ABA綜述性論文(2)

1、湖南農(nóng)業(yè)大學課程論文學 院：生科院 專業(yè)年級：姓 名： 學 號：課程論文題目：植物激素脫落酸(ABA)課程名稱：植物生長物質(zhì)評閱成績：評閱意見：成績評定教師簽名：日期：2015 年 12 月 27 日植物激素脫落酸(ABA) 摘 要：脫落酸(簡稱ABA)在植物生長發(fā)育過程中有著重要作用,同時也是一種應激激素,能夠抵抗外界環(huán)境脅迫。植物一些發(fā)育過程如種子萌發(fā)、胚胎發(fā)育和果實成熟中,ABA含量會發(fā)生變化。近年來關(guān)于脫落酸在生物合成、代謝和信號轉(zhuǎn)導等方面的研究已取得突破性進展。本文介紹高等植物ABA生物合成途徑, ABA受體的研究, ABA信號轉(zhuǎn)導通路模型的構(gòu)建。關(guān)鍵詞：脫落酸、應激激素、生物合成,

2、、信號轉(zhuǎn)導脫落酸 (abscisic acid, ABA) 是 20 世紀 60 年代在植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的半萜類化合物，在植物生長和響應逆境過程中發(fā)揮著重要作用1。近年來在 ABA合成代謝和信號轉(zhuǎn)導等方面的研究已取得突破性進展。ABA 生物合成和信號調(diào)節(jié)與一些關(guān)鍵酶及轉(zhuǎn)錄因子關(guān)系緊密，如細胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生的 PYR/PYL/RCAR (PYLs) 蛋白作為 ABA 受體，有傳遞ABA 信號的作用.一、生物合成C4O間接途徑是高等植物ABA生物合成的主要途徑,其經(jīng)過聚合、環(huán)化、異構(gòu)化、氧化、裂解等復雜的反應,分為幾個階段(Seo,2002):(l)早期反應:在質(zhì)體內(nèi)類葫蘿卜素前體胡蘿卜素的形成;(2)中期

3、反應:在質(zhì)體內(nèi)由形成玉米黃質(zhì)開始至9一順紫黃質(zhì)裂解的過程;(3)晚期反應:在細胞溶膠內(nèi)黃質(zhì)醛轉(zhuǎn)變成ABA。（1）、早期反應階段 在質(zhì)體內(nèi)MVA是合成五個碳原子PIP的前體。Rhomer等(1999)認為PIP生物合成是在葉綠體中以甲從赤醉糖磷酸(MEP)途徑合成的:以丙酮酸及硫胺素焦磷酸(TPP)為前體,在3一磷酸甘油醛(GAP)參與下由5一磷酸脫氧木酮糖合成酶(DX)s催化形成5一磷酸脫氧木酮糖(DXP),進而在胞彗是磷酸(CTP)參與下形成PIP。也有報道指出PIP的生物合成分別也在細胞溶膠發(fā)生。同位素實驗證實,甲瓦龍酸素(Mevniolni)阻礙MVA合成,但不影響類胡蘿卜素合成。PIP

4、的生物合成可能與MVA途徑無關(guān)。細胞溶質(zhì)生成的PIP通過載體滲人到質(zhì)體內(nèi)。 GGPP由八氫番茄紅素合酶(PSY)催化GGPP形成八氫番茄紅素,這是一個限制步驟。隨后八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)促進八氫番茄紅素轉(zhuǎn)變成胡蘿卜素、番茄紅素和日胡蘿卜素。山于發(fā)育的玉米種子PDSmRNA表達的產(chǎn)物與內(nèi)源ABA水平?jīng)]有直接聯(lián)系,番茄的PSY基因(PSY)I超表達不能引起ABA水平增加,推測類胡蘿卜素的合成速率不會影響ABA的生物合成速率。日前,對DXS在調(diào)節(jié)類胡蘿卜素生物合成的作用引人關(guān)注,令人驚訝的是,DXS的表達也影響著內(nèi)源ABA水平(Est己vezetal,2001),說明ABA生物合成的早期階段,

5、尤其是DXP的形成調(diào)節(jié)ABA生物合成。（2）、中期反應階段 玉米突變體VP2、VP5、VP7、VP9的突變與玉米黃質(zhì)形成相關(guān)。環(huán)氧玉米黃質(zhì)環(huán)化酶(zEP)催化長米黃質(zhì)環(huán)化形成環(huán)氧玉米黃質(zhì)、進步形成全一反式一紫黃質(zhì),這兩步反應是合成ABA的特殊步驟。擬南芥baal和煙草baZa突變體由于損害ZEP而阻礙ABA的生物合成。紫黃質(zhì)及新黃質(zhì)在9一順環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)作川一l氧化裂解,在細胞溶膠形成黃質(zhì)醛。已在植物中至少獲拐了15種與ABA合成有關(guān)的突變體,其中大部分與玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶(ZEP)、9一環(huán)氧順類胡蘿!、素雙力11氧酶(NCED)和醛氧化酶(AO)等以及相關(guān)輔因子突變有關(guān)。Z

6、EP、NCED和AO是生物合成的關(guān)鍵酶。其次,一些IPP合成有關(guān)的酶,某些異構(gòu)酶和特定的輔因子如鑰輔因子(MOCO)、鉑輔因子硫酸化酶(MCSU)等以及細胞膜類固醇都調(diào)節(jié)ABA的合成。 ZEP是ABA生物合成中第一個從DNA及氨基酸序列水平上研究證實的酶。煙草中由ABA2基因編碼ZEP,分子量72.5KD,是一個葉綠體輸入蛋自,催化玉米黃質(zhì)環(huán)氧化形成新黃質(zhì)。ABA2蛋自首先催化長米黃質(zhì)轉(zhuǎn)化成環(huán)氧玉米黃質(zhì),進而在還原型鐵硫蛋自作用下轉(zhuǎn)化成新黃質(zhì),同時去環(huán)氧化酶作用新黃質(zhì)逆轉(zhuǎn)形成玉米黃質(zhì)。已知玉米黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)、新黃質(zhì)都與聚光復合體(LHC)耦連,因而認為玉米黃質(zhì)轉(zhuǎn)化成新黃質(zhì)及逆過程(葉黃素循

