免疫學(xué)檢測技術(shù)在食品安全中的應(yīng)用匯編

1、免疫學(xué)檢測技術(shù)在食品平安中的應(yīng)用楊明(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730070)食品平安問題在21世紀(jì)的今天已經(jīng)成為全世界關(guān)注的重大問題，對國家的經(jīng)濟(jì)開展和消費(fèi)者的身體健康產(chǎn)生了重大影響。隨著我國市場經(jīng)濟(jì)的的不斷完善和開展，食品行業(yè)對外貿(mào)易與日劇增， 食品的質(zhì)量與平安問題已成為影響農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)產(chǎn)品競爭力的關(guān)鍵因素。同時， 由于我國人民生活已由溫飽型食物結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)向營業(yè)健康型食物結(jié)構(gòu)，全民食品營業(yè)衛(wèi)生知識得到普及。人民的飲食消費(fèi)觀念也由數(shù)量型轉(zhuǎn)向質(zhì)量型，對食品衛(wèi)生質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求越練越高，這就對食品檢測技術(shù)提出更高的要求。由于食品種類豐富，食品中檢測的有毒有害物質(zhì)種類和組分繁多，需要檢測的物質(zhì)

2、質(zhì)量極低，樣品中待檢物的濃度常為Ng、ng甚至pg級，除此之外，許多檢測物除需檢測物質(zhì)本身，還涉及其衍生物和降解物測定。區(qū)別同位異構(gòu)體以及元素的價態(tài)等。因此食品檢測要求檢測方法更加準(zhǔn)確、快速、方便，也使得其他學(xué)科的先進(jìn)技術(shù)不斷應(yīng)用于食品檢測領(lǐng)域中來，由于新技術(shù)的引入， 食品行業(yè)開發(fā)出了許多自動化程度和精確度很高的檢測儀器，這不僅縮短了分析時間，減少了人力誤差，也大大提高了食品分析檢測的速度、靈敏度和準(zhǔn)確度?，F(xiàn)代食品檢測技術(shù)主要包括以下幾個方面：計算機(jī)視覺技術(shù)；現(xiàn)代儀器分析技術(shù)；食品物性的力學(xué)、聲學(xué)和電學(xué)檢測 技術(shù)；電子傳感檢測技術(shù)；生物傳感技術(shù)；核酸探針檢測技術(shù)；PCRS因擴(kuò)增技術(shù)；免疫學(xué)檢測

3、技術(shù)。免疫學(xué)檢測技術(shù)是食品檢測技術(shù)中的一個重要組成局部，特別是三大免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)、 酶免疫技術(shù)、放射免疫技術(shù)在食品檢測中得到了廣泛應(yīng)用。利用免疫學(xué)檢測技術(shù)可檢測細(xì)菌、病毒、真菌、各種毒素、寄生蟲等，還可用于蛋白質(zhì)、激素、其他生理活性物質(zhì)、藥物殘留、抗生素等的檢測，其檢測方法簡便、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)，特別是單克隆抗體的開展，使得免疫檢測方法特異性更強(qiáng)，結(jié)果更準(zhǔn)確。免疫分析是抗原與抗體的特異性、 可逆性結(jié)合為根底的分析技術(shù)。1959年，Yalow和Berson將發(fā)射性同位素示蹤與免疫反響相結(jié)合建立了發(fā)射免疫測定法，從而開創(chuàng)了免疫分析這一嶄新領(lǐng)域，次后又開展了許多替代或非同位素免疫免疫分

4、析法。1免疫熒光技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用免疫熒光分析 (Immuno Fluorescence Assay , IFA) 始創(chuàng)于20世紀(jì)40年代初，1942年Cons等首次報道用異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗體，檢查小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗體，但此種熒光素標(biāo)記物的性能較差，未能推廣應(yīng)用，20世紀(jì)50年代，Riggs等合成性能較為優(yōu)良的異硫氰酸熒光素。Mashall等對熒光抗體的標(biāo)記方法又進(jìn)行了改良，從而使得免疫熒光技術(shù)逐漸推廣應(yīng)用。11根本原理抗體與熒光素結(jié)合后，并不影響其與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性反響，事先將待測抗原固定與玻璃載玻片上，滴加熒光標(biāo)記抗體，假設(shè)熒光標(biāo)記抗體與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié)合

