光CtCt值值DNA交聯(lián)熒光染料技術(shù)原理：在原理：在PCRPCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)反應(yīng)體系中，加入過(guò)量量SYBR GreenSYBR Green染料染料，SYBR SYBR GreenGreen染料選擇性地?fù)饺胫岭p鏈染料選擇性地?fù)饺胫岭p鏈DNADNA后，產(chǎn)生熒光信號(hào)，未摻入至后，產(chǎn)生熒光信號(hào)，未摻入至雙鏈雙鏈DNADNA中的中的SYBRSYBR染料分子不會(huì)染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)發(fā)射任何熒光信號(hào)熒光信號(hào)的增

5、加與熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加同步，產(chǎn)物的增加同步，即結(jié)合的熒光信號(hào)和即結(jié)合的熒光信號(hào)和DNA含量成正比。含量成正比。SYBR GreenSYBR Green染料染料簡(jiǎn)介：簡(jiǎn)介：SYBR Green I是一種結(jié)合于所有是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。在游離狀態(tài)下，的染料。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)。光大大增強(qiáng)。SYBR Green染料原理視頻講解染料原理視頻講解特點(diǎn)：特點(diǎn)：高靈敏高靈敏：至少可檢出：至少可檢出20pg D

6、NA，高于，高于EB染色法染色法25-100倍。倍。信噪比高信噪比高：樣品熒光信號(hào)強(qiáng)，背景信：樣品熒光信號(hào)強(qiáng)，背景信號(hào)低。號(hào)低。操作簡(jiǎn)單操作簡(jiǎn)單：無(wú)須脫色或沖洗。：無(wú)須脫色或沖洗。適用范圍廣適用范圍廣：可適用于多種電泳分析。：可適用于多種電泳分析。使用方便使用方便：不影響其它修飾酶作用。：不影響其它修飾酶作用。經(jīng)濟(jì)經(jīng)濟(jì)：價(jià)格比銀染便宜。：價(jià)格比銀染便宜。SYBR GreenSYBR Green染料染料DNA交聯(lián)熒光染料技術(shù)的評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：成本較低，操作簡(jiǎn)單，無(wú)需對(duì)引物：成本較低，操作簡(jiǎn)單，無(wú)需對(duì)引物或探針進(jìn)行預(yù)先特殊的熒光標(biāo)記，適用于或探針進(jìn)行預(yù)先特殊的熒光標(biāo)記，適用于任何反應(yīng)體系任何反應(yīng)體系

7、缺點(diǎn)缺點(diǎn)：特異性弱，因?yàn)槿玖弦矔?huì)結(jié)合到非：特異性弱，因?yàn)槿玖弦矔?huì)結(jié)合到非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈分子和引物二聚體特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈分子和引物二聚體中，使反應(yīng)體系中的熒光本底較高。中，使反應(yīng)體系中的熒光本底較高。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）熒光共振能量轉(zhuǎn)移是距離很近的兩個(gè)熒光熒光共振能量轉(zhuǎn)移是距離很近的兩個(gè)熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。當(dāng)供體分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。當(dāng)供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個(gè)分子的距離在收光譜重疊，并且兩個(gè)分子的距離在10nm10nm范圍以內(nèi)時(shí)，就會(huì)發(fā)生一種非放射范圍以內(nèi)時(shí)，就會(huì)發(fā)生一種非放射性的能量

8、轉(zhuǎn)移，即性的能量轉(zhuǎn)移，即FRETFRET現(xiàn)象，使得供體現(xiàn)象，使得供體的熒光強(qiáng)度比它單獨(dú)存在時(shí)要低的多（熒的熒光強(qiáng)度比它單獨(dú)存在時(shí)要低的多（熒光猝滅），而受體發(fā)射的熒光卻大大增強(qiáng)光猝滅），而受體發(fā)射的熒光卻大大增強(qiáng)（敏化熒光）（敏化熒光） 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)）技術(shù)1.水解探針（水解探針（hydrolization probe )技術(shù)技術(shù)2.雜交探針雜交探針 (hybridization probe )技術(shù)技術(shù)3.分子信標(biāo)分子信標(biāo) (moclecular beacon )技術(shù)技術(shù)水解探針（水解探針（hydrolization probe )技術(shù)技術(shù)又稱又稱TaqMa