7、環(huán))可能保護LHC免遭光氧化。11前已經(jīng)在胡椒、番茄、煙草中克隆到了同源玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶cDNA,對ABA2基因編碼的ABA2蛋白及其它同源基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析表明,ZEP有4個關(guān)鍵區(qū):A、B、C、D區(qū)。涉及全一反式紫黃質(zhì)轉(zhuǎn)變成9一順式或9一新黃質(zhì)的酶仍有待提取。從番茄或馬鈴薯克隆的一個基因編碼的蛋自具有催化全一反式一紫黃質(zhì)到全一反式一新黃質(zhì)的能力,用突變體分析證實在植物活體內(nèi)該蛋自不具備上述功能(Hirsehberg,2001)。 在擬南芥、油菜、首倩、煙草等中發(fā)現(xiàn)形成種子至成熟過程的1/3和1/2處時間處,ABA的水平會顯著增加,并在煙草中證實ABA2mRNA水平在這個階段出現(xiàn)高峰,ABA2

8、基因表達調(diào)節(jié)著ABA合成及種子的發(fā)育。同樣用轉(zhuǎn)基因方法使ABA2基因超表達,能延長種子休眠;用反義RNA技術(shù)可打破休眠。種子胚中ABA2基因的表達、ZE水平限制ABA生物合成。在非光合組織如番茄根中,ABA水平的增加與特定的葉黃素減少成線性關(guān)系。所以ABA2編碼的ZE及與黃質(zhì)醛裂解有關(guān)的酶可能是調(diào)節(jié)ABA生物合成的關(guān)鍵酶。但這只是在非光合組織中實驗的結(jié)果,在光合組織葉中,干旱條件下ABA2mRNA水平呈周期性變化,但不影響ABA的合成,ZEP可能不是ABA合成的關(guān)鍵酶。NCED(9一順一環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶)在質(zhì)體切割裂解9一順新黃質(zhì)和9一順紫黃質(zhì)形成黃質(zhì)醛,是葉中ABA合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶,在

9、光照期結(jié)束時NCED表達最強。對比之下,ZEP表達在光照中期最大,說明影響ABA合成的每個基因存在不同的調(diào)節(jié)系統(tǒng),導致不同的晝夜節(jié)律。在玉米胎生突變體VP14中發(fā)現(xiàn)VP14基因產(chǎn)物有裂解新黃質(zhì)的作用,分析VP14基因序列,發(fā)現(xiàn)其與種細菌木質(zhì)茋酶相似。已知木質(zhì)茋酶可催化類胡蘿卜素裂解(Koomneefctal,1998)。重組的VP14蛋自在氧氣,亞鐵離子,抗壞血酸及一定的去垢劑存在時,離體條件也可切割9一順葉黃素,對玉米葉片的Northemblotting表明,萎蔫時VP14基因誘導與ABA的增加一致,因而推測VP14編碼的蛋自可能催化9一順新黃質(zhì)及9一順紫黃質(zhì)的裂解反應。NCED在果實成熟、

10、萎蔫、缺水等過程或條件下對ABA的合成起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。萎蔫過程中VP14的表達與ABA水平的升高成平行關(guān)系。NCED基因是一多毯因家族VP14、PaNCEDIPaNCEDZ都是9一順環(huán)氧類胡蘿卜素雙氧酶家族中的成員(Chemysctal,2000)。從鱷梨中提取二種與NCED相關(guān)的cDNAs,玉米、大豆、擬南芥、番茄及鱷梨中NCED的氨基酸序列60%同源(Burbidgeetal,1999)。Luchis等(2000)從與就豆脫水反應有關(guān)的cDNA中分離得到了一個9一順環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的同源cDNA片段,其編碼的蛋自(uvNCED)用GST融合顯示其能催化9一順環(huán)氧類胡蘿卜素裂解。用

11、sGFP(合成的綠色熒光蛋自)融合試驗發(fā)現(xiàn)vuNCED蛋白N一未端序列起到轉(zhuǎn)運肽的作用,能將uvNCED轉(zhuǎn)運至質(zhì)體內(nèi)。在鱷梨中分離得到了三個NCED同源cDNA,即PaNCEDI、PaNCEDZ和PNaCED3,發(fā)現(xiàn)NCED組織特異性表達,PaNCEDI和PaNCED3能催化9一順式紫黃質(zhì)和9一順一新黃質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S質(zhì)醛,與果實成熟中ABA水平變化一致。PaNCEDI在葉中高度表達,脫水能誘導其表達。PaNCED3不能在葉片表達。玉米Vp14(ZmNCED1)也不能在日片表達,只在胚乳和根高度表達。在Pv14突變體胚乳的ABA水平低于野生型,但在正常(非脅迫)葉片中突變體和野生型的ABA含量卻沒有

12、差異。這些結(jié)果表明在正常(非脅迫)葉片是NCED基因而不是Vp14基因影響ABA生物合成。同樣,擬南芥有9種NCED基因,各種基因表達有器官特異性。PaNCEDI及PaNCED3N一末端具有轉(zhuǎn)運膚,類似于玉米、火豆中的NCED,能從細胞溶膠轉(zhuǎn)運入質(zhì)體起作用(ChemysnadZeevaart,2000)。目前的研究表明NCED是在細胞溶膠內(nèi)合成后在轉(zhuǎn)運肽引導下進入質(zhì)體,再催化葉綠醇的氧化裂解的。NCED蛋白與玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶相似,具有不同的功能關(guān)鍵區(qū)如N一末端轉(zhuǎn)運膚區(qū),可變區(qū),催化反應的核心區(qū)等。保守區(qū)可能是底物與輔因子結(jié)合的區(qū)域。豆在干旱環(huán)境中編碼ZEP的VuABAZ基因并不表達,但VuDC