5、反響，不能被緩沖液沖掉，載熒光顯微鏡下可觀察到熒光，否那么熒光抗體被緩沖液沖掉，在顯微鏡下觀察不到熒光。12熒光免疫測定法的分類根據(jù)標(biāo)記熒光產(chǎn)生的方式不同分為底物標(biāo)記熒光測定法、熒光偏振免疫測定法、熒光猝滅增強(qiáng)免疫測定法。FIA可使用均相或非均相分析方式，均相FIA應(yīng)用較多。121底物標(biāo)記熒光測定法底物標(biāo)記熒光測定法SLFIA使用一種酶的底物標(biāo)記待測物，底物本身無熒光，在受到相 應(yīng)酶的催化時能轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒馕铮?dāng)標(biāo)記底物與抗體結(jié)合產(chǎn)生的空間位阻阻礙了酶與標(biāo)記底物間的接觸，樣品中的待測物通過競爭作用使游離的酶標(biāo)結(jié)合物或熒光強(qiáng)度增加。122熒光偏振免疫測定法使用偏振光作為激發(fā)光時，視分子的運(yùn)動狀態(tài)，發(fā)

6、射的熒光可能是振動方向各向隨機(jī)化的普通熒光，或是只在某一平面振動的偏振熒光ploarized fluorescence在反響液中，游離的標(biāo)記物分子體積小，在布朗運(yùn)動中轉(zhuǎn)動速度快，受偏振光照射后產(chǎn)生的熒光偏振方向被分散，不能產(chǎn)生偏振光，只發(fā)射普通熒光；與抗體結(jié)合的標(biāo)記物分子體積增大，布朗運(yùn)動速度減慢，甚至不能轉(zhuǎn)動而形成定向排列，所以受偏振光激發(fā)后能產(chǎn)生偏振熒光，樣品中的待測物的量越大，偏振熒光的強(qiáng)度越高。123熒光淬滅免疫測定法熒光淬滅免疫測定法Fluoresecent Quenching Immunoassay的原理是當(dāng)熒光標(biāo)記物與抗體 結(jié)合后發(fā)生熒光淬滅。熒光猝滅的機(jī)制尚不清楚，熒光淬滅可能

7、與標(biāo)記物與抗體結(jié)合后導(dǎo)致電子振動狀態(tài)的改變有關(guān)。124熒光增強(qiáng)免疫測定法熒光增強(qiáng)免疫測定法Fluoresecent Enhancement Immunoassay的原理與熒光淬滅增強(qiáng)免疫測定法相似，不同的是標(biāo)記物與抗體結(jié)合后熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。2酶免疫檢測技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用酶免疫檢測技術(shù)是在20世紀(jì)60年代在熒光和組織化學(xué)的根底上開展起來的一種新技術(shù)，最初用酶代表熒光素標(biāo)記抗體作為生物組織中抗原的鑒定和定位。隨后開展為用于鑒定免疫擴(kuò)散及免疫電泳板上的沉淀線，到1971年，Engrall等用堿性磷酸酶標(biāo)記抗原或抗體，建立了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA ，這一技術(shù)因其高度的準(zhǔn)確性、特異性、應(yīng)用范圍廣、

8、檢測速度快以及費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，是目前食品檢測中令人矚目的有開展前途的一種新技術(shù)。21酶免疫技術(shù)的根本原理用酶標(biāo)記的抗原抗體，然后與樣品在一定條件下反響，如果樣品中含有相應(yīng)的抗體抗原 ，抗原抗體結(jié)合形成復(fù)合物中所帶酶分子遇到底物時，能催化底物水解、氧化或復(fù)原，產(chǎn)生顯色反響，這樣就可以定性定量測定樣品中的抗體抗原。22酶免疫技術(shù)的分類酶免疫技術(shù)開展迅猛，種類繁多，酶免疫技術(shù)分為酶免疫組化技術(shù)和酶免疫測定技術(shù)，酶免疫測定技術(shù)又分為均相免疫測定和異相免疫測定技術(shù)，異相免疫測定技術(shù)又分為固相免疫測定技術(shù)和液相免疫測定技術(shù)。23酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)231根本原理抗體抗原與酶結(jié)合后，仍然能和相應(yīng)的抗原抗體發(fā)生

