土壤微生物量測定方法

1、土壤微生物量測定方法一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸一&S5提取-碳分析儀器法）1、試劑（1）去乙醉氯仿制備：在通風櫥中，將分析純氯仿與蒸懦水按1?2 （v:v）加入分液漏 斗中，充分搖動1 min,慢慢放出底層氯仿于燒杯中，如此洗滌3次。得到的無乙醇氯仿中 加入無水氯化鈣，以除去氯仿中的水分。純化后的氯仿置于試劑瓶中，在低溫（4C）、黑暗 狀態(tài)下保存。（2）氫氧化鈉溶液c （NaOH） =lmolL-1：通常分析純固體氫氧化鈉中含有碳酸鈉，與 酸作用時生成二氧化碳，從而影響滴定終點判斷和測定的準確度。配制時應(yīng)先除去碳酸鈉, 根據(jù)碳酸鈉不溶于濃堿，可先將氫氧化鈉配成50% （w:v）的濃氧溶液

2、，密閉放置34d。 待碳酸鈉沉降后，取56 ml 50%氫氧化鈉上清液（約19 mol 1）,用新煮沸冷卻的除去二氧 化碳的蒸馀水釋稀到1L,即為濃度1 moll NaOH溶液，用橡皮塞密閉保存。（3）硫酸鉀提取劑c （K2SO4）= mol L1：取1742.5 g分析純硫酸鉀，用研缽磨成粉末 狀，倒于25 L塑料桶中，加蒸儲水至20 L,蓋緊螺旋蓋置于搖床（150 rmin-1）上溶解24 h 即可。（4）六偏磷酸鈉溶液夕（Na） = 5g 100 ml-1, pH：稱取50.0 g分析純六偏磷酸鈉溶于 800 ml高純度去離子水中，用分析純濃磷酸調(diào)節(jié)至pH ,用高純度去離子水定容至1L。

3、要 注意的是六偏磷酸鈉溶解速度很慢應(yīng)提前配制；由于其易粘于燒杯底部，若加熱常因受熱不 均使燒杯破裂。I（5）過硫酸鉀溶液A（K2s2。8）= 2g 100 ml1：稱取20.0g分析純過液酸鉀,溶于高純 度去離子水中，定容至1L。值得注意過硫酸鉀溶液易被氧化，應(yīng)避光存放且最多使用7d0（6）磷酸溶液（H3PO4） = 21 g 100 ml*1:量取37 ml分析純濃磷酸（85%）,慢慢加 入到188 ml高純度去離子水中即可。（7）鄰苯二甲酸氫鉀標準溶液P （） =1000mgCL-1）：取2.1254g經(jīng)105c烘23 h的 分析純鄰苯二甲酸氫鉀，溶于高純度去離子水，定容至1L。2、儀器設(shè)

4、備碳-自動分析儀（Phoenix 8000）、容量瓶（100 ml）、振蕩器（300 r min-1）x可調(diào)加液器 （50 ml）、可調(diào)移液器（5ml）、燒杯（盛濾液用）（50100 ml ）、聚乙烯提取瓶（100, 150 ml）, 聚乙烯塑料桶（20L,帶螺旋蓋），三角瓶（150 ml）、其它常規(guī)儀器。3、操作步驟（1）土樣前處理新鮮土壤應(yīng)立即處理或保存于4c冰箱中，測定前先仔細除去上樣中可見植物殘體（如 根、莖和葉）及上壤動物（如蚯蚓等），過篩（孔徑2 mm）,徹底混勻。如果土壤過濕， 應(yīng)在室內(nèi)適當風干，以手感濕潤疏松但不結(jié)塊為宜（約為飽和持水量的40%）。如果土壤過 于干燥，用蒸懦水調(diào)

5、節(jié)至飽和持水量的40%。將土壤置于密封的大塑料桶內(nèi)在25條件下 預(yù)培養(yǎng)715 d,桶內(nèi)有適量水以保持相對濕度為100%,并在桶內(nèi)放一小杯1 mol P NaOH 溶液以吸收土壤呼吸產(chǎn)生的COz。經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的土壤應(yīng)立即分析。如需保留，應(yīng)放置于 的冷藏箱中，下次使用前需要在上述條件下至少培養(yǎng)24 h。這些過程是為J消除上填水分限 制對微生物的影響，以及植物殘體對測定的干擾。土壤飽和持水量按Shaw （1958）的方法測定：在圓型漏斗下端裝一帶夾子的橡皮管， 漏斗內(nèi)塞玻璃纖維。取50g上壤于漏斗中，夾緊橡皮管，加入50 ml水保持30 min。然后打 開夾子，測定30 min內(nèi)流出的水量。加入的水量