13、EDI墓因卻高度表達。在海棠根系中脂氧化酶(LOX)活性與ABA的積累一致,用LOX的專一抑制劑去甲愈創(chuàng)木酸(MDGA)抑制LOX活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)脅迫誘導的ABA被阻斷(楊洪強等,2000)。NCEDDCED為LOX的同功酶或同類酶,同樣裂解C40類胡蘿卜素。（3）、晚期反應階段由黃質(zhì)醛生成ABA推測有三條途徑:(l)通過醛氧化酶(AO)作用將ABA醛轉(zhuǎn)變成ABA,在空氣中很容易轉(zhuǎn)化成ABA。(2)AO催化黃質(zhì)醛氧化成黃質(zhì)醛酸,然后在短鏈脫氫酶/還原酶(SDR, 由ABA2基因編碼作用下轉(zhuǎn)變?yōu)锳BA。對擬南芥aba3突變體及大豆葉蛋自用丙酮稀釋(l倍),其沉淀物中證實黃質(zhì)醛被醛氧化酶氧化形成黃質(zhì)

14、醛酸,黃質(zhì)醛酸很容易在醛氧化酶作用下轉(zhuǎn)變形成ABA。因而ABA醛可能是ABA生物合成的最直接前體。上述兩條途徑受植物體在不同的發(fā)育階段或不同器官而變化調(diào)節(jié)。(3)當ABA醛轉(zhuǎn)變成ABA的途徑受到影響時,ABA醛先轉(zhuǎn)變?yōu)锳BA醇,ABA醇可在細胞色素P一450氧化酶作用下在氧的條件下氧化形成ABA。在離體條件下,植物體內(nèi)ABA合成的最后階段可能經(jīng)黃質(zhì)醛、黃質(zhì)醛酸,1,4一反式ABA二醇等中間產(chǎn)物步驟。其中,4-OH氧化和l,2,一環(huán)氧異構(gòu)化形成l一OH和2,一烯等過程還有待研究。番茄突變體fla和sit由于缺乏醛氧化酶不能將2H一ABA醛和2H一ABA醇轉(zhuǎn)化成順式一ABA。用柑橘外果皮無細胞系實

15、驗證實紫黃質(zhì)可裂解形成黃質(zhì)醛,黃質(zhì)醛在醇脫氫酶作用下形成不穩(wěn)定的4一酮黃質(zhì)酸,再轉(zhuǎn)變成ABA醛、氧化形成ABA。, 一類胡蘿卜素(脅迫及發(fā)育調(diào)控下在細胞溶膠內(nèi)發(fā)生的反應)是ABA生物合成的兩個直接前體物質(zhì)。在植物體內(nèi)黃質(zhì)醛”黃質(zhì)酸*4,一酮-黃質(zhì)酸、ABA。4一酮一黃質(zhì)酸具有與ABA許多相似的理化性質(zhì),脅迫誘導產(chǎn)生的4一酮一黃質(zhì)酸在12環(huán)氧發(fā)生異構(gòu)化成1一羥基。ABA缺乏突變體積累2一反一ABA。由2一順一ABA醛,2一順一ABA醇*2一順一ABA(具生物活性),然而2一順一ABA醛來白于2一反一ABA醇,由黃質(zhì)醛轉(zhuǎn)變?yōu)?一反一ABA醇的可能性小,只能是由2一順一黃質(zhì)醛*2一順一ABA醛2一順

16、一ABA醇*2一反一ABA,因而2一反一ABA醇可能是E,E-類胡蘿卜素裂解或法呢基焦磷酸(FDP)代謝重新合成的。植物體存在法呢醇庫用于類異戊二烯脂肪的生物合成。FDP經(jīng)過氧化還原反應轉(zhuǎn)變成E,Z一法呢基醇,去飽和作用生成2,4,6一脫氫一法呢基醇,通過環(huán)化、羚基化形成2一反一ABA醇。2一反一ABA醇葡糖基化,水解和異構(gòu)化后產(chǎn)生2一順-ABA醇,最后氧化成2一順一ABA。S一ABA主要來自9,2一xanthhyll裂解;XAN代謝與ABA生物合成可能不屬于同過程。ABA生物合成中間產(chǎn)物如ABA醇和4一酮一黃質(zhì)酸等與體內(nèi)一些物質(zhì)化合后所形成的聚合物稱為ABA加合物(daduct),有ABA酮

17、(如ABA醇毗喃葡萄糖普與多膚結(jié)合)和烯醇(如4一酮-黃質(zhì)酸與多膚結(jié)合)兩種類型,它們不是由ABA或ABA醛轉(zhuǎn)變而來。脅迫下加合物釋放ABA到質(zhì)外體中參與生理調(diào)控。目前認為ABA加合物是ABA的前體,因為在洋蔥中,從加合物中釋放的甲基ABA(meABA)中標記的3H高度富集,而在游離的ABA中相對較少。但在番茄莖尖中,2H3一ABA醛并不進人加合物,帶有新合成的ZH的ABA加合物可能是由于葉綠體中有高濃度的新合成的ABA交換進入加合體后形成的。ABA加合物的結(jié)構(gòu)及其轉(zhuǎn)變成ABA的途徑還有待研究確證。高等植物存在的AO催化叫吲哚乙醛氧化形成叫吲哚乙酸,影響ABA生物合成的后面階段反應。AO基因也

18、是一多基因家族。在番茄中證實,AO由兩個15OKD的同源亞基組成,含有結(jié)合兩個Fe一S的中心和一個輔助因子(MoCo)的位點,具有器官特異性。SDS免疫分析,大麥根部的AO由140KD和160KD亞基組成,葉和種子為160KD的單膚擬南芥AO至少有4個同源或異源二聚體,AOa(AAOl-AAo)l、AO比AAOI一AAO2)、AOY(AAO2一AAO2)和AO6(AAO3一AAO3),它們在不同的組織或器官分布,具有不同的底物要求,依賴于相關(guān)基因的表達。AO6在葉特異ABA合成中起作用。很多植物擬南芥、大麥、吞茄、煙草等證實存ABA合成的缺失突變體,如大麥narZa、擬南芥baa3、馬鈴薯dr

