關(guān)于慢病毒感染的相關(guān)知識總結(jié)

1、慢病毒使用操作手冊一、慢病毒的儲存與稀釋:      1.  病毒的儲存：收到病毒液后在很短時間內(nèi)即使用慢病毒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以將病毒暫時放置于4 保存；如需長期保存請放置于-80（病毒置于凍存管，并使用封口膜封口）       病毒可以存放于-80 6個月以上；但如果病毒儲存時間超過6個月，建議在使用前需要重新滴定病毒滴度       反復(fù)凍融會降低病毒滴度：每次凍融會降低病毒滴度10%；因此在病毒

2、使用過程中應(yīng)僅盡量避免反復(fù)凍融，為避免反復(fù)凍融,建議收到病毒后按照每次的使用量進(jìn)行分裝。      2.  病毒的稀釋：如果需要稀釋病毒，請將病毒取出置于冰浴融解后，使用培養(yǎng)目的細(xì)胞用PBS或無血清培養(yǎng)基(含血清或含雙抗不影響病毒感染)。混勻分裝后4保存(請盡量在三天內(nèi)用完) 分裝后使用。      二、慢病毒用于體外（In Vitro）實(shí)驗(yàn)：      感染培養(yǎng)原代細(xì)胞和建系細(xì)胞。慢病毒對各種細(xì)胞和組織的

3、親嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，了解慢病毒對您的目的細(xì)胞的親嗜性，感染復(fù)數(shù)（MOI 值）以及在體（In Vivo）注射所需要的病毒量。如果沒有相關(guān)文獻(xiàn)支持，可以通過感染預(yù)實(shí)驗(yàn)得到合適的感染復(fù)數(shù)（MOI 值）（使用24孔板檢測病毒對目的細(xì)胞的親嗜性）。      慢病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)      1.  慢病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：       測定慢病毒對目的細(xì)胞的親嗜性時，需要同

4、時設(shè)置對慢病毒親嗜性較高的細(xì)胞(HEK293T，Hela）作為平行實(shí)驗(yàn)的對照細(xì)胞。       在進(jìn)行慢病毒感染實(shí)驗(yàn)時，可以用完全培養(yǎng)基（培養(yǎng)目的細(xì)胞用）稀釋；理論上，含有血清，雙抗或者其他營養(yǎng)因子的完全培養(yǎng)基不影響慢病毒的感染效率。       一般慢病毒單位為TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。如：病毒滴度為>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108個具有生物活性的慢病毒顆粒。    

5、;  2.  以24孔培養(yǎng)板為例，進(jìn)行目的細(xì)胞和HEK293T 細(xì)胞的感染預(yù)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前按照不同的MOI設(shè)置不同的感染孔，并根據(jù)MOI和細(xì)胞數(shù)量計(jì)算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者無血清培養(yǎng)基稀釋病毒原液。      第一天，準(zhǔn)備細(xì)胞：在24孔培養(yǎng)板接種若干孔，每個孔內(nèi)接種35X104個目的細(xì)胞，鋪板時細(xì)胞的融合率為50%左右，每孔培養(yǎng)基體積為100 l；進(jìn)行病毒感染時細(xì)胞的融合度約為70%左右。      第二天，準(zhǔn)備病毒：取出4保

6、存的病毒，使用臺式離心機(jī)離心20 秒（使病毒完全懸于離心管底部即可）；如果是凍存在-80的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況將按照MOI準(zhǔn)確計(jì)算好的慢病毒稀釋到培養(yǎng)基中，并盡可能保證所獲得的含有慢病毒的培養(yǎng)基的總體積為最小體積，以期獲得最佳的感染效率。      第二天，感染目的細(xì)胞：病毒準(zhǔn)備好之后，從培養(yǎng)箱中拿出細(xì)胞，首先察細(xì)胞生長狀態(tài)，如細(xì)胞狀態(tài)較好則開始實(shí)驗(yàn)。      a使用移液器吸取準(zhǔn)確體積的病毒液加入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基。  &#

