



下載本文檔
版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、1.引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。最好位于編碼區(qū)5端的300-400bp區(qū)域 內(nèi),可以用DNAman,Alignment軟件看看結(jié)果。2.產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)(自由能小于58.61KJ/mol)。3.引物長(zhǎng)度一般在17-25堿基之間,上下游引物不能相差太大。4. G+C含量在40%60%之間,45-55%最正確。5.堿基要隨機(jī)分布,盡量均勻。6.引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。7.引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。8.引物5端可以修飾。9.3端不可修飾,而且要避開ATGC rich的區(qū)域,避開T/C,A/G連續(xù)結(jié)構(gòu)(2-3個(gè))。10.引物3端要避開密碼子的第3位。11.引物整體設(shè)
2、計(jì)自由能分布5端大于3端,且3端自由能最好小于9KJ/mol??捎胦ligo 6軟件進(jìn)行比對(duì)看結(jié)果的情況。12.做熒光定量產(chǎn)物長(zhǎng)度80-150bp最好,最長(zhǎng)是300bp.13.引物設(shè)計(jì)防止DNA污染,最好跨外顯子接頭區(qū)。14.引物與非特異性擴(kuò)增序列的同源性最好小于70%或者有8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。15.查看有無假基因的存在。假基因就是無功能的DNA序列,與需要擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度相似。16. TM值在58-62度之間。17.引物設(shè)計(jì)的軟件Primer 5.0有專門針對(duì)熒光的。設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡:擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率。引物分析軟件將試圖通過使用每一引物設(shè)計(jì)變化的預(yù)定值在這兩個(gè)目標(biāo)間取得平
3、衡。設(shè)計(jì)引用有一些需要注意的根本原理:1引物長(zhǎng)度一般引物長(zhǎng)度為 1830 堿基??偟恼f來,決定引物退火溫度( Tm 值)最重要的因素就是引物的長(zhǎng)度。有 以下公式可以用于粗略計(jì)算引物的退火溫度。在引物長(zhǎng)度小于 20bp 時(shí):4(G+C)+2(A+T)-5 C在引物長(zhǎng)度大于 20bp 時(shí):62.3C +0.41 C (%G-C)-500/length-5 C另外有許多軟件也可以對(duì)退火溫度進(jìn)行計(jì)算,其計(jì)算原理會(huì)各有不同,因此有時(shí)計(jì)算出的數(shù)值可能會(huì)有少量差距。為了優(yōu)化 PCR 反響,使用確保退火溫度不低于54 C 的最短的引物可獲得最好的效率和特異性??偟恼f來,每增加一個(gè)核昔酸引物特異性提高4 倍,這
4、樣,大多數(shù)應(yīng)用的最短引物長(zhǎng)度為18 個(gè)核音酸。引物長(zhǎng)度的上限并不很重要,主要與反響效率有關(guān)。由于嫡的原因,引物越長(zhǎng),它退火結(jié)合到靶DNA 上形成供 DNA 聚合酶結(jié)合的穩(wěn)定雙鏈模板的速率越小。2GC 含量一般引物序列中 G+C 含量一般為 40%60%, 一對(duì)引物的 GC 含量和 Tm 值應(yīng)該協(xié)調(diào)。假設(shè)是引物存在嚴(yán)重的 GC 傾向或 AT傾向那么可以在引物 5端加適量的 A、T 或 G、C 尾巴。3退火溫度退火溫度需要比解鏈溫度低 5C,如果引物堿基數(shù)較少,可以適當(dāng)提高退火溫度,這樣可以使PCR 的特異性增加;如果堿基數(shù)較多,那么可以適當(dāng)減低退火溫度, 是 DNA 雙鏈結(jié)合。一對(duì)引物的退火溫度