19、oopy、番茄na、煙草baal/kcrl等突變體。其中大部分是缺乏ABA醛氧化轉(zhuǎn)變成ABA過程的酶系。AO有廣泛的底物特異性,不僅可催化ABA一dl轉(zhuǎn)化成ABA,而且能催化AIA一dl轉(zhuǎn)化成AIA,催化黃質(zhì)醛氧化形成黃質(zhì)醛酸。已知AO、XDH、NR及亞硫酸氧化酶(50)都是依賴于鑰輔因子酶,NR和50需輔助因子雙氧中心,而AO和xDH則需一單氧鉬及一個硫(此反應是在輔助因子硫酸化酶作用下完成的)。AO、xDH與NR的作用方式可能有所不同。AO和xDH的氨基酸序列高度同源,必須在MoCO硫酸化后才具有活性。Sagi等(1999)在番茄fla突變體的離體莖及野生型番茄提取物中,存在XDH和AO蛋

20、白,用NaZS硫酸化MoCO可以激活XDH樸1AO。從擬4Ij芥中分離鑒定出兩個等位的突變體1055一1和1055一2(Xiongetal,2001)。遺傳分析證實擬南芥1055基因是baa3的等位基因,編碼鑰輔因子硫酸化酶(MSCU)。MSCU與類Nisf蛋自相比,N末端高度相似,C末端高度同源。類Nisf蛋白在體外可催化半朧氨酸去硫化形成酪氨酸和硫醚。由于1505/baa與其它生物體的MSU具有高度的同源性,Nif有硫化作川必需的半胱氨酸和PLP結(jié)合模式,所以MSCU在輔助因子硫化作用中起著關(guān)鍵性作用。干旱、鹽、ABA處理擬南芥突變體1055激活1055基因表達,ABA水平也同時上升。因此

21、,loss/ABA3可能是ABA合成、脅迫反應基因表達及脅迫毒害中關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)因子,最近又分離獲得了baal的等位基因1056,其調(diào)控滲透脅迫反應基因的表達,與玉米黃質(zhì)的環(huán)氧化有關(guān)。用高滲培養(yǎng)法從擬南芥中分離得到兩個突變體sre和asfi,其缺乏短鏈脫氫酶/還原酶,進而發(fā)現(xiàn)了4個新的ABAZ等位基因,它們的產(chǎn)物在NAD存在時催化新黃質(zhì)轉(zhuǎn)化成黃質(zhì)醛,進一步證明了新黃質(zhì)脫落醛ABA的轉(zhuǎn)化途徑。二、ABA受體的研究自20世紀70年代以來, 受體鑒定一直是ABA信號轉(zhuǎn)導通路研究的重點和難點。有研究表明, ABA受體可能定位于質(zhì)膜或其它亞細胞結(jié)構(gòu), 它能夠識別并特異性結(jié)合ABA, 進而激活下游信號通路并

22、引發(fā)相應的生理反應(吳忠義等, 1998; Finkelstein et al., 2002)。自2006年FCA被報道為ABA受體以來(Razem et al.,2006), 相繼報道了ABAR/CHLH、GCR2、GTG1/2和PYR/ PYL/RCAR是ABA的受體蛋白, 為植物中ABA信號轉(zhuǎn)導通路的闡明奠定了重要基礎(Shen etal., 2006; Liu et al., 2007a; Ma et al., 2009; Pandeyet al., 2009; Park et al., 2009)。本文將重點介紹各個受體(FCA除外)的研究情況。（1）ABAR/CHLHABAR/CH

23、LH是定位于植物細胞質(zhì)體/葉綠體的鎂離子螯合酶H亞基。它不但可催化細胞葉綠素的合成,而且在應激條件下能夠參與質(zhì)體/葉綠體與細胞核之間的信號反向傳遞(Walker and Willows, 1997; Mochizuki et al., 2001)。2002年, 張大鵬研究組首次從蠶豆(Vicia faba)葉片中分離純化了(+)-ABA特異性結(jié)合蛋白, 暗示其具備ABA受體特征, 并將其命名為ABAR(Zhang et al., 2002)。隨后, Shen等(2006)的研究表明, 擬南芥(Arabidopsis thaliana)的同源蛋白ABAR/CHLH同樣能與(+)-ABA特異性結(jié)合

24、, 且符合受體與配體結(jié)合的動力學特征; 同時, 根據(jù)相關(guān)轉(zhuǎn)基因材料在種子萌發(fā)、幼苗生長和氣孔運動等生理實驗中的表型以及ABA信號應答基因表達, 推斷ABAR/CHLH可作為受體蛋白正調(diào)控擬南芥ABA信號應答反應。但Müller和Hansson(2009)的研究顯示,大麥(Hordeum vulgare)中的ABAR/CHLH同源蛋白XanF不能與(+)-ABA特異性結(jié)合, 其突變體也未表現(xiàn)出ABA信號應答相關(guān)表型, 故對ABAR/CHLH作為ABA受體蛋白提出了質(zhì)疑。作為回應, 張大鵬研究組通過實驗進一步證明了ABAR/CHLH蛋白的C-端是與(+)-ABA特異性結(jié)合的關(guān)鍵區(qū), 并在

25、ABA信號應答過程中發(fā)揮著中心作用。同時, 依據(jù)單子葉植物大麥XanF和水稻(Oryza sativa)CHLH都能與(+)-ABA特異性結(jié)合并發(fā)揮生物學功能, 推測Müller和Hansson得出上述結(jié)果的原因可能是XanF基因功能冗余亦或是實驗操作不當(Wu et al., 2009; Shang et al., 2010; 張大鵬, 2011)。另外, Shang等(2010)通過對ABAR/CHLH的深入研究, 發(fā)現(xiàn)作為跨質(zhì)體/葉綠體被膜蛋白, 其C-端和N-端均暴露在細胞質(zhì)中, 這為定位于質(zhì)體/葉綠體被膜的ABAR/CHLH受體蛋白識別和傳遞ABA信號提供了重要線索?？墒?