7、160;   b吸去培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿中的培養(yǎng)基（如果細(xì)胞生長良好，密度適宜，則不用換液）。      c在目的細(xì)胞和對照細(xì)胞中分別加入計(jì)算好的病毒液。      d混勻后放于二氧化碳培養(yǎng)箱（37、5%CO2）孵育過夜。      注：感染前細(xì)胞的狀態(tài)好壞對最終的感染效果高低影響很大，所以務(wù)必保證加病毒之前細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)。亦可以將預(yù)先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基和慢病毒的混合液直接加入培養(yǎng)器皿中

8、。慢病毒對目的細(xì)胞的感染效率較低，通過提高M(jìn)OI 值可以提高病毒的感染效率，但是當(dāng)MOI高于20時，我們建議在培養(yǎng)基中加入ploybrene（8 g/ml左右）來提高病毒的感染效率。      第三天，更換培養(yǎng)液：一般在24小時候后將含有慢病毒的培養(yǎng)液更換成正常培養(yǎng)液；在感染后觀察細(xì)胞狀態(tài)，如果慢病毒對細(xì)胞有明顯毒性作用而影響細(xì)胞生長狀態(tài)，可以最短在加病毒4小時候更換新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)（建議在8-12小時更換為宜）。第一次換液后，如果慢病毒對細(xì)胞沒有明顯毒性作用，按照正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)換液。   

9、0;  第六天，感染效率檢測：在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，估計(jì)慢病毒感染目的細(xì)胞的效率；如何由于目的基因較大而造成選擇的載體不能攜帶Marker Gene的，可以通過Real-timeRT-PCR檢測目的基因的表達(dá)來拍評估感染效率。      注意：      有些慢病毒載體上帶有GFP 綠色熒光蛋白，使用者可以在病毒感染96小時后用倒置熒光顯微鏡觀察GFP 綠色熒光，以觀察病毒對目的細(xì)胞的感染情況。如果慢病毒載體攜帶其他Marker Gene如RFPBFP

10、可以用熒光顯微鏡在對應(yīng)的激發(fā)光波長下觀察熒光表達(dá)的情況。      慢病毒表達(dá)時間較慢，熒光表達(dá)所需時間較長，建議感染后96小時后觀測熒光表達(dá)。      感染后的細(xì)胞可以連續(xù)培養(yǎng)一周，通過觀察熒光的表達(dá)時間和表達(dá)強(qiáng)度來確定慢病毒對目的細(xì)胞的感染情況。感染期間請根據(jù)細(xì)胞生長的情況對細(xì)胞進(jìn)行及時換液，以保證細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。      三、慢病毒使用安全使用規(guī)范    

11、0; 慢病毒中的毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒因此沒有毒性作用。但該病毒仍然具有可能的潛在的生物學(xué)危險(xiǎn)，不建議使用編碼已知或可能會致癌的基因的假型病毒。除非已經(jīng)完全公認(rèn)某個基因肯定沒有致癌性，否則均不建議采用假型病毒進(jìn)行生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。使用時請參照如下所示進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：      1病毒操作時最好使用生物安全柜。如果使用普通超凈工作臺操作病毒，請不要打開排風(fēng)機(jī)。      2病毒操作時請穿實(shí)驗(yàn)服，帶口罩和手套。   &

12、#160;  3操作病毒時特別小心不要產(chǎn)生氣霧或飛濺。如果操作時超凈工作臺有病毒污染，請立即用70%乙醇加1%的SDS 溶液擦拭干凈。接觸過病毒的槍頭，離心管，培養(yǎng)板，培養(yǎng)液請于84 消毒液或1%SDS 中浸泡過夜后棄去。      4用顯微鏡觀察細(xì)胞感染情況時應(yīng)遵從以下步驟：擰緊培養(yǎng)瓶或蓋緊培養(yǎng)板。用70%乙醇清理培養(yǎng)瓶外壁后到顯微鏡處觀察拍照。離開顯微鏡實(shí)驗(yàn)臺之前，用70%乙醇清理顯微鏡實(shí)驗(yàn)臺。      5如需要離心，應(yīng)使用密封性好的離心管，或者用封

