試驗(yàn)四動(dòng)物細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

1、 實(shí)驗(yàn)四 動(dòng)物細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?(1) 了解動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的根本知識(shí)。 (2) 了解體外培養(yǎng)細(xì)胞的的根本形態(tài)類(lèi)型；學(xué)會(huì)通過(guò)鏡檢判定體外細(xì)胞生長(zhǎng)的 狀態(tài)。 (3) 掌握動(dòng)物細(xì)胞的傳代培養(yǎng)法。 2. 實(shí)驗(yàn)背景與原理 2.1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的根本概念 (1) 組織培養(yǎng)：把來(lái)自機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞、組織或器官放在類(lèi)似于體內(nèi)的外環(huán)境中， 使之成活、生長(zhǎng)和繁殖。嚴(yán)格乂分為細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng)。值得注意 的是和植物組織培養(yǎng)不同,目前動(dòng)物組織培養(yǎng)在一般培養(yǎng)條件下難以維持組織的 結(jié)構(gòu)和功能，常最終轉(zhuǎn)變成為細(xì)胞培養(yǎng)，所以動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)并無(wú)嚴(yán)格區(qū)別。 (2) 原代培養(yǎng)：直接從供體取來(lái)的細(xì)胞，組織或器官進(jìn)

2、行的初次培養(yǎng)。通常把 第一代至第十代以?xún)?nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱(chēng)為原代細(xì)胞培養(yǎng)。 (3) 傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)物長(zhǎng)成單層細(xì)胞，到達(dá)一定密度時(shí)，營(yíng)養(yǎng)消耗殆盡， 需要補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，分開(kāi)擴(kuò)大培養(yǎng)，使之繼續(xù)增殖。注意的是傳代的這個(gè)“代與細(xì) 胞分裂的一個(gè)世代不同，一代細(xì)胞約分裂 35次，不要混淆。 (4) 細(xì)胞系：原代培養(yǎng)后的細(xì)胞經(jīng)傳代即可成為細(xì)胞系。假設(shè)其形態(tài)均一，生長(zhǎng) 增殖穩(wěn)定，生物性狀明確，即可稱(chēng)之為已鑒定的細(xì)胞(Certified Cell$。不同種類(lèi) 的細(xì)胞成系的難易程度也不同，一般胚胎、更新組織的細(xì)胞如造血、上皮等以及 癌細(xì) 胞較容易成系,而神經(jīng)等細(xì)胞那么較難成系。按照其生存期可分為有限細(xì)胞系 生存期有限的

3、正常二倍體細(xì)胞 和無(wú)限細(xì)胞系生存期無(wú)限的癌細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì) 胞等，大多異倍體 2.2動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的根本條件 體外培養(yǎng)細(xì)胞的條件總原那么就是要盡可能模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的環(huán)境， 因此 必要的營(yíng)養(yǎng)、適宜的胞外環(huán)境以及嚴(yán)格的無(wú)菌條件是主要的三個(gè)方面。 1 營(yíng)養(yǎng)：早期培養(yǎng)主要采用天然的生物性液體，但其成分不確定，難以控制 營(yíng)養(yǎng)成分?，F(xiàn)廣泛使用的是化學(xué)成清楚確的各種商品化的合成培養(yǎng)基， 其主要成 分包括各種氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽、葡萄糖等必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)基中還含 有酚紅指示劑，使培養(yǎng)基的顏色可顯示細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。 隨著細(xì)胞數(shù)目的增長(zhǎng)，酸 性代謝物增多，培養(yǎng)基變黃。污染的培養(yǎng)物也會(huì)使培養(yǎng)基迅速變黃。 培養(yǎng)基在