26、 Tsuzuki等(2011)根據(jù)放射性ABA測定系統(tǒng)及相關(guān)突變體表型實驗結(jié)果提出,ABAR/CHLH能夠介導ABA信號調(diào)控的氣孔運動, 但不是作為ABA受體, 并推測鎂螯合酶可能以整體形式參與調(diào)控氣孔的運動。因此, ABAR/CHLH是否作為受體蛋白參與ABA信號轉(zhuǎn)導通路尚不能完全確定。我們?nèi)匀恍枰獞们‘數(shù)膶嶒炇侄巫C實ABAR/CHLH是以受體蛋白形式識別和傳遞ABA信號, 還是以調(diào)節(jié)因子形式參與ABA信號應答。（2）GCR2Jeannette 等 (1999) 和 Pierce 等 (2002) 的研究表明 ,ABA信號的識別可能發(fā)生在細胞外,因而定位于細胞質(zhì)膜的G蛋白耦聯(lián)受體成為ABA

27、受體的熱門候選。馬力耕研究組應用生物信息學、遺傳學和生物化學等手段證明, 具有G蛋白耦聯(lián)受體特征的GCR2蛋白能與(+)-ABA特異性結(jié)合, 調(diào)控擬南芥ABA信號應答反應,并以GCR2蛋白為受體構(gòu)建了ABA信號轉(zhuǎn)導通路模型(Liu et al., 2007a)。正常條件下, GCR2蛋白的C-端與G蛋白的亞基(G protein subunit, GPA1)相互作用形成復合體,ABA與GCR2蛋白的特異性結(jié)合誘使G蛋白釋放, G蛋白隨后分離為G和G二聚體,并分別通過作用于其下游的效應因子調(diào)控ABA的信號應答反應(Liu et al., 2007a)。但是, GCR2蛋白行使ABA受體功能的報道

28、很快就受到質(zhì)疑。Johnston等(2007)借助硅模型和生物信息學分析指出, 擬南芥中的GC-R2既不是跨膜蛋白, 也不是G蛋白耦聯(lián)受體, 它只是細菌羊毛硫氨酸合成酶的同源蛋白。雖然馬力耕研究組針對該觀點給予了回應, 并提出GCR2可能是一種新型的G蛋白耦聯(lián)受體(Liu et al., 2007b), 但爭論并未停止。Chen Jin-Gui研究組通過一系列實驗證明,GCR2在擬南芥種子萌發(fā)及幼苗生長階段不能參與調(diào)控ABA信號應答反應, 并推測該蛋白可能是真核生物LanC超級家族中的新成員(Gao et al., 2007; Chenand Ellis, 2008; Guo et al.,

29、2008)。同時, Illing-worth等(2008)利用傅立葉變換算法解釋了GCR2被誤判為G蛋白耦聯(lián)受體的可能原因。另外, Risk等(2009)同樣證明了GCR2不能與ABA特異性結(jié)合, 盡管該實驗中GCR2的分離純化方式還需商榷。綜上所述, GCR2能否作為受體蛋白參與ABA信號應答反應還有待進一步證實。（3）GTG1/2由G、G和G亞基組成的G蛋白協(xié)同G蛋白耦聯(lián)受體及其下游效應因子在響應植物激素信號應答過程中發(fā)揮著重要作用(Assmann, 2004; Jones and Ass-mann, 2004)。2009年, Assmann研究組首次報道了2個具有G蛋白耦聯(lián)受體特征的G蛋

30、白, 并認為它們可能以G蛋白或ABA受體形式行使ABA信號識別和轉(zhuǎn)導功能(Pandey et al., 2009)。Pandey等(2009)首先通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)了2個與人類G蛋白耦聯(lián)受體GPR89序列高度同源且具有9次跨膜結(jié)構(gòu)、GTP結(jié)合域和退化的GTP酶激活蛋白結(jié)合域的GPCR型G蛋白, 分別命名為GTG1和GTG2。隨后, 他們利用生物化學和遺傳學等技術(shù)手段證實了GTG1/2具備G蛋白的所有基本特征, 并根據(jù)其能與(+)-ABA特異性結(jié)合以及相關(guān)突變體表型實驗, 推斷GTG1/2是2個定位于細胞質(zhì)膜的ABA受體蛋白。在以GTG1/2為受體的ABA 信號轉(zhuǎn)導通路模型中 , GPA1-

31、GTP 通過抑制GTG1/2蛋白酶活性促使GTG-GTP維持在較高水平,進而降低GTG-GDP與ABA的結(jié)合幾率。相反, GTGs-GDP與ABA的結(jié)合可導致構(gòu)型變化進而啟動ABA信號應答, 但具體分子機制尚未闡明(Pandey et al.,2009)。除此之外, 與該受體相關(guān)的研究還存在多個問題需要解決。例如, 目前尚難以解釋gtg1gtg2及gp-a1 突變植株在氣孔實驗中的表型 (Pandey et al.,2009); GTG1/2的人類同源蛋白GPR89實際上是高爾基體中調(diào)控離子平衡的陰離子通道(Maeda et al., 2008); 化學計量法檢測發(fā)現(xiàn)只有1%的GTG1/2能與

32、(+)-ABA結(jié)合等。GTG1/2作為ABA受體蛋白同樣受到了質(zhì)疑。Pennisi(2009)認為該蛋白只是ABA信號轉(zhuǎn)導通路中的調(diào)節(jié)因子之一, 或是受ABA調(diào)控的陰離子通道。另外, 關(guān)于GTG1/2與ABA的體外結(jié)合實驗, Pan-dey等(2009)認為由于GTG1/2具有跨膜蛋白的性質(zhì),使得該蛋白質(zhì)的純化、溶解及復性過程等存在較大困難。盡管GTG1/2是否可作為ABA的受體尚未有定論,但對該蛋白的深入研究極大地促進了G蛋白信號轉(zhuǎn)導通路與ABA信號應答的相互聯(lián)系的研究。而且近年來與G蛋白相關(guān)的結(jié)構(gòu)生物學研究可能會為闡明GTG1/2識別和傳遞ABA信號的分子機制奠定基礎(Rasmussen

33、et al., 2011)。（4） PYR/PYL/RCAR上述幾個ABA受體都受到了不同程度的質(zhì)疑致使ABA受體的研究充滿挑戰(zhàn)性。2009年, Grill研究組以負調(diào)控ABA信號應答反應的蛋白磷酸酶ABI2為誘餌,應用酵母雙雜交篩選法獲得了一個START家族成員,命名為RCAR1(Ma et al., 2009)。有趣的是, Culter研究組同期報道了應用化學遺傳學手段, 以人工合成的種子萌發(fā)抑制劑pyrabactin作為ABA信號應答選擇性激動劑篩選到了ABA受體蛋白PYR1的工作(Park etal., 2009)。實際上, RCAR1與PYR1同屬定位于細胞核和細胞質(zhì)的START家族