13、口膜封口后離心，而且盡量使用組織培養(yǎng)室內(nèi)的離心機(jī)。      6脫掉手套后，用肥皂和水清洗雙手。  四、懸浮細(xì)胞感染方法概要       1.  根據(jù)細(xì)胞的量將細(xì)胞在1.5ml 管中離心收集然后用100-200ul 的無血清培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞沉淀，以細(xì)胞完全浸沒在培養(yǎng)基中為準(zhǔn)。      2.  按照MOI 換算病毒顆粒數(shù)量，吸取病毒液加入細(xì)胞中，將1.5ml 管放在37度培養(yǎng)箱中

14、孵育30 分鐘。      3.  將管中混合溶液吸出加到培養(yǎng)皿中或孔里。      4.  加入足夠量的新鮮培養(yǎng)液。      5.  12 小時后換液。      6.  96 小時后觀察細(xì)胞陽性率。五、相關(guān)專業(yè)術(shù)語：MOI：病毒感染復(fù)數(shù)傳統(tǒng)的MOI 概念起源于噬菌體感染細(xì)菌的研究。其含義是感染時噬菌體與細(xì)菌的數(shù)量

15、比值，也就是平均每個細(xì)菌感染噬菌體的數(shù)量。噬菌體的數(shù)量單位為pfu。一般認(rèn)為MOI 是一個比值，沒有單位，其實(shí)其隱含的單位是pfu number/cell。后來MOI 被普遍用于病毒感染細(xì)胞的研究中，含義是感染時病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值，本手冊中提到的MOI都是沿用這個概念。然而，由于病毒的數(shù)量單位有不同的表示方式，從而使MOI 產(chǎn)生了不同的含義。能產(chǎn)生細(xì)胞裂解效應(yīng)的病毒例如單純皰疹病毒等習(xí)慣上仍用pfu 表示病毒數(shù)量，因此其MOI 的含義與傳統(tǒng)的概念相同。      六、細(xì)胞培養(yǎng)器皿的相關(guān)參數(shù) Flask/DishSurfac

16、e (mm)Cell numberMedia Volume96 well plate501.5-5.0×10100 l48 well plate1003.0×104-1.0×10200 l24 well plate2008.0×104-2.0×10500 l12 well plate4011.6-4.0×101.0 ml6 well plate9623.0-8.0×102.0 ml35mm9623.0-8.0×102.0 ml60mm28271.0-2.5×10 6.0 ml100mm78542

17、.5-6.4×1010.0 ml 慢病毒重組慢病毒簡介在轉(zhuǎn)染遺傳物質(zhì)到細(xì)胞基因組中的工作中，重組慢病毒載體是一個強(qiáng)大和有效的工具。慢病毒能作用于細(xì)胞周期的G0/G1期，同時具有嗜核性，所以可以感染分裂期細(xì)胞和非分裂期細(xì)胞，感染包括幾乎所有的哺乳動物細(xì)胞、干細(xì)胞和原代培養(yǎng)的細(xì)胞。慢病毒載體具有攜帶基因片段容量大、轉(zhuǎn)染效率高、可感染分裂細(xì)胞及非分裂細(xì)胞、目的基因可在宿主細(xì)胞中長時間穩(wěn)定表達(dá)以及安全性好、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)。所以獲得了較廣的應(yīng)用范圍。慢病毒載體也是RNAi表達(dá)的主要手段，同化學(xué)合成和酶切形成的siRNA相比具有幾個優(yōu)點(diǎn)：其一，可以攜帶GFP或螢光素酶等報(bào)告基因共表達(dá)