6、減去流出的水量，再加上原來土壤中含有 的水量，即為該土壤的飽和持水量，以烘干土壤質(zhì)量百分數(shù)表示。（2）熏蒸稱取經(jīng)前處理后相當于20.0 g烘干基重的新鮮上壤（25.0g）3份于50 ml燒杯中。將燒杯 放入真空干燥器中，同時放入盛有去乙醇氯仿（約羽燒杯）的燒杯23個，燒杯內(nèi)放入少 量經(jīng)濃硫酸處理洗滌后烘干的瓷片（0.5 mm大小，防瀑沸），干燥器底部加入少量水以保持 濕度。用土壤熏蒸抽真空裝置抽真.空，在-MPa真空度下使氯仿劇烈沸騰35 min。關(guān)閉真 空干燥器閥門，移置25c黑暗條件下熏蒸24 h,將熏蒸過的土壤轉(zhuǎn)移到另一個干凈的真空干 燥器中，反復抽真空（-MPa） 6次，每次3 min

7、,徹底除去土壤中的氯仿，直到無氯仿味為 止。否則，殘留在土壤中的氯仿將影響分析結(jié)果。熏;蒸的同時，另稱取等量的土壤3份，置 于另一干燥器中，除不加入去乙醉氯仿進行熏;蒸外，其他操作與熏蒸土壤一樣，作為“對照” 土壤。（3）提取將熏蒸土壤無損地轉(zhuǎn)移到125 ml聚乙烯提取瓶中，加入80 ml mol LK2sO4, 上水比為 1:4 （w:v）,振蕩（25C, 300 rrnin-1）浸提30 min,用中速定量濾紙過濾于125 ml塑料瓶 中。在熏蒸開始的同時，另稱取等量的3份不熏蒸土壤于125 ml聚乙烯提取瓶中，加入80 ml mol L*2sO4同上浸提。同時做3個不加土壤的試劑空白。浸

8、提液應(yīng)立即分析，或在-18C 下保存。要注意的是低溫（-18）下保存的上壤浸提液解凍后會出現(xiàn)一些白色沉淀，據(jù)推測為 CaS04和K2so4,對浸提液中有機碳測定沒有影響，可不必除去這些白色沉淀（Brookes等， 1985）,但解凍后也應(yīng)立即測定，且在取樣前應(yīng)將浸提液徹底混勻。（4）測定取10 ml土壤提取液于40 ml樣品瓶中（注意解凍的浸提液在取樣前應(yīng)徹底混勻），加 入10 ml六偏璘酸鈉溶液（pH ），使提取液中的沉淀（CaSCU和K2soJ全部溶解。采用Phoenix 8000碳-自動分析儀測定樣液中的有機碳含量。先采用2 mm細管向樣液中通入高純度氮氣 5-10 min,先除去溶解在

9、樣液中的部分COz,樣液再進入無機碳排除管進一步排除殘留的 C02再進入紫外氧化室，在過硫酸鉀溶液和磷酸溶液作用下樣液中的有機碳全部氧化為 C02,產(chǎn)生的C02經(jīng)純化后再通過紅外檢測器測定。詳細操作步驟參見儀器使用說明。標準碳工作曲線：分別吸取0 ml濃度為1000 mg CL-】鄰苯二甲酸氫鉀標準溶液于100 ml容量瓶中，用高純度去離子水定容。即得到0、20、40、60、80、100 mg C L”系 列標準碳溶液。分別吸取上述不同濃度度的標準碳溶液10 ml于40 ml樣品瓶中，按上述相 同方法測定。（5）結(jié)果計算:土壤微生物量碳：Bc=Ec/kEC式中：Ec=熏蒸上壤提取的有機碳-不熏

