原代神經(jīng)元培養(yǎng)培訓(xùn)課件

1、精品文檔神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)從動物 (大鼠或小鼠等) 的胚胎或新生動物的腦組織取下某一局部區(qū)域，分離細(xì)胞，培養(yǎng)在 培養(yǎng)容器后不再移植，常稱為原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)。一、培養(yǎng)前準(zhǔn)備1. 器械和器皿器械：外科剪、鑷子、虹膜剪等、小剪刀、細(xì)鑷子和虹膜小刀等 各種金屬器械如解剖器械， 使用后及時刷洗干凈， 用酒精棉球擦拭后晾干， 或經(jīng) 60 烘干， 以防生銹。由于濕熱消毒對手術(shù)器械容易可用 70 80 酒精浸泡 1 小時以上消毒。器皿：1)2)3) 玻璃瓶及相應(yīng)的膠塞或膠木螺旋蓋，用于分裝血清、多聚賴氨酸、解剖液、各種鹽溶液和培養(yǎng)液等。5) 培養(yǎng)瓶、蓋玻片培養(yǎng)用的蓋玻片必須不含鉛、 不發(fā)霉， 可用 0.2N 鹽

2、酸浸泡 10 分鐘， 用蒸餾水洗 2 次， 每次 10 分鐘，然后移入丙酮或乙醇浸泡 10 分鐘，再用雙蒸水洗 2 次，每次 10 分鐘， 烘干待消毒。凡組織學(xué)用過的舊蓋玻片一般不用。6)7) 移液管、吸管、燒杯、離心管和培養(yǎng)皿。8)9) 塑料培養(yǎng)皿( 35mm )、塑料培養(yǎng)板( 6、24 、96 孔)。輔助工具：放置試管、吸管和玻璃瓶等的架子。2. 培養(yǎng)基和培養(yǎng)用液的配制1）培養(yǎng)基質(zhì)：有多聚賴氨酸、牛皮膠原和鼠尾膠原。本室目前常用分子量為 7-140000 多 聚賴氨酸（ Poly-L-lysine ，濃度為 0.1mg/ml 。2）平衡鹽溶液： 主要以無機(jī)鹽和葡萄糖配制而成。 各種平衡鹽溶

3、液主要的不同點(diǎn)在于 NaCl 的濃度、離子濃度及緩沖系統(tǒng)的不同，可根據(jù)實(shí)際需要選用適當(dāng)?shù)钠胶恹}溶液。3）培養(yǎng)液：目前已有現(xiàn)成的干粉出售，按說明書進(jìn)行配制即可。神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)需高糖，培 養(yǎng)液應(yīng)含有或加葡萄糖至 6g/L 。目前培養(yǎng)海馬神經(jīng)元可選用 B27 無血清培養(yǎng)液。4）血清：有胎牛血清、小牛血清和馬血清等。分裝成小瓶，4保存?zhèn)溆茫ǚ盅b前需 56 滅活 30 分鐘）。5）胰蛋白酶溶液：用于分離細(xì)胞。先用少量滅菌三蒸水將胰蛋白酶粉末溶成糊狀，然后補(bǔ)水至 2.5% 濃度，振蕩搖勻， 4過夜，待完全溶解后用濾器過濾滅菌，并分裝成1-2ml 凍存。用前以 D-Hanks 平衡鹽水或其他無鈣鎂離子溶液溶解

4、稀釋至 0.25% 或 0.125% 。實(shí)際 使用溫度一般為 37 20-30 分鐘。6）解剖溶液：由平衡鹽水 （ D1- 無鈣鎂離子的 Puck 氏液）、HEPES 緩沖液和蔗糖葡萄糖 溶液組成稱為 D1-SGH 。D1 平衡鹽水： NaCl 8.0g 、KCl 0.4g 、 Na2HPO4.7H2O 0.045g 、KH2PO4 0.03g 、酚紅0.0012g 、三蒸水 50ml 。蔗糖葡萄糖（ SG ）：蔗糖 7.5g 、葡萄糖 3g 、三蒸水 50ml 。HEPES（ H ， 0.352mM ）：用 25ml 左右的三蒸水溶解 2.35g 的 HEPES 后，用 NaOH 或HCl

5、調(diào) pH 至 7.3-7.4 ，加三蒸水至 28ml 。將 D1 、SG 和 H 三者合在一起并稀釋到 1000ml 即為解剖液， 小瓶分裝成 5ml 后置 4 備 用。二、培養(yǎng)細(xì)胞操作1. 涂培養(yǎng)基一般在細(xì)胞培養(yǎng)前 1-2 天，將使用的塑料培養(yǎng)皿（ 35mm ）、24 孔、 96 孔培養(yǎng)板或消毒的 蓋玻片涂上一層 Poly-L-Llisine ，置于超凈臺中備用。2. 實(shí)驗(yàn)動物準(zhǔn)備動物的年齡和取材部位對培養(yǎng)細(xì)胞的成活率關(guān)系密切， 需根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)而定。 如大鼠海馬細(xì) 胞培養(yǎng)，以 18 天胚胎或新生 48 小時內(nèi)的大鼠為宜，而培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)與脊髓神經(jīng)元以11-13 天胚胎小鼠、大腦皮層以小鼠 1