18、，便于跟蹤、選擇和富集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；其二，可以根據(jù)需要表達(dá)不同類型的小RNA分子（siRNA、shRNA或miRNA）；其三，具有較高的轉(zhuǎn)染效率，使基因沉默維持較長時間。目前Pubmed中收錄有關(guān)慢病毒載體用作實(shí)驗(yàn)的文章超過7萬多篇，僅Nature,，Science,，Cell上便超過600篇。已成為國際上最通用的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，廣泛用于各類實(shí)驗(yàn)室。 慢病毒的安全操作規(guī)范深圳百恩維提供的慢病毒均采用第三代系統(tǒng)的慢病毒載體。水泡性口炎病毒來源的VSV-G基因代替HIV-1的env基因，這既提高了慢病毒的安全性，又使其能夠感染的細(xì)胞種類大大增加。本系統(tǒng)的慢病毒顆粒是“自身失活型(SIV)”，整合

19、入靶細(xì)胞后，不會產(chǎn)生完整長度的RNA，僅僅具有攜帶目的基因的功能，感染目的細(xì)胞后不再感染其他細(xì)胞，也不會利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒。盡管如此，該病毒仍然具有潛在的生物學(xué)危險(xiǎn)性，因此建議不要使用編碼已知或可能會致癌的基因的假性病毒；并強(qiáng)烈建議將本系統(tǒng)生產(chǎn)的慢病毒視為二級生物安全水平的生物，而且嚴(yán)格遵守BSL-2或BSL-2+操作手冊并進(jìn)行相應(yīng)的廢棄物消毒?；静僮饕?guī)范如下：1、在實(shí)驗(yàn)室工作時，任何時候都必須穿著連體衣、隔離服或工作服；應(yīng)戴上合適的手套和口罩。2、病毒操作時最好使用生物安全柜。如果使用普通的超凈工作臺操作病毒，請不要打開風(fēng)機(jī)。3、所有的技術(shù)操作要按盡量減少氣溶膠和微小液滴形成的方

20、式來進(jìn)行。如果出現(xiàn)病毒污染，請立即用70%的酒精加1%SDS溶液擦拭干凈。4、如需離心，應(yīng)使用密封性好的離心管，可用Parafilm膜封口后離心，而且最好使用組織或細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)的離心機(jī)。5、用顯微鏡觀察細(xì)胞感染情況時遵從以下步驟：擰緊培養(yǎng)瓶或蓋緊培養(yǎng)板，并在使用70%乙醇清理所有受到污染的材料、標(biāo)本和培養(yǎng)物在廢棄或清潔再利用之前，必須清除污染。廢棄的含病毒的培養(yǎng)基加入84消毒液（1:20左右），浸泡一天后丟棄。接觸過病毒的槍頭，離心管，培養(yǎng)板等其他物品可用84消毒液稀釋液處理，也可以用煮沸處理半小時或高壓濕熱滅菌（121，30min）。6、手套用完后，應(yīng)先消毒再摘除，隨后必須洗手。詳細(xì)操作規(guī)范

21、請參閱衛(wèi)生部發(fā)布的微生物和生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則（WS233-2002）、美國疾病控制中心出版的微生物和生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)生物安全（第五版）和世界衛(wèi)生組織出版WHO生物安全手冊。操作慢病毒時請依照現(xiàn)有的使用指南。 包裝細(xì)胞293T細(xì)胞（下述流程來自深圳百恩維，如果使用不同公司系統(tǒng)請參考各公司提供的方案，本流程僅供參考） 293T細(xì)胞的凍存1、隨著傳代的次數(shù)增加，293T細(xì)胞會出現(xiàn)生長狀態(tài)下降，出現(xiàn)突變等，所以要在細(xì)胞購進(jìn)時就進(jìn)行備份。2、在細(xì)胞對數(shù)生長期進(jìn)行凍存，增加細(xì)胞復(fù)蘇成活率。3、倒去細(xì)胞上清液，加入D-Hank's液洗去殘留的培養(yǎng)基。4、加入0.25%的胰