5、相差 4C 6C 不會(huì)影響 PCR 的產(chǎn)率,但是理想情況下一對(duì)引物的退火溫度是一樣的,可以在55C75 C 間變化。4防止擴(kuò)增模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測(cè)估計(jì)目的片段的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu),有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)說明,待擴(kuò)區(qū)域自由能AG小于 58.6lkJ/mol 時(shí),擴(kuò)增往往不能成功。假設(shè)不能避開這一區(qū)域時(shí),用 7-deaza-2-脫氧 GTP 取代 dGTP 對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。5與靶 DNA 的錯(cuò)配當(dāng)被擴(kuò)增的靶 DNA 序列較大的時(shí)候,一個(gè)引物就有可能與靶 DNA 的多個(gè)地方結(jié)合,造成結(jié)果中有多個(gè)條帶出現(xiàn)。這個(gè)時(shí)候有必要先使用BLAST
6、軟件進(jìn)行檢測(cè),://BLAST/。選擇Align two sequences (bl2seq), 如下列圖BLAST 的使用方法也十分簡(jiǎn)單, 如下列圖所示將引物序列粘貼到 1 區(qū),將靶 DNA 序列粘貼到 2區(qū),這兩者可以互換的,并且 BLAST 會(huì)計(jì)算互補(bǔ)、反義鏈等多種可能,所以不需要用戶注意兩條鏈?zhǔn)欠穸际怯辛x鏈。如果知道序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中的 GI 號(hào)也可以直接輸入 GI號(hào),這樣就不用粘貼一大段的序列了。最后在 3 處點(diǎn)擊 Align 就可以查看引物在靶 DNA 中是否有多個(gè)同源位點(diǎn)了??墒鞘褂?BLAST 還是有其不方便的地方。因?yàn)樗淮沃荒鼙葦M兩條序列,那么一
7、對(duì)引物就需要分開進(jìn)行比對(duì)。如果存在錯(cuò)配,還需要自己計(jì)算由于錯(cuò)配形成的片段長(zhǎng)度有多大。在下一篇中將介紹一個(gè)軟件,可 以直接將靶DNA 和引物輸入對(duì)產(chǎn)物片段進(jìn)行預(yù)測(cè)。6引物末端引物 3端是延伸開始的地方,因此要防止錯(cuò)配就從這里開始。3端不應(yīng)超過 3 個(gè)連續(xù)的 G 或 C,因這樣會(huì)使引物在 G+C 富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。3端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能,除在特殊的PCR (AS-PCR)反響中,引物 3端不能發(fā)生錯(cuò)配。如擴(kuò)增編碼區(qū)域,引物3端不要終止于密碼子的第 3 位,因密碼子的第3 位易發(fā)生簡(jiǎn)并,會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。7引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,否那么引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu),這
8、種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。假設(shè)用人工判斷,引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。兩引物之間不應(yīng)該存在互補(bǔ)性,尤應(yīng)防止 3端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一般情況下,一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。8為了下一步操作而產(chǎn)生的不完全匹配5端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大,因此,可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物 5端修飾包括:加酶切位點(diǎn);標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白質(zhì)結(jié)合 DNA 序列;引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。額外的堿基或多或少會(huì)影響擴(kuò)增的效率,還加大引物二聚體形成的幾率,但是為 了下一步的操作就要作出適當(dāng)?shù)臓奚?。很多時(shí)
9、候 PCR 只是初步克隆,之后我們還需要將目的片段亞克隆到各種載體上,那么就需要在PCR 這個(gè)步驟為下一步的操作設(shè)計(jì)額外的堿基。以下總結(jié)一些為了亞克隆所要設(shè)計(jì)的序列。a添加限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn) 添加酶切位點(diǎn)是將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行亞克隆使用得最多的手段。一般酶切位點(diǎn)是六個(gè)堿基,另外在酶切位點(diǎn)的5端還需要加 23 個(gè)保護(hù)堿基。但是不同的酶需要的保護(hù)堿基數(shù)目是不相同的,例如:Sal I 不需要保護(hù)堿基,EcoRV 需要 1個(gè),Not I 需要 2 個(gè),Hind 山 3 個(gè)。其中,在原核表達(dá)設(shè)計(jì)引物時(shí)還有一些小技巧,大 家可以參考:原核表達(dá)之實(shí)驗(yàn)前的分析?。里面一些規(guī)那么是所有表達(dá)都通用的。有一種做法