4、使用前還要加血活，它的主要作用有三點(diǎn)：一是提供生長(zhǎng)因子、激 素、酶等營(yíng)養(yǎng)；二是中和有蠹物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞起著保護(hù)作用，尤其可中和培養(yǎng)中使 用的胰蛋白酶的蠹性。第三是提供黏附和伸展因子，是貼壁細(xì)胞附壁生長(zhǎng)所必不 可少的。所以，血活的品質(zhì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有很大影響， 通常換用新的批次的血活 要預(yù)先進(jìn)行血活的篩選實(shí)驗(yàn)。一般進(jìn)口的胎牛血活更有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，但價(jià)格 較昂貴，可根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的要求選用。另外，有些細(xì)胞培養(yǎng)中還需要添加谷氨酰 胺Gln。 2 胞外環(huán)境條件：主要是溫度、氣體和 pH條件。這些胞外環(huán)境條件應(yīng)該符 合細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境。哺乳動(dòng)物適宜的培養(yǎng)溫度是 37 C，鳥(niǎo)類(lèi)是39 C,爬 行類(lèi)是2225

5、C等；大多動(dòng)物細(xì)胞適宜的 pH條 件 都 是 7.27.4,以 不 超 過(guò) pH6.87.6為宜。在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中隨著代謝產(chǎn)物的積累，酸性產(chǎn)物增多, 培養(yǎng)基的pH會(huì)下降。因此實(shí)驗(yàn)室通常使用 CO2氣體體積占5%的空氣作為細(xì)胞 培養(yǎng)的氣體 條件，以使 CO2溶解在溶液中形成NaHCOs和H2CO3的緩沖體系， 維持pH的穩(wěn)定。另外，培養(yǎng)基中參加 HEPES (羥乙基哌嗪乙烷磺酸)可更有 效的維持體系的pH。 (3) 無(wú)菌：組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素之一就是要防止污染，要樹(shù)立無(wú)菌操作觀(guān) 念，從實(shí)驗(yàn)用品、培養(yǎng)基和試劑、操作環(huán)境的滅菌消蠹到超凈臺(tái)下的實(shí)驗(yàn)操作， 每一步都應(yīng)該嚴(yán)謹(jǐn)標(biāo)準(zhǔn)。 2.3培養(yǎng)細(xì)胞的

6、形態(tài) 倒谿顯微鏡：培養(yǎng)細(xì)胞用倒谿顯微鏡觀(guān)察。倒谿顯微鏡(inverted microscope 組成和普通顯微鏡一樣,只不過(guò)物鏡與照明系統(tǒng)在載物臺(tái)之下。倒谿顯微鏡優(yōu)點(diǎn) 為物鏡與目鏡之間工作距離較長(zhǎng)，可直接將培養(yǎng)血,培養(yǎng)瓶等谿顯微鏡操作臺(tái)上 進(jìn)行觀(guān)察或顯微注射等工作，這樣物鏡可以很接近樣品而不會(huì)受樣品厚度的限 制。通常具有相差物鏡。 (2)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)：體外培養(yǎng)細(xì)胞絕大多數(shù)都是貼壁生長(zhǎng)的。在培養(yǎng)中大 局部細(xì)胞都經(jīng)歷由最初脫離機(jī)體或瓶壁的立體球形到最終的具有突起的延展細(xì) 胞所形成平面單層的形態(tài)變化過(guò)程。 細(xì)胞分裂增殖時(shí)同樣也經(jīng)歷此變化過(guò)程， 才 能附壁繼續(xù)生長(zhǎng) 培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)變化示意圖 健康