10、蒸土壤提取的有機碳kEC為轉(zhuǎn)換系數(shù)，取值。二、土壤微生物生物量氮（氯仿熏蒸一KzS?！碧崛×鲃幼⑸涞治鰞x器法）1、試劑（1）去乙醇氯仿制備：同上（2）硫酸鉀提取劑匕（K2so。= mol L-1：同上（3）硫酸絡(luò)鉀還原劑：稱取50.0 g分析純硫酸銘鉀KGr?S04?z,溶于200 ml分析純濃硫 酸，用蒸偏水稀釋到1L。?（4）硫酸銅溶液匕（CuSOj = mol L-1：稱取30.324 g分析純硫酸銅（CuSO/溶于蒸儲 水并定容至1 L。（5）氫氧化鈉溶液c （NaOH） =10molL-1：稱取400 g分析純氫氧化鈉溶于蒸儲水并定 容至1L。（6）氫氧化鈉溶液c （NaOH） =

11、4molL-1：稱取160g分析純氫氧化鈉溶于雙蒸水并定容 至1L,使用前用真空抽濾瓶（膜孔徑口 m）過濾。（7）氫氧化鈉溶液c （NaOH） = molL-1 取ml 4 moi W NaOH用去離子水稀釋至1 L（8）硼酸溶液（H3BO4） = 2 g 100 ml-1）：稱取20.0g分析純硼酸（H3BO4）溶于蒸懦 水定容至1 L。（9）硫酸溶液匕（H2so4）= mol L1:取ml分析純濃硫酸（H2SO4 P = 1.84 g ml-1）用 蒸溜水稀釋到IL,此溶液H2s04濃度為moll,將該溶液稀釋10倍即可得到mol L硫酸 溶液。再用mol 1標準硼砂溶液標定其準確濃度。（

12、10）標準硼砂溶液c （Na2BdO7?10H2O） = mol L-1：先將分析純硼砂（Na2B4O7?10H2。） 在55蒸儲水中重結(jié)晶，過濾后得到的結(jié)晶放入裝有食糖和氯化鈉飽和溶液燒杯的干燥器 中（相對濕度70%）干燥。準確稱取經(jīng)重結(jié)晶和干燥的硼砂38.13672 g,溶解于蒸儲水并定 容至1L。（11）指示劑貯存液：稱取1.0 g氨混合指示劑溶解于10 ml mol L-1 NaOH和10 ml 95% 乙醇混合液中，用去離子水定容至200 mL該貯存液可存放1個月。（12）指示劑溶液：取10 ml指示劑貯存液用去離子水稀釋并定容至500 ml,用真空抽濾 瓶（膜孔徑um）過濾。注意：

13、此溶液應(yīng)使用前一天配制，最多可使用1周。（13）標準氯化錢貯存液）（NH4CI） =1000 UgNml-1：稱取經(jīng)105c烘23小時的分 析純氯化錢3.8190 g溶于去離子水中并定容至1 Lo此貯存液可穩(wěn)定保存數(shù)月。（14）標準氯化核溶液（NH4CI） =50 UgNml-1： MX 10 ml 1000 UgNm-氯化鉉用去 離子水稀釋至200 mlo此溶液最多保存7 do2、儀器設(shè)備流動注射氮分析儀（FIAStar5000,丹麥福斯公司）、真空抽濾瓶（膜孔徑R m）、容量瓶（100 ml）、其他儀器設(shè)備同上。3、操作步驟（1）土壤前處理、熏蒸、提取同上。（2）提取液中硝態(tài)氮還原：吸取m

14、l熏蒸與不熏蒸土壤m(xù)ol LK2s04浸提液于250 ml消 化管中，加入10 ml硫酸銘鉀還原劑和300 mg鋅粉，至少放置2 h后再消化。研究結(jié)果表 明函蒸與不熏蒸上壤提取液中硝態(tài)氮含量差異很小，在測定土壤MB-N時，可以不包括硝態(tài) 氮，即省略提取液中硝態(tài)氮還原過程。（3）消化：方法I :吸取ml熏蒸與不熏蒸上壤m(xù)ol UK2sO4浸提液（或經(jīng)還原反應(yīng)后 的浸提液）于250 ml消化管中，加入ml mol 1 CuSCU溶液、5 ml分析純濃硫酸、及少量 防瀑沸的顆粒物（如經(jīng)濃硫酸處理并洗滌后烘干的瓷片，0.5 cm大?。?，混合液消化變清后 再回流3h。（4）消化液中氮測定：消化液冷卻后，