34、蛋白成員, 只是命名方式不同。以此為基礎, 這兩個研究組繼續(xù)通過一系列生物化學和遺傳學手段證實了RCAR1和PYR1都能與ABA特異性結(jié)合, 進而與蛋白磷酸酶PP2Cs相互作用, 導致其磷酸酶活性受到抑制而影響ABA信號應答反應。因此, Ma等(2009)和Park等(2009)推斷RCAR1-ABI2蛋白復合物或PYR1可能作為受體蛋白參與ABA信號應答。隨后, PYR/PYL/ RCAR被報道為ABA受體蛋白同樣受到了廣泛關(guān)注, 并最終得到了專家們的認可。Santiago等(2009b)以蛋白磷酸酶HAB1為誘餌篩選到相互作用的蛋白PYL5、PYL6和PYL8, 并重點闡明了PYL5作為受

35、體蛋白介導ABA信號應答的分子機制。Nishimura等(2010)以帶YFP標簽的蛋白磷酸酶ABI1為誘餌, 利用親和純化和質(zhì)譜鑒定等方法鑒定到PYR/PYL/RCAR家族中的9個成員, 其中包括已被報道的ABA受體RCAR1和PYR1。更關(guān)鍵的是, 生物化學和結(jié)構(gòu)生物學研究充分證實, PYR/PYL/RCAR是單獨作為受體蛋白參與ABA信號識別的, 并生動展示了ABA、PYR/PYL/RCAR受體蛋白與蛋白磷酸酶PP2Cs相互作用的分子機制, 這為闡明受體蛋白識別和傳遞ABA信號的過程提供了重要的理論依據(jù)(Melcher et al., 2009; Miyazono et al., 200

36、9; Nishi-mura et al., 2009; Santiago et al., 2009a; Yin et al.,2009)。另外, 這一重要成果(PYR/PYL/RCAR受體蛋白的鑒定及結(jié)構(gòu)解析)被評為2009年十大科學進展。PYR/PYL/RCAR家族共有14個成員, 其中13個成員(PYL13除外)的序列和結(jié)構(gòu)具有高度保守性, 且都能與ABA相結(jié)合并抑制蛋白磷酸酶PP2Cs的活性,發(fā)揮ABA受體功能(Yuan et al., 2010)。針對各成員間響應ABA信號功能不明晰的現(xiàn)狀, 顏寧研究組對已克隆的10個PYR/PYL/RCAR受體蛋白(PYL7、PYL11和PYL12除

37、外)進行了系統(tǒng)生化分析, 發(fā)現(xiàn)有部分受體蛋白無論ABA存在與否都能與蛋白磷酸酶PP2Cs相互作用并抑制其活性(Hao et al., 2011)。隨后, Hao等(2011)應用生物化學和結(jié)構(gòu)生物學手段分析了受體蛋白PYL10不依賴ABA抑制蛋白磷酸酶PP2Cs的分子機制, 為深入探討PYR/PYL/RCAR受體蛋白調(diào)控的ABA信號轉(zhuǎn)導通路以及該家族受體蛋白的分類提供了結(jié)構(gòu)和功能依據(jù)?？偟膩碚f, PYR/PYL/RCAR的篩選和鑒定無疑是ABA受體研究中的重大突破, 它合理地詮釋了之前未能完全解釋的實驗現(xiàn)象。例如,(-)-ABA的生物學活性; ABA受體的功能冗余性; 蛋白磷酸酶突變體abi1

38、和abi2對ABA的不敏感現(xiàn)象(Hu-ang et al., 2007; Klingler et al., 2010)。這一重大突破有力地推動了植物ABA信號轉(zhuǎn)導通路的闡明。三、 ABA信號轉(zhuǎn)導通路模型的構(gòu)建近年來, 隨著遺傳學、生物化學、細胞生物學和生物信息學等手段的廣泛應用, 大量參與ABA信號轉(zhuǎn)導功能的組分得到鑒定, 主要包括ABA受體蛋白、G蛋白、G蛋白耦聯(lián)受體、蛋白磷酸酶、蛋白激酶、E3泛素連接酶、鈣離子結(jié)合蛋白、RNA結(jié)合蛋白、磷酸、活性氧、MicroRNA以及各類轉(zhuǎn)錄因子(Finkelstein et al.,2002; Himmelbach et al., 2003; Xie

39、et al., 2005;Kuhn et al., 2008; Rushton et al., 2011)。這充分反映出植物中ABA信號轉(zhuǎn)導通路的復雜性, 以及ABA信號調(diào)控在植物生長發(fā)育及響應外界應激過程中的重要性。因而, 植物中ABA信號轉(zhuǎn)導通路的闡明對全面了解植物的生長和發(fā)育特性意義深遠。（1） 以ABAR/CHLH為受體的ABA信號轉(zhuǎn)導通路從受體蛋白的信號識別與傳遞到生物體呈現(xiàn)的生理生化應答反應,始終是信號轉(zhuǎn)導研究需要闡明的中心問題。張大鵬研究組憑借對植物ABA信號轉(zhuǎn)導通路多年來的研究積累, 以ABAR/CHLH為受體, 構(gòu)建了從ABA信號原初識別及傳遞, 到植物體生理反應發(fā)生的ABA

40、信號轉(zhuǎn)導通路模型(Shang et al., 2010)。該模型中, 結(jié)合ABA的ABAR/CHLH刺激轉(zhuǎn)錄因子WRKY-40從細胞核向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移, 并促進ABAR/CHLH與WRKY40兩者間的相互作用, 進而阻遏WRKY40的表達, 導致WRKY40對ABA信號應答因子(如ABI5、ABI4、ABF4和MYB2)轉(zhuǎn)錄抑制的解除, 最終實現(xiàn)植物體的ABA信號應答反應(Shang et al., 2010; 張大鵬, 2011)。Shen等(2006)以擬南芥為材料進行生理實驗時發(fā)現(xiàn), ABAR/CHLH超表達植株在種子萌發(fā)、幼苗生長和氣孔運動方面對ABA信號表現(xiàn)出高度敏感,而abar/chl