10、是在進(jìn)行 PCR 反響的同時(shí)進(jìn)行酶切,這樣就需要注意一些內(nèi)切酶在 PCR 反響中的酶切反響率, 見附錄。不過這種方法雖然方便但并不推薦。有時(shí)候,就是把PCR 產(chǎn)物回收后酶切再與載體連接效果都不盡理想,同步進(jìn)行會(huì)使出現(xiàn)問題的原因變得更加復(fù)雜。一旦出現(xiàn)問題,分析起來更麻煩。b LIC 添加尾巴LIC 的全稱是 Ligation-Independent cloning,它是 Navogen 公司專門為其局部的 pET 載體而創(chuàng)造的一種克隆 方法。用LIC 法制備的 pET 載體有不互補(bǔ)的 12 15 堿基單鏈粘端, 與目的插入片段上相應(yīng)粘端互補(bǔ)。 擴(kuò) 增目的插入片段的引物 5序列要與 LIC 載體互
11、補(bǔ)。T4 DNA 聚合酶的 3 5外切活性經(jīng)短時(shí)間即可在插入 片段上形成單鏈粘端。由于只能由制備好的插入片段和載體互相退火形成產(chǎn)物,這種方法非常快速高效, 而且為定向克隆。c定向 TA 克隆添加尾巴在 T 載體剛出的時(shí)候大家都拍手稱贊,真是方便,哪個(gè)小子腦子這么聰明想出來的。但是后來人們發(fā)現(xiàn)TA 克隆無法將片段定向克隆到載體中,所以后來Invitrogen 推出了可以定向克隆的載體,它的一端含有四個(gè)突出的堿基 GTGG。因此在 PCR 引物設(shè)計(jì)時(shí)也要相應(yīng)的加上與之互補(bǔ)的序列,這樣片段就可以有方向了。d In-Fusion 克隆方法這項(xiàng)技術(shù)是 Clontech 還屬于 BD 的時(shí)候推出的。此技術(shù)就其步驟來說是及其方便的,不需連接酶,不需長(zhǎng) 時(shí)間的反響。只要在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候引入一段線性化載體兩端的序列,然后將PCR 產(chǎn)物和線性化的載體加入到含有 BSA 的 In-Fusion 酶溶液中,在室溫下放置半個(gè)小時(shí)就可以進(jìn)行轉(zhuǎn)化了。這種方法特別適合大批 量的轉(zhuǎn)化。如果要參加額外的堿基總是或
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫(kù)網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 寧波諾丁漢大學(xué)《白描花卉臨摹與寫生》2023-2024學(xué)年第一學(xué)期期末試卷
- 網(wǎng)頁(yè)設(shè)計(jì)與制作項(xiàng)目式教程(HTML CSS)(慕課版)-習(xí)題及答案 項(xiàng)目四
- 山東省昌樂縣第二中學(xué)2025年高三物理試題查缺補(bǔ)漏試題(文理)含解析
- 內(nèi)蒙古大學(xué)創(chuàng)業(yè)學(xué)院《口腔頜面部解剖》2023-2024學(xué)年第二學(xué)期期末試卷
- 2025年中考語文熱點(diǎn)寫作素材積累:澳門回歸之盛世蓮花譜寫“一國(guó)兩制”新篇章
- 2023年上海高考語文試卷(含答案)
- 基礎(chǔ)梁架空施工方案
- 橡膠制品施工方案
- 2025年四愛屬性測(cè)試題及答案
- 5年級(jí)下冊(cè)英語外研版第一模塊課文
- 研究生面試復(fù)試英語+常問問題
- 安徽省教育科學(xué)研究項(xiàng)目課題申請(qǐng)書【模板】
- 數(shù)學(xué)名詞中英文對(duì)照
- 幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎.
- 線束加工工時(shí)對(duì)照表
- 一年級(jí)古詩(shī)新唱社團(tuán)計(jì)劃
- 關(guān)于超細(xì)碳酸鈣粉體的干法表面改性分析
- 中考數(shù)學(xué)復(fù)習(xí)經(jīng)驗(yàn)交流PPT課件
- 美國(guó)簽證在職證明中英文模板.doc
- 患者約束技術(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
- MC7000其它檢驗(yàn)方法RCCM中文版法國(guó)民用核電標(biāo)準(zhǔn)
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論