AgilentHPLC儀器組成及基本操作步驟

1、1 Agilent 1200 HPLC Agilent 1200 HPLC 儀器組成及基本操作步驟 Agilent 1200 HPLC Agilent 1200 HPLC 結(jié)構(gòu)圖 高效液相色譜法（HPLCHPLC：是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，以高壓輸 送流動相，采用高效固定相及高靈敏度檢測器， 發(fā)展而成的現(xiàn)代液相 色譜分析方法。它具有分離效率高、選擇性好、分析速度快、檢測靈 敏度高、操作白動化和應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)。 一. 溶劑瓶裝置 溶劑 使用棕色玻璃瓶會避免藻類的生長； 所用的水為重蒸水；溶劑選用色 譜純，使用前要用 0.22 v m0.22 v m 的過濾膜過濾；使用新鮮配制的流動相， 特別

2、是水溶劑或鹽緩沖液，建議不超過兩天；避免溶劑瓶暴露在直射 陽光1.溶劑（流動相）一 真空脫氣機(jī) 3、手動進(jìn)樣器 4、柱溫箱 2,輸液系統(tǒng) （四元泵） 2 下。 避免使用下述可腐蝕鋼鐵的溶劑： 堿金屬鹵化物及其酸溶液 （如：碘化鋰、氯化鉀等） ；高濃度無機(jī)酸， 如硝酸、硫酸；可能含有過氧化物的色譜醇酬 （如 THFTHF 二氧六環(huán)、 二丙基乙酬）。這些在 使用前必須用干燥氧化鋁過濾除去過氧化物； 含強(qiáng)絡(luò)合劑的溶液（如 EDTAEDTA 乙二胺四乙酸）；四氯化碳與 2 2- -異丙醇 或四氫味喃的混合液。 二. 在線脫氣裝置3 溶用RK箱 輸出毛蜩官至自動謎樣器(G1312-67306) MCCV

3、 波紋康褊管的掖頭【5。死”4孫，再訂購包裝，5浦 在線脫氣機(jī)工作原理 4 總覽（只癡四個梆通道中的一個） 真空箱 四元泵真空脫氣機(jī)由一個四通道（有四個管狀塑料膜）真空箱和一個 真空泵構(gòu)成。打開真空脫氣機(jī)的電源開關(guān)后，控制電路即開啟真空泵， 真空泵運(yùn)行使真空箱內(nèi)產(chǎn)生部分真空。 真空度由壓力傳感測定，根據(jù) 傳感器信號，真空脫氣機(jī)通過運(yùn)行或關(guān)閉真空泵來維持真空度。 溶劑瓶中的溶劑在 LCLC 泵的抽動下流過真空箱內(nèi)的特殊管狀塑料膜。 當(dāng)溶劑經(jīng)過真空管時(shí)，溶劑中溶解的氣體將滲透過塑料膜進(jìn)入真空 箱，到達(dá)真空脫氣機(jī)出口時(shí)，溶劑幾乎被完全脫氣而不含有任何氣體。 三. Agilent 1200 Agile

4、nt 1200 四元泵5 6 四鬲蹣 1 2 3 4 當(dāng)鹽溶液和有機(jī)溶劑混合時(shí)，鹽溶液可能與有機(jī)溶劑完全混溶， 而不 會出現(xiàn)沉淀。但是在梯度閥的混合點(diǎn)，重力作用使鹽顆粒沉淀下來。 通常，閥的 A A 通道用于水相/ /鹽溶液，而泵的 B B 通道用于有機(jī)溶劑。 如果使用的是這樣的配置，鹽將落回到鹽溶液中，并被溶解。 A: A: 水相 B:B:甲醇 C:C:乙臘 D:D:緩沖鹽 當(dāng)泵頭安裝有沖洗附件時(shí)，由于該附件中也有密封墊，這樣就會增 加活塞桿運(yùn)動時(shí)的阻力。所以開泵前一定要打開 sealseal- -wash,wash,用 10% 10% 異丙醇沖洗泵。 10% 10%異丙醇有助于降低水的表面

5、張力， 并有抑菌作用。不要用其它 溶劑代替。 7 四. 手動進(jìn)樣器 先使閥處于裝樣(load )load )位置，用微量注射器將試樣注入貯樣管 (sampling loop (sampling loop )。進(jìn)樣時(shí)，轉(zhuǎn)動閥芯至進(jìn)樣(injection injection )位置， 貯樣管內(nèi)的試樣由流動相帶入色譜柱。定量環(huán)為 20 v l20 v l。 五. 檢測器 按其適用范圍檢測器可分為通用型和專屬型兩大類。 專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質(zhì)， 如紫外檢測器和熒光 檢測器，它們只對有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng)。 通用型檢測器檢測的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì)，如示差折光和蒸發(fā) 光散射檢測