15、用去離子水洗滌轉(zhuǎn)移到100 ml容量瓶中，至體枳 大約為70 ml,待再冷卻后慢慢加入10 ml 10 mol LNaOH溶液中和部分H2s。4,邊加邊充分 混勻（以免因局部堿濃度過高而引起消化液中Nm+的損失），再用去離子水定容至100 ml。 溶液中NH1含量采用流動注射氮分析儀（FIAStar5000型）測定。采用40 口1樣品圈，KTN 擴散膜（耐強酸和強堿），載液為去離子水，試劑I為4moi LNaOH溶液，試劑II為指示劑 溶液。校正曲線溶液制備：分別取0 ml50 UgN m尸標準氯化鉞溶液于100 ml容量瓶中，分別用去離子水洗滌轉(zhuǎn)移1個空白消化液于容量瓶中，其余操作步驟同樣品

16、，用去離子 水定容至100 ml,即得濃度分別為0 UgN ml1系列標準氯化鏤溶液，采用測定KTN方法模塊測定和制備工作曲線，校正曲線溶液最少應(yīng)每個月制備一次。其他具體操作參見儀 器使用說明。（5）計算：土壤 MB-N= EN/kEN式中：En=熏蒸土壤提取的全氮-不熏蒸上壤提取的全氮：kEN為轉(zhuǎn)換系數(shù)，取值。三、土壤微生物生物量磷（氯仿熏蒸-NaHCS提取-Pi測定-外加Pi校正法）L試劑（1）磷酸二氫鉀溶液P （KH2Po4）=250 UgPml1：稱取 LO984 g 經(jīng) 105c 烘 2 3 h 的 分析純KH2Po4,溶于蒸播水并定容至1 L。（2）碳酸氫鈉浸提液c （NaHCO3

17、） = mol匚】，pH ：稱取42.0 g分析純碳酸氫鈉溶于 800 ml蒸鐳水，用ImoIBNaOH調(diào)節(jié)溶液pH至，再蒸僧水定容至1 L。該浸提液不能放置 過久，否則因釋放CO2使溶液pH值升高。（3）硫酸溶液c （H2so4）= mol L-1：量取 ml 分析純濃硫酸（H2so4，P = 1.84g ml-1）, 用蒸僧水稀釋定容至500 ml即可。（4）鋁酸核溶液P?N&?6Mo?024 = 4gl00m尸:稱取20.0 g分析純鋁酸鏤溶于蒸儲水， 定容至500 ml,保存于耐熱玻璃瓶中。（5）抗壞血酸溶液c （C6H8。6）= mol L-1：稱取1.32 g抗壞血酸溶于75 ml

18、蒸謠水即可。 由于抗壞血酸極易氧化，因此必須在使用當天配制。（6）酒石酸錨鉀溶液P （Sb） =lmg ml-1：稱取0.2743 g分析純酒石酸睇鉀溶于蒸馀水,定容到100 mL（7）混合顯色液配制：取上述125 ml硫酸溶液與ml鋁酸鐵溶液徹底混合，再加入75 ml 抗壞血酸溶液和ml酒石酸睇鉀溶液，混勻。此溶液保存時間不宜超過24 h。（8）標準磷酸二氫鉀溶液P （KH2POd） =4 UgPml-1：稱取經(jīng)105烘23 h的分析純 磷酸二氫鉀0.1757 g,溶于蒸儲水，加入少量硫酸，用蒸儲水定容至1L。得到濃度為40 U gP ml標準磷貯存液，置4c條件下保存。取50 ml貯存液稀釋至500 ml,即得到濃度為4 u gP mH標準磷溶液，此溶液不宜久存。2 .儀器設(shè)備分光光度計（UV8500H型）、離心機、塑料浸提瓶（125 ml）,容量瓶（25 ml）、燒杯（25 ml）、熏蒸、培養(yǎng)、提取等設(shè)備同上。3 .操作步驟（1）土壤前處理：同上。（2）熏蒸和浸提：稱取相當于4.0g烘干基重經(jīng)前處理的新鮮上壤（5.0g）3份，分別置于 25 ml燒杯中，用去乙醉氯仿熏蒸24 h,除去氯仿。將土壤無損轉(zhuǎn)入125 ml塑料提取瓶中， 加入80ml molL，NaHCO3浸提液（上水比1:20）,置于往復式振蕩器中振蕩浸提30 min （300 r min-1）。