9、n probe 技術(shù)，反應(yīng)體系中有兩條引物和一條技術(shù)，反應(yīng)體系中有兩條引物和一條熒光素標(biāo)記的探針。熒光素標(biāo)記的探針。TaqMan探針為一寡核苷酸，探針為一寡核苷酸，5 端標(biāo)記一個(gè)端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告基團(tuán)報(bào)告基團(tuán)R（report group）如：）如：6-羧基熒羧基熒光素（光素（FAM）3 端標(biāo)記一個(gè)端標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)淬滅基團(tuán)Q（quencher group）如：）如：6-羧羧基基-四甲基羅丹明（四甲基羅丹明（TAMRA）QR5 Q3TaqMan probe 技術(shù)的原理動(dòng)畫技術(shù)的原理動(dòng)畫R RQ QReporterReporterQuencherQuencherR RQ QIntact probe -

10、 reporter Intact probe - reporter quenched by FRETquenched by FRETF FR RR RQ QDuring PCR, probe hybridizes During PCR, probe hybridizes to target sequenceto target sequenceR RQ QProbe is partially Probe is partially displaced during extensiondisplaced during extensionR RQ QProbe cleaved by 5- 3 nucl

11、ease Probe cleaved by 5- 3 nuclease activity of polymeraseactivity of polymeraseR RQ QFree reporter exhibits Free reporter exhibits unquenched fluorescenceunquenched fluorescence熒光信號(hào)的檢測(cè)在每一個(gè)循環(huán)的延伸過(guò)程中進(jìn)行熒光信號(hào)的檢測(cè)在每一個(gè)循環(huán)的延伸過(guò)程中進(jìn)行雜交探針雜交探針 (hybridization probe )技術(shù)技術(shù)雜交探針雜交探針是由兩條引物和是由兩條引物和兩個(gè)探針兩個(gè)探針組成。組成。探針探針A的的3端

12、標(biāo)以熒光素，作為熒光染料供體，探針端標(biāo)以熒光素，作為熒光染料供體，探針B的的5端標(biāo)以另一種熒光染料，作為熒光染料受體。端標(biāo)以另一種熒光染料，作為熒光染料受體。這兩個(gè)探針與靶序列互補(bǔ)時(shí)的位置應(yīng)頭尾排列，并且這兩個(gè)探針與靶序列互補(bǔ)時(shí)的位置應(yīng)頭尾排列，并且兩者相距僅間隔兩者相距僅間隔15個(gè)堿基。個(gè)堿基。15個(gè)堿基個(gè)堿基供體熒供體熒光基團(tuán)光基團(tuán)受體熒受體熒光基團(tuán)光基團(tuán)靶靶DNA靶靶DNA雜交探針雜交探針 (hybridization probe )技術(shù)原理技術(shù)原理原理：原理：擴(kuò)增過(guò)程中，探針擴(kuò)增過(guò)程中，探針與模板雜交時(shí)兩種染料互與模板雜交時(shí)兩種染料互相接近，兩探針能夠進(jìn)行相接近，兩探針能夠進(jìn)行熒光共振