41、h相關(guān)突變體以及RNAi干擾植株的ABA信號應答反應正好相反, 符合ABAR/CHLH作為受體蛋白介導ABA信號應答的結(jié)論。另外, ABA負調(diào)控功能組分WRKY40的相關(guān)突變體也表現(xiàn)出對ABA高度敏感(Shang et al., 2010)。但是, Chen等(2010)的研究表明, wrky40突變體的ABA信號應答因子ABI5和DREB2A的轉(zhuǎn)錄水平以及生理表型均沒有表現(xiàn)出ABA信號應答特征。目前, 已有證據(jù)表明轉(zhuǎn)錄因子ABI3、ABI4和ABI5可調(diào)控與種子發(fā)育相關(guān)蛋白(如SSP (seed storageprotein)和LEA (late embryogenesis abundant

42、)基因的表達, 進而控制種子的休眠或萌發(fā)(Holdsworth etal., 2008; Reeves et al., 2011)。在側(cè)根發(fā)育過程中,轉(zhuǎn)錄因子ABI4通過抑制生長素輸出載體PIN1的表達制約生長素的極性運輸, 生長素水平的下降最終阻礙了側(cè)根的 生長 發(fā)育(Shkolnik-Inbar and Bar-Zvi,2010)。最近, 張大鵬研究組發(fā)現(xiàn)了一個催化脂肪酸-氧化的3-酮脂酰輔酶A硫解酶KAT2, 該酶能夠正向調(diào)控ABA信號的應答反應, 包括種子萌發(fā)、幼苗生長和氣孔運動, 并推測其作用機理可能是調(diào)節(jié)植物細胞中活性氧的動態(tài)平衡。而且, 相關(guān)實驗數(shù)據(jù)表明,KAT2作用于轉(zhuǎn)錄因子W

43、RKY40的下游, 說明其主要參與ABAR/CHLH介導的ABA信號轉(zhuǎn)導通路(Jiang etal., 2011)。盡管如此, 以ABAR/CHLH為受體的ABA信號轉(zhuǎn)導通路模型目前還不夠成熟, 仍有許多問題亟待解決。例如, ABAR/CHLH受體蛋白如何識別并傳遞ABA信號; 轉(zhuǎn)錄因子WRKY40被轉(zhuǎn)移和抑制的作用機制; ABAR/CHLH下游調(diào)節(jié)因子的篩選與鑒定(Sh-ang et al., 2010; 張大鵬, 2011)等。（2） 以PYR/PYL/RCAR為受體的ABA信號轉(zhuǎn)導通路PYR/PYL/RCAR受體蛋白的鑒定是ABA受體研究的一個階段性成果。通過對受體蛋白PYR/PYL/R

44、CAR、蛋白磷酸酶PP2Cs、蛋白磷酸激酶SnRK2s以及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)和深入研究, 初步構(gòu)建了以PYR/PYL/RCAR為受體的ABA信號轉(zhuǎn)導通路模型(Fujii etal., 2009; Melcher et al., 2009; Miyazono et al.,2009; Nishimura et al., 2009; Park et al., 2009;Santiago et al., 2009a; Umezawa et al., 2009; Vladet al., 2009; Yin et al., 2009)。不存在ABA的條件下,以二聚體形式存在的PYR/PYL/RCAR受體

45、蛋白不能與蛋白磷酸酶PP2Cs相互作用, PP2Cs處于高活性狀態(tài)并抑制其下游功能組分SnRK2s的活性, 植物體保持正常的生長趨勢; 存在ABA的條件下, 細胞中的ABA與受體蛋白PYR/PYL/RCAR結(jié)合, 促使其構(gòu)型發(fā)生變化, 形成能與PP2Cs相互作用的單體結(jié)構(gòu)。結(jié)合了ABA的PYR/PYL/RCAR與PP2Cs相互作用能夠完全掩蓋PP2Cs的磷酸酶活性位點, 進而使SnRK2s的自我磷酸化與蛋白磷酸化活性得到釋放。處于激活狀態(tài)的SnRK2s一方面通過蛋白磷酸化作用激活下游轉(zhuǎn)錄因子ABA-responsive Element Binding Pro-teins/ABA-respons

46、ive Element Binding Factors(AREBs/ABFs), 如AREB1/ABF2、AREB2/ABF4和ABF3, 正向調(diào)控ABA信號應答基因的表達(Fujita etal., 2009; Sirichandra et al., 2010; Yoshida et al.,2010); 另一方面直接作用于相關(guān)膜蛋白, 如陰離子通道Slow Anion Channel 1 (SLAC1)和鉀離子通道Inward-rectifying Potassium ion Channel (KAT1)。SLAC1的激活促使胞內(nèi)陰離子釋放, 進而導致pH值升高和質(zhì)膜去極化, 并隨后激活外

47、向鉀離子通道。同時, 內(nèi)向鉀離子通道KAT1經(jīng)磷酸化作用受到抑制,協(xié)同促進胞內(nèi)離子和水分的流失, 最終誘導氣孔關(guān)閉(Geiger et al., 2009; Lee et al., 2009; Sato et al.,2009) 。此外 , SnRK2s 還可作用于定位于質(zhì)膜的NADPH氧化酶AtrbohF, 催化胞外活性氧產(chǎn)生, 進而促使氣孔關(guān)閉(Sirichandra et al., 2009)。活性氧水平的提高, 可反作用于PP2Cs, 進一步增強SnRK2s的酶活性, 形成正反饋循環(huán)模式。繼闡明PYR/PYL/RCAR識別ABA信號并抑制PP2Cs酶活性的分子作用機理之后, 顏寧研究組