22、酶，消化10-20s后倒去。5、鏡下觀察細(xì)胞變圓，細(xì)胞間間隙加大時，加入新鮮培養(yǎng)基吹打混勻。6、細(xì)胞計(jì)數(shù)。7、將細(xì)胞離心，1000rpm，2min。8、根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果加入細(xì)胞凍存液（70%完全培養(yǎng)基+20%FBS+10% DMSO）重懸細(xì)胞，密度為3×106個/ml。10、第二天將細(xì)胞放入液氮灌，并記錄。 293T細(xì)胞的傳代1、當(dāng)細(xì)胞生長至匯合率達(dá)到8090%需要對細(xì)胞進(jìn)行傳代操作，以擴(kuò)大細(xì)胞數(shù)量，維持細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。2、消化細(xì)胞，方法同上。3、細(xì)胞離心結(jié)束后，加入完全培養(yǎng)基重懸。密度為3×105個/ml。4、分到10cm培養(yǎng)皿中，10ml/皿。 29

23、3T細(xì)胞的復(fù)蘇1、當(dāng)細(xì)胞傳代次數(shù)過多（超過50代），細(xì)胞狀態(tài)變差時或細(xì)胞出現(xiàn)污染事故時，需要丟棄并對開始凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇。2、打開水浴鍋，設(shè)置溫度為37。3、查看細(xì)胞庫記錄，根據(jù)記錄從液氮灌中取出凍存的細(xì)胞（需戴上棉手套，防止被凍傷），迅速丟入水浴鍋中并快速晃動，在12 min內(nèi)使細(xì)胞溶液完全溶解。4、將1ml細(xì)胞溶液加入9 ml完全培養(yǎng)基中并混勻后轉(zhuǎn)入10cm培養(yǎng)皿。5、放回37、5%CO2和95%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6、第二天觀察細(xì)胞存活率。倒掉舊的培養(yǎng)基，加入10ml新鮮培養(yǎng)基。 慢病毒的包裝、濃縮和滴度測定1、所用病毒檢測引物為WPRE特異引物，序列如下5'-C

24、CTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2、TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems， cat. no. 4304437)3、TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems， cat. no.

25、401970)4、TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems， cat. no. 4316844)  用于包裝的293T細(xì)胞(ATCC No. CRL-11268)必需選擇處于生長旺盛期，細(xì)胞狀態(tài)較佳，存活率90%以上，細(xì)胞邊緣清晰，傳代次數(shù)較低。任何時候細(xì)胞匯合率都不準(zhǔn)達(dá)到100%。 慢病毒的包裝1、預(yù)先準(zhǔn)備3個T150瓶的293T細(xì)胞，培養(yǎng)基為DMEM + 10% FBS，1% Glutamax ，1% 青霉素-鏈霉素。2、將細(xì)胞分到12個T150瓶中，每瓶的細(xì)胞密度是8&#

26、215;106個。3、第二天，鏡下檢查細(xì)胞。細(xì)胞融合度應(yīng)大致為30-40%，分布均勻。4、轉(zhuǎn)染前1小時，取出細(xì)胞板，去除原有細(xì)胞培養(yǎng)基，加入20ml的Opti-MEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞送回培養(yǎng)箱。5、取兩支無菌的50ml離心管，其中一支中加入252 g pNL-EGFP/CMV/WPREDU3 載體質(zhì)粒，168 g pCD/NL-BH*DDD 包裝質(zhì)粒和84 g pLTR-G質(zhì)粒，用Opti-MEM培養(yǎng)基補(bǔ)齊到18ml。另一支中加入500 l Trans-EZ溶液和17.5 ml Opti-MEM培養(yǎng)基，用電動移液器輕輕混勻。將Trans-EZ稀釋液滴加到質(zhì)粒管中，邊加邊輕輕晃