7、的體外培養(yǎng)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)胞折光性好， 透明；胞質(zhì)中顆粒少；細(xì)胞形 態(tài) 完整，飽滿(mǎn)；伸展性好。當(dāng)細(xì)胞剛剛污染時(shí)，會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)不飽滿(mǎn)，細(xì)胞反 差變大，胞質(zhì)中顆粒變多，細(xì)胞延展性差。隨著污染的加重，貼壁細(xì)胞脫落，培 養(yǎng)基中雜質(zhì)多，培養(yǎng)液很快變黃，且混濁。當(dāng)細(xì)胞因未及時(shí)傳代而缺乏營(yíng)養(yǎng)時(shí)， 細(xì)胞也會(huì)“變瘦，變圓脫落增多，培養(yǎng)液變黃。 (3)體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)類(lèi)型：細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)由丁培養(yǎng)條件比擬單一穩(wěn)定， 缺乏體內(nèi)的生理調(diào)節(jié)和動(dòng)態(tài)平衡，細(xì)胞常失去原有組織細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)， 趨丁單 一性，出現(xiàn)“返祖現(xiàn)象。根據(jù)它們是否貼附丁支持物生長(zhǎng)的特征， 可分為貼附 型生長(zhǎng)和懸浮型生長(zhǎng)兩大類(lèi)。而貼壁生長(zhǎng)乂主要分為成纖維

8、樣， 上皮樣，多形樣 等。成纖維樣細(xì)胞形態(tài)與體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)相似， 細(xì)胞在支持物外表呈梭形 或不規(guī)那么三角形生長(zhǎng)。除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層問(wèn)質(zhì)起源的組織細(xì)胞 也呈本類(lèi)形態(tài)生長(zhǎng)。上皮樣細(xì)胞具有扁平不規(guī)那么多角形特征，細(xì)胞緊密相連單層 膜樣生長(zhǎng)。起源丁內(nèi)、外胚層細(xì)胞如皮膚、表皮衍生物、消化管上皮等組織細(xì)胞 培養(yǎng)時(shí)，皆呈上皮型形態(tài)生長(zhǎng)。懸浮樣細(xì)胞主要是血液或淋巴液中的懸浮生長(zhǎng)的 細(xì)胞類(lèi)型 2.4細(xì)胞傳代培養(yǎng)的一般方法 以單層細(xì)胞方式生長(zhǎng)的細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)和黏蛋白以附著于生長(zhǎng)外表。 不 但不同的細(xì)胞系附著于外表的黏附程度有差異，不同狀態(tài)的細(xì)胞這種黏附也有差 異。比方衰老的二倍體細(xì)胞通常比

9、年輕的二倍體細(xì)胞黏附得更牢固。 絕大多數(shù)的 貼壁細(xì)胞需要用胰蛋白酶優(yōu)先催化堿性氨基酸與鄰近氨基酸毯基問(wèn)的肽鍵水解， 從而分解粘蛋白、糖蛋白，使細(xì)胞脫壁；有些細(xì)胞系貼壁不強(qiáng)，只要用吸管吹打 即可使細(xì)胞脫落分散，而不需要使用胰蛋白酶；還有些細(xì)胞貼壁能力很強(qiáng)需要使 用其他的蛋白酶，比方彈性蛋白酶、鏈霉素的酶等。為保障胰蛋白酶的最正確活性， 在進(jìn)行胰蛋白酶處理前應(yīng)去除血活、Ca2+及Mg2+離子。值得注意的是過(guò)度的胰蛋 白酶處理可導(dǎo)致細(xì) 胞的裂解和活力的喪失。 懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞的傳代一般只需簡(jiǎn)單的稀釋操作即可。 假設(shè)需完全更換培養(yǎng)液只 需要離心收集細(xì)胞后傳代即可。 3. 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 (1) 材料：MC

10、F-7細(xì)胞。 (2) 設(shè)備與用品：倒谿顯微鏡，CO2培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，高壓滅菌鍋，過(guò)濾 器及0.22vni的水相濾膜，細(xì)胞培養(yǎng)瓶，移液管，吸管，小試管，灑精燈，試管 架等。 (3) 藥品與試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基；小牛血活； 0.25%胰蛋白酶(w/v, PBS 緩沖液或D-Hanks緩沖液配制，pH7.4)。 強(qiáng)酸洗液的配制：先用約200mL蒸僻水充分加熱溶解重銘酸鉀 63克，再緩 緩參加1L濃硫酸并不斷攪拌，充分混合溶解。洗液腐蝕性較強(qiáng)，操作時(shí)注意做 好各方面的防護(hù)，并且動(dòng)作要輕柔，注意平安。當(dāng)洗液的顏色由棕紅色變?yōu)榫G色 時(shí)說(shuō)明已經(jīng)失效，需重新配制。 4. 實(shí)驗(yàn)方法與步驟 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