13、能量的轉(zhuǎn)移；轉(zhuǎn)熒光共振能量的轉(zhuǎn)移；轉(zhuǎn)移過(guò)程中，外來(lái)光源首先移過(guò)程中，外來(lái)光源首先刺激供體熒光染料，供體刺激供體熒光染料，供體便發(fā)光刺激附近的受體熒便發(fā)光刺激附近的受體熒光染料，使后者再發(fā)射出光染料，使后者再發(fā)射出具另一種波長(zhǎng)的信號(hào)而被具另一種波長(zhǎng)的信號(hào)而被檢測(cè)系統(tǒng)接收。由于受體檢測(cè)系統(tǒng)接收。由于受體熒光染料只有在兩個(gè)探針熒光染料只有在兩個(gè)探針都與模板雜交時(shí)才會(huì)被激都與模板雜交時(shí)才會(huì)被激發(fā)而發(fā)射熒光信號(hào)，所以發(fā)而發(fā)射熒光信號(hào)，所以對(duì)信號(hào)的檢測(cè)室在退火后對(duì)信號(hào)的檢測(cè)室在退火后進(jìn)行。進(jìn)行。分子信標(biāo)分子信標(biāo) (moclecular beacon )技術(shù)技術(shù)該技術(shù)事一種基于熒光能量轉(zhuǎn)移基礎(chǔ)和堿基互補(bǔ)原則

14、建立的技該技術(shù)事一種基于熒光能量轉(zhuǎn)移基礎(chǔ)和堿基互補(bǔ)原則建立的技術(shù)。分子信標(biāo)實(shí)際是一段熒光素標(biāo)記的寡核苷酸，結(jié)構(gòu)是有環(huán)術(shù)。分子信標(biāo)實(shí)際是一段熒光素標(biāo)記的寡核苷酸，結(jié)構(gòu)是有環(huán)狀區(qū)和柄區(qū)組成，狀區(qū)和柄區(qū)組成，5 端標(biāo)記報(bào)告基團(tuán)端標(biāo)記報(bào)告基團(tuán)R，3 端標(biāo)記淬滅基端標(biāo)記淬滅基團(tuán)團(tuán)Q在自由狀態(tài)下，分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)呈發(fā)夾狀在自由狀態(tài)下，分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)呈發(fā)夾狀探針雜交到探針雜交到DNADNA模板模板光光發(fā)出熒光發(fā)出熒光報(bào)告基團(tuán)報(bào)告基團(tuán)DNA 模板模板環(huán)狀區(qū)環(huán)狀區(qū)光光 淬滅淬滅分子信標(biāo)技術(shù)的原理分子信標(biāo)技術(shù)的原理水解探針技術(shù)水解探針技術(shù)是目前病原體核酸檢測(cè)商品化是目前病原體核酸檢測(cè)商品化試劑中比較常用的技術(shù)如用于

15、乙肝病毒、丙試劑中比較常用的技術(shù)如用于乙肝病毒、丙肝病毒等的檢測(cè)肝病毒等的檢測(cè)分子信標(biāo)分子信標(biāo)廣泛用于基因突變的分析、活細(xì)胞廣泛用于基因突變的分析、活細(xì)胞內(nèi)核酸的動(dòng)態(tài)檢測(cè)、內(nèi)核酸的動(dòng)態(tài)檢測(cè)、DNA/RNA雜交的動(dòng)力雜交的動(dòng)力學(xué)研究和學(xué)研究和DNA/蛋白質(zhì)相互作用的研究等蛋白質(zhì)相互作用的研究等如何對(duì)起始模板定量分析？如何對(duì)起始模板定量分析？通過(guò)通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量分析值和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量分析那什么是那什么是Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線？值和標(biāo)準(zhǔn)曲線？基本概念基本概念概念概念1：標(biāo)準(zhǔn)曲線：標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)經(jīng)系列稀釋的并且已知含量的根據(jù)經(jīng)系列稀釋的并且已知含量的標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)擴(kuò)增后得出的一

16、條曲線。它的橫坐標(biāo)是標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)擴(kuò)增后得出的一條曲線。它的橫坐標(biāo)是標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)為準(zhǔn)品的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)為Ct值。值。10105 5 10104 4 10 103 3 10 102 2 10 101 1 10 100 0概念概念2：基線基線：是指在：是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里，熒擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里，熒光信號(hào)變化不大，接近一條直線光信號(hào)變化不大，接近一條直線熒光閾值熒光閾值： PCR反應(yīng)的前反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值的缺省設(shè)置是熒光本底信號(hào)，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)差的的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)