27、勻。關(guān)鍵步驟：推薦使用Qiagen質(zhì)粒大抽試劑盒或相當(dāng)?shù)脑噭┖兴苽涞馁|(zhì)粒。6、室溫孵育20分鐘，使DNA和Trans-EZ充分結(jié)合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合體。7、取1支5ml的移液管，將得到的DNA-Trans-EZ復(fù)合體均勻滴加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，每板3ml。來回晃動培養(yǎng)板，混勻后放回到5%二氧化碳培養(yǎng)箱。每一皿細(xì)胞培養(yǎng)盤不要超過6盤。8、6小時后，移去細(xì)胞上清，更換為17ml的DMEM完全培養(yǎng)基。9、轉(zhuǎn)染后一天觀察細(xì)胞，所有的細(xì)胞應(yīng)當(dāng)都是健康的并且密度接近60-80%。如果所轉(zhuǎn)染質(zhì)粒帶有GFP熒光，那么這時候可以看到大于95%的細(xì)胞都是帶有熒光的。10、將細(xì)胞送回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2天（36-48小時）。

28、在這個過程中，細(xì)胞會逐漸融合形成多核體，大多數(shù)的細(xì)胞依然貼壁。11、收集所有的上清，分裝到50ml離心管中。12、4，500g離心10分鐘，除去脫落的細(xì)胞和大的細(xì)胞碎片。13、總的上清約為204 ml，用250-ml 0.45 m PVDF過濾裝置過濾。如果發(fā)現(xiàn)濾膜被堵住，表現(xiàn)為過濾速度變慢，更換新的濾器。 慢病毒的濃縮與純化方法一：超速離心沉淀法1、取6個Ultra-clear SW28離心管，用70%乙醇消毒后，放在超凈工作臺中打開紫外燈繼續(xù)消毒30分鐘。2、每個Ultra-clear SW28離心管中加入約32ml的預(yù)先處理的病毒上清液。3、取一支10ml的移液管，吸取12 m

29、l 20%的蔗糖溶液。將移液管一直插入到離心管的底部，緩慢將蔗糖溶液打出4 ml。同樣地，將剩下8 ml的蔗糖溶液分別加入到另兩個離心管中。另取一支干凈的移液管，對剩下3管進(jìn)行同樣處理。4、用PBS調(diào)整各管的重量，使對應(yīng)的離心管之間的重量相差不超過0.1g。5、按次序?qū)⑺?個離心管放入Beckman SW28 超速離心轉(zhuǎn)頭中。6、小心將管子從轉(zhuǎn)頭中取出。倒掉上清，將離心管倒扣在紙巾上放置10分鐘使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底應(yīng)當(dāng)有可見的沉淀。7、每管中加入100ml 不含鈣和鎂的PBS洗下沉淀。8、將SW28超速離心管插入到50ml錐底離心管中，蓋上蓋子。9、在

30、4溶解2小時，每隔20分鐘輕輕震蕩。10、4，500g離心1分鐘，使溶液集中于管底。11、用200l 移液器輕柔吹打使沉淀重懸。避免產(chǎn)生泡沫。將所有管中的液體集中到一個SW28離心管中。12、集中后的病毒懸液分裝成50l 每份，保存在成品管中。用碎干冰速凍后儲存在-80 。 方法二 PEG-8000濃縮法5X PEG8000+NaCl配制稱取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q純水中；121攝氏度 30min 濕熱滅絕 30min；保存在4。1、使用0.45m濾頭過濾慢病毒上清液

31、；2、每2030min混合一次，共進(jìn)行3-5次；3、4度放置過夜；4、4度，4000 g，離心 20min；5、吸棄上清，靜置管子12分鐘，吸走殘余液體；6、加入適量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；7、集中后的病毒懸液分裝成50 l每份，保存在成品管中。用碎干冰速凍后儲存在-80  病毒滴度的測定稀釋計(jì)數(shù)法滴度單位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù)?！盩U”為”transducing units”的縮寫，中文為“轉(zhuǎn)導(dǎo)單位”，表示可以感染并進(jìn)入到靶細(xì)胞中的病毒基因組數(shù)。第一天細(xì)胞準(zhǔn)備將生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至1×105/ml，加入