48、根據(jù)SnRK2.6激酶域的結(jié)構(gòu)分析, 揭示了蛋白磷酸酶ABI1識別并抑制蛋白激酶SnRK2.6的分子機制, 這為理解ABA信號下游通路提供了重要線索(Xie et al.,2012)。與此同時, 徐華強研究組報道了ABA信號通路下游功能組分SnRK2s與PP2Cs的分子結(jié)構(gòu), 有效地解決了SnRK2s被抑制或激活的分子作用機理問題(Ng et al., 2011; Soon et al., 2012)。在未結(jié)合ABA的條件下, SnRK2s的活性環(huán)進入到PP2Cs的活性位點, 而PP2Cs保守的ABA識別位點色氨酸則插入到SnRK2s的催化裂縫區(qū)域, 激酶活性完全被抑制。巧合的是, 兩者的結(jié)合

49、方式與PYR/PYL/RCAR和PP2-Cs之間的結(jié)合方式驚人的相似(Soon et al., 2012)。當SnRK2s的抑制被解除時, 激酶調(diào)節(jié)域中保守螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的催化域促使其部分活性被釋放, 導致活性環(huán)自我磷酸化并獲得活性。當然, SnRK2s催化域的穩(wěn)定性直接關(guān)系到其自我磷酸化的效率(Ng et al.,2011)。依據(jù)PYR/PYL/RCAR與PP2Cs的復合體結(jié)構(gòu),該研究成功地闡明了從受體蛋白PYR/PYL/RCAR到蛋白磷酸酶PP2Cs, 再到蛋白激酶SnRK2s的ABA信號核心通路分子機制, 這進一步驗證了以PYR/PYL/RCAR為受體的ABA信號轉(zhuǎn)導通路模型。四、 小結(jié)自

50、19世紀60年代發(fā)現(xiàn)ABA以來, 伴隨其生理功能的不斷揭示, ABA的生物合成、轉(zhuǎn)運與降解、信號轉(zhuǎn)導通路的闡明以及與其它激素之間的交叉對話等研究均取得了重要進展。其中, ABA受體的篩選與鑒定始終是ABA信號應答研究的關(guān)鍵問題。由于ABA受體功能冗余性以及突變體致死等因素, 正向遺傳學的應用雖然在篩選ABA信號應答相關(guān)功能組分方面起了重要作用, 但對于ABA受體的鑒定卻成效甚微?？上驳氖? 研究人員利用生物化學手段在多種植物中發(fā)現(xiàn)了ABA結(jié)合蛋白的存在, 并成功分離了ABA潛在受體ABAR/CHLH。隨后, 生物信息學的迅速發(fā)展促成了GCR2和GTG1/2的發(fā)現(xiàn), 盡管兩者作為ABA受體仍存在

51、爭議。直到最近, 蛋白質(zhì)相互作用組學和化學遺傳學的廣泛應用最終使得人們在ABA受體研究過程中取得了重大突破, 確定了第1個ABA受體家族, PYR/PYL/RCAR。ABA受體蛋白的明確又將成為ABA研究的新起點。5、 未來展望近幾年 ABA 相關(guān)代謝研究已取得突破性進展，但仍有許多問題值得探討。如高等植物中轉(zhuǎn)錄因子參與的合成代謝調(diào)控以及其中一些關(guān)鍵基因功能研究仍舊匱乏 ；信號轉(zhuǎn)導中相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與下游基因的關(guān)系仍需確定 ；糖類、氨基酸及其他化合物調(diào)控ABA 信號穩(wěn)定性方面的問題也亟待解決 ；植物ABA 響應除干旱和鹽害之外的其他非生物脅迫的分子機制也有待完善。另外，更多轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及功能研究

52、也為揭示 ABA 在植物生長發(fā)育及植物對環(huán)境脅迫的響應等方面中的作用提供助力，將這些理論應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)也是眾多科研人員的夙愿根據(jù)目前已報道的ABA受體蛋白, 如何進一步鑒定有爭議的蛋白？如何闡明分別以各個受體蛋白(包括PYR/PYL/RCAR家族中具有一定冗余性的13個受體蛋白)為中心的ABA信號轉(zhuǎn)導通路, 以及各通路間的相互作用？仍是亟待解決的關(guān)鍵問題。生物學技術(shù)的迅猛發(fā)展為ABA信號轉(zhuǎn)導通路的研究提供了重要保障。例如, 在以PYR/PYL/RCAR為受體的信號轉(zhuǎn)導通路研究中, 結(jié)構(gòu)生物學手段的應用為PYR/PYL/RCAR識別ABA信號, PP2Cs和SnRK2s被抑制或激活分子機制的闡明

53、奠定了重要基礎?？傊? 關(guān)于ABA的研究雖已取得了階段性成功, 但如何系統(tǒng)詮釋其作用機制并聯(lián)系實際應用始終是科研工作者的根本目標, ABA信號轉(zhuǎn)導通路的闡明勢必將為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供堅實的理論指導。六、參考文獻1.Santiago J, Rodrigues A, Saez A, Rubio S, Antoni R,Dupeux F, Park SY, Marquez JA, Cutler SR, RodriguezPL (2009b). Modulation of drought resistance by theabscisic acid receptor PYL5 through inhib

54、ition of clade APP2Cs. Plant J 60, 575588.2. Sato A, Sato Y, Fukao Y, Fujiwara M, Umezawa T,Shinozaki K, Hibi T, Taniguchi M, Miyake H, Goto DB,Uozumi N (2009). Threonine at position 306 of the KAT1potassium channel is essential for channel activity and isa target site for ABA-activated SnRK2/OST1/S

55、nRK2.6protein kinase. Biochem J 424, 439448.3.Shang Y, Yan L, Liu ZQ, Cao Z, Mei C, Xin Q, Wu FQ,Wang XF, Du SY, Jiang T, Zhang XF, Zhao R, Sun HL,Liu R, Yu YT, Zhang DP (2010). The Mg-chelatase Hsubunit of Arabidopsis antagonizes a group of WRKYtranscription repressors to relieve ABA-responsive gen

56、esof inhibition. Plant Cell 22, 19091935.4.Shen YY, Wang XF, Wu FQ, Du SY, Cao Z, Shang Y,Wang XL, Peng CC, Yu XC, Zhu SY, Fan RC, Xu YH,Zhang DP (2006). The Mg-chelatase H subunit is anabscisic acid receptor. Nature 443, 823826.5. Shkolnik-Inbar D, Bar-Zvi D (2010). ABI4 mediates abs-cisic acid and

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