9、特異性結(jié)合，將待測樣品事先包被于固相載體外表，參加酶標(biāo)抗體抗原，酶將抗體抗原于吸附于固相載體上相應(yīng)的抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合反響，形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物，不能被緩沖液沖掉，當(dāng)參加酶的底物時， 底物發(fā)生化學(xué)反響， 呈顏色變化， 顏色深淺與待測抗原或抗體的量有關(guān)， 可定性或定量測 定抗原或抗體。ELISAS用的方法有直接法、間接法、雙抗體夾心法、雙夾心法和競爭法。2. 3. 2 ELIS徽術(shù)在食品平安性檢測中的應(yīng)用及前景ELIS徽術(shù)把抗原抗體特異性與酶反響的敏感性相結(jié)合，使食品在未經(jīng)別離的提取的情況下，即可進(jìn)行定性和定量分析。近年來， 該技術(shù)在食品平安檢測中正逐步推廣應(yīng)用，用于細(xì)菌及其毒素、真菌及其

10、毒素、病毒、寄生蟲的檢測。還用于蛋白質(zhì)、激素、農(nóng)業(yè)殘留、獸藥殘留和抗生素 及食品成分和劣質(zhì)食品的檢測分析。ELISA技術(shù)由于靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測費(fèi)用低和易于商 品化，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。3放射免疫技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用放射免疫技術(shù)Radio Immunoassay ,RIA 是以放射性核素為標(biāo)記物的標(biāo)記免疫分析法。是由Yalow和Berson于1960年創(chuàng)立的標(biāo)記免疫分析技術(shù)。由于標(biāo)記物放射性核素的檢測靈敏性， 本法靈敏度高，測定準(zhǔn)確性良好，特別適應(yīng)于蛋白質(zhì)、激素和多肽的精確定量測定。31根本原理放射免疫分析的根本原理是標(biāo)記抗原和非標(biāo)記抗原對特異性抗體的競爭結(jié)合反響。在這一反應(yīng)系統(tǒng)中，

11、作為試劑的標(biāo)記抗原和抗體的量是固定的，抗體量一般采用能結(jié)合40-50%的標(biāo)記抗原，而受檢標(biāo)本中的非標(biāo)記抗原是變化的，根據(jù)標(biāo)本中抗原的量不同，得到不同的反響結(jié)果。當(dāng)標(biāo)記抗原、非標(biāo)記抗原和特異性抗體三者同時在于一個反響系統(tǒng)時，由于標(biāo)記抗原和非標(biāo)記抗原對特異性抗體具有相同的結(jié)合力，因此兩者相互競爭特異性的抗體，由于標(biāo)記抗原與特異性抗體的量是固定的，故標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物形成的量就隨著非標(biāo)記抗原的量而改變。非標(biāo)記抗原量增加， 相應(yīng)的結(jié)合較多的抗體，從而抑制了標(biāo)記抗原對抗體的結(jié)合，是標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物的量相應(yīng)減少，游離的標(biāo)記抗原相應(yīng)的增加，亦即抗原抗體復(fù)合物中的放射性強(qiáng)度與受檢標(biāo)本中抗原的濃度呈反比。假設(shè)

12、將抗原抗體復(fù)合物與游離的標(biāo)記抗原分開，分別測定其放射強(qiáng)度，就可計算出結(jié)合的標(biāo)記抗原B與游離的標(biāo)記抗原F的比值B/F,這與標(biāo)本中的抗原呈函數(shù)關(guān)系。用一系列不同的標(biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行測定，計算相應(yīng)的B/F值，可得到一條劑量反響曲線，受檢標(biāo)本在同樣條件下進(jìn)行測定，計算B/F值，即可在劑量反響曲線是查出標(biāo)本中的抗原含量。放射免疫測定分為液相放射免疫測定和固相放射免疫測定。42放射免疫技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用RIA測定就是應(yīng)用放射性物質(zhì)代替ELISA中的標(biāo)記酶作為抗原或抗體耦聯(lián)物，在食品平安檢 測中最常見的同位素是3H和14C。1978年，Charm在RIA技術(shù)的根底上開展了放射免疫檢測技術(shù)RRA,放射免疫檢測在