32、96孔板，100l/孔，為每個病毒準(zhǔn)備10個孔。放入37，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天加病毒在EP管中做10倍梯度稀釋，連續(xù)10個稀釋度。稀釋方法如下：每種病毒準(zhǔn)備10個1.5ml EP管，每管加入90l培養(yǎng)液，往第一個管中加入10l病毒原液，混勻后，吸取10l加入第二個管混勻。依此類推，做十個稀釋度（1010-8）。吸取96孔板中原有的培養(yǎng)基，加入含稀釋好的病毒液。并做好標(biāo)記。第三天追加培養(yǎng)液在每個孔再加入100l完全培養(yǎng)液，利于細(xì)胞的生長。第五天觀察結(jié)果并計(jì)算滴度在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，并數(shù)出最后兩個有熒光的熒光細(xì)胞克隆數(shù)。假設(shè)為X和Y，則滴度（TU/ml）=（X+Y*10）*1000/

33、2/X孔的病毒液的含量（l）。 定量PCR法病毒感染1天前，取6孔板接種HOS細(xì)胞，每孔細(xì)胞為5×104個。接種細(xì)胞24小時后，取兩個孔的細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，確定感染時細(xì)胞的實(shí)際數(shù)目，記為N。棄去其他培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，更換為含有5g/ml polybrene的新鮮培養(yǎng)基。將濃縮病毒用培養(yǎng)基稀釋200倍，也就是取1l病毒加入到199l的培養(yǎng)基中。在3個培養(yǎng)孔中分別加入0.5l，5l和50l的稀釋病毒。感染開始后20小時，除去培養(yǎng)上清，換為500l含DNaseI (Takara Mirus Bio，終濃度為10 U/ml)的新鮮培養(yǎng)基。在37消化15分鐘，這一步是要除去殘余的

34、質(zhì)粒DNA。然后換為2ml正常的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。用0.5ml 0.25%胰酶-EDTA溶液消化細(xì)胞，在37放置1分鐘。用培養(yǎng)基吹洗下，離心收集細(xì)胞。按照DNeasy試劑盒的說明抽提基因組DNA。每個樣品管中加入200l洗脫液洗下DNA。用DNA定量試劑盒定量（Bio-Rad）?；蚪MDNA可以穩(wěn)定保存在-20至少2個月。準(zhǔn)備PCR所需的試劑和樣品。為病毒序列檢測引物配總管：2× TaqMan Master Mix25 l × nForward primer (100 pmol ml-1)0.1l × nReverse primer (100 pmol m

35、l-1)0.1l × nProbe (100 pmol ml-1)0.1l × nH2O19.7l × nn = number of reactions. 例如：總反應(yīng)數(shù)為40，將1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，4l forward primer，4l reverse primer，4l probe 和788l H2O混和。震蕩后放在冰上。為人基因組序列檢測引物配總管：2× TaqMan Master Mix25 l × n10×RNaseP primer/p

36、robe mix2.5 l × nH2O17.5l × nn = number of reactions. 例如：總反應(yīng)數(shù)為40，將1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，100l 10×RNaseP primer/probe mix和700l H2O混和。震蕩后放在冰上。在預(yù)冷的96孔PCR板上完成PCR體系建立。從總管中各取45l加入到A-D各行的孔中，從總管中各取45l加入到E-G各行的孔中。分別取5l質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品基因組DNA加入到A-D行中，每個樣品重復(fù)1次。另留1個孔加入5l的水做為無模板