17、差的10倍，即：倍，即：threshold = 10 SDcycle 3-15 閾值循環(huán)數(shù)（閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）值）：處于擴(kuò)增曲線和熒光本底基：處于擴(kuò)增曲線和熒光本底基線的交叉點(diǎn)線的交叉點(diǎn)Threshold lineThreshold line C Ct t value value 外參照系統(tǒng)外參照系統(tǒng)外參照系統(tǒng)是用外參照系統(tǒng)是用標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過(guò)系列稀釋制備的經(jīng)過(guò)系列稀釋制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品1）靶基因的擴(kuò)增片段轉(zhuǎn)入質(zhì)粒）靶基因的擴(kuò)增片段轉(zhuǎn)入質(zhì)粒2）靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后）靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后3）逆轉(zhuǎn)錄）逆轉(zhuǎn)錄cDNA（組織或細(xì)胞作為檢測(cè)樣本時(shí)）（組織或細(xì)胞作為檢測(cè)樣本時(shí)）

18、4）病毒顆粒（病毒定量檢測(cè)時(shí)）病毒顆粒（病毒定量檢測(cè)時(shí)）基因組基因組DNADNAPCPCR R目的基因克目的基因克隆隆目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因質(zhì)質(zhì)粒粒外參照系統(tǒng)的缺點(diǎn)外參照系統(tǒng)的缺點(diǎn) 標(biāo)準(zhǔn)品生物線性范圍往往難以滿足所有被標(biāo)準(zhǔn)品生物線性范圍往往難以滿足所有被檢樣本的檢測(cè)需要檢樣本的檢測(cè)需要 無(wú)法控制標(biāo)準(zhǔn)品與被檢樣品之間擴(kuò)增效率無(wú)法控制標(biāo)準(zhǔn)品與被檢樣品之間擴(kuò)增效率的差異的差異 無(wú)法糾正被檢樣本的抽提速率和抽提質(zhì)量無(wú)法糾正被檢樣本的抽提速率和抽提質(zhì)量的差異（可以通過(guò)設(shè)置內(nèi)參照系統(tǒng)進(jìn)行糾的差異（可以通過(guò)設(shè)置內(nèi)參照系統(tǒng)進(jìn)行糾正）正）內(nèi)參照系統(tǒng)內(nèi)參照系統(tǒng)內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)際上就是克隆一

19、段靶基因并人為引入地內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)際上就是克隆一段靶基因并人為引入地突變序列突變序列內(nèi)參照設(shè)置是把一個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品加入被檢樣品中一起內(nèi)參照設(shè)置是把一個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品加入被檢樣品中一起抽提、一起擴(kuò)增抽提、一起擴(kuò)增優(yōu)點(diǎn)：內(nèi)參照系統(tǒng)避免了由于不同抽提效率導(dǎo)致的樣本優(yōu)點(diǎn)：內(nèi)參照系統(tǒng)避免了由于不同抽提效率導(dǎo)致的樣本間的差異，使結(jié)果的重復(fù)性更好定量更為準(zhǔn)確間的差異，使結(jié)果的重復(fù)性更好定量更為準(zhǔn)確缺點(diǎn)：該系統(tǒng)仍不能監(jiān)控內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)品和靶基因是否一缺點(diǎn)：該系統(tǒng)仍不能監(jiān)控內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)品和靶基因是否一致的擴(kuò)增效率，因此還需要通過(guò)計(jì)算予以校正致的擴(kuò)增效率，因此還需要通過(guò)計(jì)算予以校正Real Time PCR的用途的用途病毒及病原菌定量分析病毒及病原菌定量分析導(dǎo)入基因拷貝數(shù)解析導(dǎo)入基因拷貝數(shù)解析GMO