13、快速檢測方面最成功的是CharmH 6600/7600抗生素快速檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)就是利用專一受體來識別結(jié)合于同一類抗生素族中的母環(huán)以便最快速同時檢測同一抗生素族在樣品中的殘留情況。目前，Charnnll 7600檢測系統(tǒng)就B內(nèi)酰胺類、氯霉素類、四環(huán)素類、 磺胺類、氨哇西林及堿性磷酸酶這六項(xiàng)檢測以被FDA認(rèn)可。放射免疫技術(shù)由于可以防止假陽性，適宜于陽性率較低的大量樣品檢測，對水產(chǎn)品、肉類產(chǎn)品、 果疏產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留量的檢測中廣泛應(yīng)用。 還可檢測經(jīng)食品傳播的細(xì)菌及毒素、真菌及毒素、病毒和寄生蟲及小分子物質(zhì)和大分子物質(zhì)。如南京農(nóng)業(yè)大學(xué)用放射免疫測定牛奶中的天花粉蛋白。4免疫膠體金檢測技術(shù)在食品檢測中

14、的應(yīng)用免疫膠體金檢測技術(shù)又叫Rosa.Tests法，是利用膠體金顆粒進(jìn)行標(biāo)記的一項(xiàng)新技術(shù)。51根本原理氯金酸HAuCl在復(fù)原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成負(fù)電的疏水膠溶液，由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等分子被吸附到膠體金顆粒外表的過程，吸附機(jī)理可能是膠體金顆粒外表帶有負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而行形成牢固結(jié)合，用復(fù)原法可以方便地從HAuC4制備各種不同的粒徑，不同顏色的膠體金顆粒，這種球形的顆粒對蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能，可以與葡萄球菌A蛋白、毒素、免疫球蛋白、糖蛋白、酶、抗生素、激素等非共價結(jié)合。免疫膠體金檢測原理是利用了金顆粒

15、具有電子密度的特性，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)配體處大量聚集時， 肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)。因而可用于定性或定量的快速檢測方法中。這一方法可通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。62免疫膠體金技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用該技術(shù)當(dāng)前主要用于在牛奶中檢測抗生素，可在十分鐘內(nèi)快速檢測牛奶中的抗生素，利用該技術(shù)可檢測的抗生素種類有六種，B內(nèi)酰胺、四環(huán)素、磺胺二甲喀噬、恩諾沙星和黃曲霉毒素， 可檢測的B-內(nèi)酰胺藥物有氨葦青霉素、阿莫西林、鄰氯青霉素頭抱嚷味、頭抱霉素和青霉素G等。由于該技術(shù)結(jié)果直觀、操作簡單，在食品平安檢測中有廣闊的應(yīng)用前景。7單克隆抗體技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用抗體主要由B淋巴細(xì)胞合成，每個B淋巴

16、細(xì)胞有合成一種抗體的遺傳基因，如果能選出一個制造一種專一抗體的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就可以得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而形成的細(xì)胞群，即克隆。單克隆細(xì)胞將合成一種決定簇的抗體。1975年，Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成了雜交細(xì)胞即可產(chǎn)生抗體，又可無限增殖，從而創(chuàng)學(xué)習(xí)-好資料更多精品文檔立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)為醫(yī)學(xué)和生物學(xué)根底研究開創(chuàng)了新紀(jì)元，是免疫學(xué)領(lǐng)域的 重大突破。5. 1根本原理B淋巴細(xì)胞具有專一性的合成針對某一抗原決定簇的抗體，但這種B淋巴細(xì)胞不能在體外生長，而骨髓瘤細(xì)胞可在體外生長，應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細(xì)胞與免疫的淋巴細(xì)胞

17、二者合二為 一，得到雜種的骨髓瘤細(xì)胞即雜交瘤細(xì)胞，這種雜交瘤細(xì)胞即具有專一性合成某一抗體的特性， 也具有瘤細(xì)胞能在體外無限增殖的特性， 用這種雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞群，可制備抗一種抗原決 定簇的特異性單克隆抗體，這種用雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體稱為第二抗體，主要抗原能引起小鼠的抗體應(yīng)答，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)可獲得幾乎所有抗原的單克隆抗體。5. 2單克隆抗體技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用單克隆抗體在食品檢測中最大的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)， 不易出現(xiàn)假陽性。在食品檢測中有廣泛的 應(yīng)用前景。目前人們已制備出各種經(jīng)食品傳播和引起食物中毒的細(xì)菌及毒素、 真菌及毒素、病毒、 寄生蟲、農(nóng)藥、激素等的單克隆抗體并建立的檢測方法?；前?/p>