37、對照（no-template control）。分別取5l基因組標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品基因組DNA加入到E-G行中，每個樣品重復(fù)1次。另留1個孔加入5l的水做為無模板對照（no-template control）。所使用定量PCR儀為ABI PRISM 7000定量系統(tǒng)。循環(huán)條件設(shè)定為： 50 2分鐘，95 10分鐘，然后是95 15秒，60 1分鐘的40個循環(huán)。數(shù)據(jù)分析：測得的DNA樣品中整合的慢病毒載體拷貝數(shù)用基因組數(shù)加以標(biāo)定，得到每基因組整合的病毒拷貝數(shù)。滴度（integration units per ml，IU ml-1）的計(jì)算公式如下：IU ml-1 = (C ×N&

38、#215; D×1000)/V其中： C = 平均每基因組整合的病毒拷貝數(shù) N = 感染時細(xì)胞的數(shù)目（約為1×105） D = 病毒載體的稀釋倍數(shù) V = 加入的稀釋病毒的體積數(shù) 慢病毒的儲存與稀釋慢病毒的儲存1、病毒的運(yùn)輸采用干冰保溫，收到病毒液后若幾天內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)，可于4保存（于一周內(nèi)用完）。2、若病毒量較大，需長期保存。則根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)用量分裝后放于-80冰箱。一般病毒可以放于-80約12個月以上，但若超過6個月后使用，請重新檢測病毒滴度。3、避免反復(fù)凍融，否則會降低病毒滴度。每次凍

39、融會降低病毒滴度10%。 慢病毒的稀釋需要稀釋病毒時，將病毒取出后置于冰上融解，用細(xì)胞培養(yǎng)用D-Hank's、PBS或培養(yǎng)基稀釋到所需濃度后混勻分裝后4保存，并盡快用于實(shí)驗(yàn)（于一周內(nèi)用完）。 慢病毒在細(xì)胞水平的使用什么是MOI？“MOI”為”multiplicity of infection”的縮寫，中文為“感染復(fù)數(shù)”或“復(fù)感染指數(shù)”，含義為感染時病毒和細(xì)胞數(shù)量的比值，即平均每個細(xì)胞感染的病毒活性單位數(shù)（TU number /cell）。在實(shí)驗(yàn)中將某種細(xì)胞感染達(dá)到80%時的MOI定義為這種細(xì)胞的MOI。MOI與整合事件以及目的基因的表達(dá)相關(guān)。一定范圍內(nèi)，表達(dá)水平和M

40、OI呈正相關(guān)。MOI取決于多種因素，如細(xì)胞狀態(tài)，目的基因的大小與性質(zhì)，細(xì)胞的感染效率等。所以，實(shí)驗(yàn)前需查閱相關(guān)文獻(xiàn)，確定慢病毒對目的細(xì)胞的親嗜性、MOI以及在體（in vivo）注射所需病毒量。若無文獻(xiàn)支持，可以通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得到合適的MOI。實(shí)際上，即使有文獻(xiàn)支持，但由于所用細(xì)胞代數(shù)、細(xì)胞狀態(tài)以及目的基因的差異，實(shí)際的MOI和文獻(xiàn)報(bào)道也會不同，所以要安排預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定所需MOI以及病毒對細(xì)胞生長的影響。 目的細(xì)胞感染預(yù)實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)體系的放大實(shí)驗(yàn)?zāi)康模捍_定細(xì)胞感染所需的MOI，以及是否需要添加感染增強(qiáng)劑Polybrene。實(shí)驗(yàn)材料：96孔板，1.5ml EP管，長勢良好的目的細(xì)胞一瓶，已知滴度的慢病毒溶液，Polybrene（10mg/ml），目的細(xì)胞培養(yǎng)基等。第一天：細(xì)胞準(zhǔn)備將長勢良好的目的細(xì)胞接種到96板，消化好細(xì)胞（懸浮細(xì)胞不需要消化，直接離心收集細(xì)胞后加新鮮培養(yǎng)基重懸即可）后把濃度調(diào)為3×1045×104個/m