11、：體外培養(yǎng)細(xì)胞的觀(guān)察及細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。 (1) 培養(yǎng)基等的配制及實(shí)驗(yàn)用品的活洗與消蠹 配制RPMI-1640培養(yǎng)基及0.25%M蛋白酶(w/v, PBS緩沖液配制pH7.4)溶 液，并過(guò)濾除菌后培養(yǎng)驗(yàn)菌。活洗，包裝并周壓火菌細(xì)胞培養(yǎng)的玻璃用品等。細(xì) 胞培養(yǎng)的玻璃器也等進(jìn)行初步活洗后要用強(qiáng)酸洗液浸泡過(guò)夜，然后用蒸僻水徹底 沖洗十凈；進(jìn)行濕熱滅菌時(shí)一般需至少滅菌 40分鐘；培養(yǎng)過(guò)污染細(xì)胞的培養(yǎng)瓶 那么最好加上用煤酚皂溶液浸泡過(guò)夜的步驟； 移液管和吸管在包裝前要在其管口用 細(xì)絲或鑲子塞上少許棉花，長(zhǎng)約11.5cm，松緊要適宜。 (2) 動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀(guān)察 倒谿顯微鏡下觀(guān)察培養(yǎng)細(xì)胞的長(zhǎng)勢(shì)及密度，根

12、據(jù)細(xì)胞密度決定傳代的稀釋倍 數(shù)。同時(shí)可比照觀(guān)察教師事先準(zhǔn)備的污染細(xì)胞、死亡細(xì)胞，并對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的密度 有一定感性的認(rèn)識(shí)。 (3) 消化：倒掉舊培養(yǎng)基，加幾滴胰酶潤(rùn)洗一下，立即倒掉，再加適量胰酶消 化12分鐘左右，可鏡下觀(guān)察待細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞問(wèn)空隙變大時(shí)立即停止消化。 (4) 懸浮細(xì)胞：沿著培養(yǎng)瓶無(wú)細(xì)胞的一面倒掉胰酶，加適量培養(yǎng)基，用吸管充 分吹打后，鏡下觀(guān)察是否還有貼壁細(xì)胞。 (5) 分裝：一般以1: 2或1: 3進(jìn)行分裝，即一瓶細(xì)胞可傳為 23瓶。向分裝 好的各瓶細(xì)胞中再參加適量的含 10% (v/v)血活的RMBI-1640培養(yǎng)液。 (6) 擰上蓋子(勿擰緊)，做好標(biāo)記，將培養(yǎng)瓶平放于培養(yǎng)箱中，于37 C, 5%CO2 下培養(yǎng)。 5. 實(shí)驗(yàn)考前須知 (1) 要保證實(shí)驗(yàn)中的無(wú)菌操作，就必須特別注意一些操作上的細(xì)節(jié)，比方：培 養(yǎng)液等不要過(guò)早開(kāi)瓶；加液時(shí)取液用的移液管、吸管勿碰用過(guò)的培養(yǎng)瓶瓶口 ；要 勤過(guò)火焰，尤其是瓶口 ；手要握在移液器刻度之上的位谿； 超凈臺(tái)中物品的擺放 要合理，盡量防止雙手交義取物；假設(shè)有動(dòng)作失誤，勿存僥幸心理，應(yīng)及時(shí)更換移 液管等。 (2) 對(duì)于貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)胰酶的消化步驟是關(guān)鍵，要注意胰酶消化的時(shí)間 也不能過(guò)長(zhǎng)，否那么不但造成細(xì)胞數(shù)目的損失， 也會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，使細(xì)胞不易 貼壁生長(zhǎng)。 (3) 可根據(jù)細(xì)胞的密度