18、二甲喀呢和克倫特羅瘦肉精這兩種藥物被歐美各國和我國列為獸藥殘留控制重點(diǎn)， 國內(nèi)研究出了用于動物性食品中磺胺二甲喀噬檢測的單克隆抗體試劑盒和克倫特羅殘留檢測的 多克隆試劑盒。這兩種試劑盒具有特異性強(qiáng)、儀器化程度低、樣品前處理簡單、檢測時間短，在 實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用前景廣闊，填補(bǔ)了國內(nèi)空白。單克隆抗體檢測技術(shù)可在十分鐘內(nèi)快速檢測有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、有機(jī)氯類、擬除蟲菊酯類及激素類的殘留量為農(nóng)產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)平安提供技術(shù)支持。英國建立了自動肉制品中的沙門氏菌的單克隆抗體檢測方法，人們還制出了單核增生性李特氏桿菌的單抗，用單抗ELISA檢測該菌。乳中氯霉素的單克隆抗體檢測技術(shù)也被建立。食品儲藏過程中會受到霉菌

19、污染，現(xiàn)已從青霉、毛霉等霉菌中提取耐熱性抗原制成單克隆抗 體用ELISA方法可檢出加熱和未加熱食品中的霉菌。6免疫測定新技術(shù)6. 1脂質(zhì)體免疫測定法脂質(zhì)體免疫測定法LIA是一種較新的免疫測定技術(shù)，脂質(zhì)體是由磷脂或由其他類脂分子 在水相中自發(fā)形成的一種密閉的雙分子單層或多層囊泡，脂質(zhì)體外表還可以連接抗原或抗體分 子。這種生物模擬膜在形成過程中能包裹水及其中的溶質(zhì)染料或酶，膜的穩(wěn)定性可隨免疫反應(yīng)有規(guī)律變化。根據(jù)釋放出的標(biāo)記物的量進(jìn)行測定，所以LIA具有很高的信號放大作用。目前LIA主要存在脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和非特異性溶解問題。6. 2克隆酶給予體免疫測定法克隆酶給予體免疫測定法CEDIA是一種新型均相

20、免疫測定法。CEDIA中使用由重組DNA技術(shù)獲得的 半乳糖甘酶兩個獨(dú)立的蛋白質(zhì)片段， 這兩個片段獨(dú)立存在時無酶活性，但兩個片段結(jié)合那么顯示催化活性。以此作為分析方法的根底。其中較小片段稱為酶給予體片段ED,另 一片段稱為酶受體片段EQ。ED標(biāo)記物與抗體集合后不再與EA形成酶，所以當(dāng)樣品中待測物 增加時那么游離ED標(biāo)記物增多，使反響液中酶產(chǎn)生增加，經(jīng)底物顯色測定。CEDIA是目前靈敏度學(xué)習(xí) 好資料更多精品文檔較高的均相免疫測定法。63發(fā)光免疫測定法發(fā)光免疫測定法CLIA常用魯米諾Luminol、異魯米諾Isoluminol 及其衍生物進(jìn)行 標(biāo)記。這些環(huán)肌類化合物在堿性條件下可被氧化產(chǎn)生3-胺基苯

21、二甲酸鹽和430nm的發(fā)射光。在魯米諾的芳氨基上進(jìn)行烴鏈取代后產(chǎn)光性能增強(qiáng)，但假設(shè)置換芳氨基那么發(fā)光被破壞。 另外丫叮酯也用于發(fā)光標(biāo)記。CLIA操作簡單、靈敏度高、測定速度快。但CLIA產(chǎn)光物質(zhì)發(fā)光時間極短數(shù)秒 鐘 ，測定誤差較大。64免疫傳感器技術(shù)免疫傳感器是生物傳感器的一種，近年來已取得迅速開展。免疫傳感器的探頭主要由兩局部組成；感受器：通常覆有連接有特異性抗體的可更換的傳感膜；換能器：能將抗原抗體產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)換為可供儀器檢測的電信號。免疫傳感器使用對象廣泛，專一性較強(qiáng)，高度的自動化，微型化與集成化減少對使用者及環(huán)境技術(shù)條件的依賴，測定速度快，適合現(xiàn)場或野外操作。65多組分免疫測定法根據(jù)不同檢測物標(biāo)記方法互不相同，分析條件和檢測信號互不干擾。同一反響液中同時檢測不同的檢測物。但這種