6、6-21 天、小腦細(xì)胞取自臨產(chǎn)或新生動物。3. 進(jìn)入培養(yǎng)室操作1）穿上消毒衣，戴上口罩和帽子。2）安放消毒的實(shí)驗(yàn)用具，如培養(yǎng)皿、解剖器械、玻璃吸管、培養(yǎng)板等于桌面適當(dāng)?shù)奈恢谩?）將平衡鹽水、解剖溶液、血清、胰蛋白酶等溶液放置于桌面上，同時準(zhǔn)備一個冰袋和污 物盤。4）解剖動物以新生大鼠取海馬組織為例： 將新生大鼠投入 80 的酒精中， 消毒 5-10 分鐘。 用解剖剪斷頭，并移入玻璃器皿中，沿中間骨縫將頭骨剪開（頭骨外側(cè)下沿也剪開） ，然后 剝開頭骨暴露大腦半球， 去腦膜， 沿中線將大腦半球往外翻開， 暴露內(nèi)側(cè)面半月狀的海馬組 織。用彎頭鑷子輕輕夾起，放入解剖液內(nèi)（培養(yǎng)皿可置于冰袋上） 。待數(shù)個

7、動物均解剖后， 將培養(yǎng)皿內(nèi)的海馬組織移至解剖鏡下， 仔細(xì)去除血管、 膜及非海馬結(jié)構(gòu) （取材干凈非常重要） 后，再移至小培養(yǎng)皿中，加數(shù)滴 D1-SGH 液，并用虹膜剪剪碎或用虹膜刀切成小粒。5) 在上述海馬組織加入解剖溶液和 0.25% 胰蛋白酶各 1ml ，搖勻后置于 37 培養(yǎng)箱內(nèi)消 化 25-30 分鐘。6) 將消化好的細(xì)胞碎片移入 2ml 的離心管中， 吸去剩余的胰蛋白酶溶液， 加入含血清的全 培養(yǎng)液 2ml 終止胰酶作用，約 10 分鐘后，再更換一次全培養(yǎng)液以洗凈胰酶。 (全培養(yǎng)液成 份為 80 DMEM 、 10 胎牛血清、 10 馬血清或小牛血清，胎牛血清有助于細(xì)胞貼壁)。7) 用

8、口徑較小的、在火焰上光滑過的玻璃吸管吸取細(xì)胞團(tuán)，移入另一離心管，加入 2ml 培 養(yǎng)液并吹打 20 次。將離心管斜放， 讓細(xì)胞碎片下沉 5-10 分鐘后，吸取上層細(xì)胞溶液約 1ml 。 離心管中再加入培養(yǎng)液 1ml ，同上吹打并吸取細(xì)胞， 與第 1 次吸取的細(xì)胞混合一起后計(jì)數(shù)。8) 按所需的細(xì)胞濃度接種在事先準(zhǔn)備的塑料培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)板中，用蓋玻片則需滴滿。 接種后移入 37 的 5 CO2 培養(yǎng)箱，培養(yǎng) 1 天后可用無血清培養(yǎng)液， 1 星期換液 2 次。三、細(xì)胞識別 根據(jù)細(xì)胞外形及內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行細(xì)胞的識別。 神經(jīng)細(xì)胞具有顯著的特征， 培養(yǎng)中的貼壁的神經(jīng) 元突起很明顯， 特別是樹突由粗而細(xì)，有分

9、支，突起的末端有膨大的生長錐結(jié)構(gòu)， 正在不斷 變化；細(xì)胞體呈圓形、梭形、三角形或多角形不等，胞體較厚，具有空泡狀核，有明顯的核 仁；立體感強(qiáng)，常見“暈” 。培養(yǎng)細(xì)胞中可包括幾種神經(jīng)元的類型和非神經(jīng)元的“背景細(xì)胞” ，即成纖維細(xì)胞、室管膜細(xì) 胞和幾種膠質(zhì)細(xì)胞。成纖維細(xì)胞貼壁最快，呈扁平狀，胞核卵園形，有并列的兩粒小核仁， 從胞體兩端發(fā)出細(xì)長 突起。 膠質(zhì)細(xì)胞貼附在膠原上和成纖維細(xì)胞形成一層“地毯”。神經(jīng)細(xì)胞貼壁較慢， 落在“地毯”上生長遷移和分化。培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞可按一般 Nissl 法染色或免疫細(xì)胞化學(xué)特異性染色加以鑒別。無菌操作注意事項(xiàng)體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力， 所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或

10、失敗的首要條件。 即便使用 設(shè)備完善的實(shí)驗(yàn)室。若實(shí)驗(yàn)者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范?也會導(dǎo)致污染。因而為在一切操作中為最大可能的保證無菌每一項(xiàng)工作都必須做到有條不紊和完全靠?！九囵B(yǎng)前準(zhǔn)備】在開始實(shí)驗(yàn)前要制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點(diǎn)無誤后將其放置操作場所（培養(yǎng)室、超凈臺 ）內(nèi)，然后開始消毒。這可以避免開始實(shí)驗(yàn)后囚物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會。【操作野消毒】無菌培養(yǎng)室每天都要用 0.2% 的新潔爾滅拖洗地面次 （拖布要專用 ）紫外 線照射消毒 30-50min ，超凈工作臺臺面每次實(shí)驗(yàn)前要用75 酒精擦洗。然后紫外線淌毒30min

11、。在工作臺面消毒時切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時照射紫外線， 消毒時工作臺面上 用品不要過多或重疊放置否則會遮擋射線降低消毒效果。些操作用具如移液器、廢液 缸、污物盒、試管架等用 75% 酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。【洗手和著裝】 原則上和外科手術(shù)相同。 平時僅做觀察不做培養(yǎng)操作時， 可穿裝細(xì)胞培養(yǎng)室 內(nèi)紫外線照射 30min 的清潔工作服。在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著 長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75 酒精消毒手。如果實(shí)驗(yàn)過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。 進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、 著 消毒衣帽。【火焰消毒】 在無菌環(huán)境進(jìn)行

12、培養(yǎng)或做其它無菌工作時，首先要點(diǎn)燃酒精燈或煤氣燈。以 后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等， 都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。但要注 意：金屬器械不能在為焰中燒的時間過長， 以防退火， 燒過的金屬鑷要待冷卻后才能挾取組 織，以免造成組織損傷。 吸取過營養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼， 因殘留在吸管頭中營養(yǎng) 液能燒焦形成炭膜， 再用時會把有害物帶入營養(yǎng)液中。開啟、 關(guān)閉長有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶時，火 焰滅菌時間要短。 防止因溫度過高燒死細(xì)胞。 另外膠塞過火焰時也不能時間長， 以免燒焦產(chǎn) 生有毒氣體，危害培養(yǎng)細(xì)胞?！静僮鳌?進(jìn)行培養(yǎng)時，動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機(jī)會。 不能用手

13、觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。為拿取方便， 工作 臺面上的用品要有合理的布局，原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)， 酒精燈置于中央。 工作由始至終要保持一定順序性， 組織或細(xì)胞在未做處理之前， 勿過早暴 露在空氣中。同樣，培養(yǎng)液在未用前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封 閉瓶口直立可增加落菌機(jī)會。吸取營養(yǎng)液、PBS、細(xì)胞懸液及其它各種用液時，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用， 以防擴(kuò)大污染或?qū)е录?xì)胞交叉污染。 工作中不能面向操作野講話或咳嗽， 以免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺面發(fā)生污染。 操作前用酒精擦拭超凈臺面及雙手。 手或 相對較臟的物品不

14、能經(jīng)過開放的瓶口上方， 瓶口最易污染， 加液時如吸管尖碰到瓶口， 則應(yīng) 將吸管丟掉。細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)法是細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的一項(xiàng)基本技術(shù)。 它是了解培養(yǎng)細(xì)胞的生長狀態(tài) 測定培養(yǎng)基、 血 清、藥物等物質(zhì)生物學(xué)作用的重要手段。下面介紹常用的血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法。一、用品(1) 血球計(jì)數(shù)板，巴氏吸管(2) 0.25 胰蛋白酶溶液，無血清培養(yǎng)液(3) 顯微鏡二、步驟(1) 準(zhǔn)備計(jì)數(shù)板：用酒精清潔計(jì)數(shù)板及專用蓋玻片，然后用綢布輕輕拭干。(2) 制備細(xì)胞懸液； 用消化液分散單層培養(yǎng)細(xì)胞或直接收集懸浮培養(yǎng)細(xì)胞， 制成單個細(xì)胞懸 液。本法要求細(xì)胞密度不低于 10000 個細(xì)胞 m1 ，若細(xì)胞數(shù)很少， 應(yīng)將懸液離心 (1000rpm ， 2min) ，重懸浮于少量培養(yǎng)液中。(3) 加樣：用吸管輕吹打細(xì)胞懸液，取少許細(xì)胞懸液，在計(jì)數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)加微量細(xì)胞 懸液，加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡。(4) 計(jì)數(shù)：在顯微鏡下，用 10X 物鏡觀察計(jì)數(shù)板四角大方格中的細(xì)胞數(shù)細(xì)胞壓中線時， 只計(jì)左測和上方者，不計(jì)右側(cè)和下方者。(5) 計(jì)算：將計(jì)算結(jié)果代入下式，得出計(jì)數(shù)結(jié)果： 細(xì)胞數(shù)毫升原液 (4 大格細(xì)胞數(shù)之和 4)X104 細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果