6、器。 紫外檢測器的工作原理是朗伯-比爾定律。紫外檢測器包括固定波長、 可變波長和光電二極管陣列檢測器。 可變波長紫外檢測器一般采用免燈為光源，能夠按需要選擇組分的最 大吸收波長為檢測波長，從而提高靈敏度。 基本操作步驟 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜋z測樣品的性質(zhì)，選擇相應(yīng)的分析 色譜柱； 配制分析的樣品和流動相，選用色譜純流動相或用 0.220.22訴訴m m 的過 濾膜過濾(進(jìn)口甲醇和乙臘不用過濾) ； 檢驗(yàn)儀器和計(jì)算機(jī)的電源線，數(shù)據(jù)線是否連接完好。 開機(jī) 8 將所用的通路小心放入試劑瓶中（防止濾頭破裂），色譜柱按流速 的方向裝好，要擰緊并在柱頭和柱尾的下面墊上濾紙； 先打開總電源的開關(guān)，然后

7、打開計(jì)算機(jī)的電源，待計(jì)算機(jī)運(yùn)行穩(wěn)定； 從上到下依次打開脫氣機(jī)、泵、柱溫箱、檢測器的電源開關(guān)； 待儀器白檢完成后，雙擊桌面上的“聯(lián)機(jī)”圖標(biāo)，打開工作站（如 圖一所示） 設(shè)定參數(shù) 更改樣品信息：單擊運(yùn)行控制下的樣品信息彈出對話框 （如圖二所 示），更改操作者姓名、子目錄和所存儲的文件的文件名。 設(shè)置試劑瓶的填充量：單擊界面上的試劑瓶的圖標(biāo)，設(shè)定溶劑的體 積（如圖三所示） 啟動各個模塊：點(diǎn)擊啟動泵、柱溫箱的快捷鍵，啟動泵和柱溫箱， 等柱壓穩(wěn)定后才能啟動檢測器。 設(shè)置柱溫箱： 在圖標(biāo)上點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵，單擊設(shè)置柱溫箱出現(xiàn)對話 框（如圖四所示）然后設(shè)置實(shí)驗(yàn)所需要的柱溫。 脫氣：單擊泵的圖標(biāo)，點(diǎn)擊設(shè)置泵，彈出

8、對話框（如圖五所示） 先將閥旋開 1212 圈，設(shè)置流速為 5ml/min,5ml/min,含量為 100100 睬次 purgepurge 各 個管路，一般先purgepurge水相再purgepurge有機(jī)相。每個管路purge 35purge 35分 鐘，purgepurge時(shí)一定要認(rèn)真檢查濾頭和管路中是否殘留有氣泡。 Purge Purge 完后，將流速設(shè)為 1ml/min1ml/min，并迅速將閥擰緊，用 100100 掰醇或乙臘沖 洗柱子，待柱壓穩(wěn)定后可以打開檢測器。 單擊檢測器的圖標(biāo)，然后單擊設(shè)置 VWVW 晡號可出現(xiàn)對話框（如圖六 所9 示），可以設(shè)置所用的波長。 注意：若流動

9、相里有緩沖鹽就先用 100100 用醇或乙臘沖洗柱子半個小 時(shí)然后還要用 9595 咖和 5%5%屯甲醇或純乙臘沖洗柱子最少 1515 分鐘，然 后再用你所需要的流動相比例走基線?；€穩(wěn)定后就可以進(jìn)樣分析。 在對話框中可以設(shè)置梯度洗脫（如圖八所示） 數(shù)據(jù)分析：雙擊桌面上的脫機(jī)圖標(biāo)，出現(xiàn)對話框然后單擊文件夾圖 標(biāo)（如圖九所示） 關(guān)機(jī) 樣品分析完后，用 100100 用醇或乙臘沖洗柱子最少半個小時(shí)。如果 流動相里有緩沖鹽要先用 9595 咖和 5%5%屯甲醇或乙臘沖柱子半個小時(shí)， 然后再用 100%?100%?醇或乙臘沖洗柱子半個小時(shí)。 沖洗完后，將流速設(shè)為 0ml/min,0ml/min,將水相

10、中的濾頭放入有機(jī)相中， 將閥打開，設(shè)流速設(shè)為 5ml/min5ml/min，含量為 100% purge100% purge 水相的管路。 若用的有緩沖鹽，要先將濾頭放入純水中 purge35purge35 分鐘，然后再放 入有機(jī)相中 purge35purge35 分鐘。各個管路 purgepurge 完后，將閥擰緊。 依次關(guān)閉界面上的泵、柱溫箱和檢測器。關(guān)閉聯(lián)機(jī)和脫機(jī)的界面， 然后關(guān)閉計(jì)算機(jī)。 從下到上依次關(guān)閉儀器的各個模塊的電源開關(guān)，然后換下色譜柱。 關(guān)閉總電源。 注意事項(xiàng)： 配制流動相所用的水要為重蒸水，新鮮配制，使用前要用 0.220.22訴訴 m m的過濾膜過濾。要用色譜級的有機(jī)試劑

11、。 10 有機(jī)系和水系的濾膜要分開，有機(jī)系的濾膜也可以過濾水系，但是 水系的濾膜不能過濾有機(jī)系，有機(jī)相會腐蝕濾膜。 供試品一定要用 0.45 v m0.45 v m 的濾頭過濾，否則會引起進(jìn)樣閥阻塞。 泵啟動前要開啟 sealseal- -washwash，用 1010 得丙醇沖洗泵。設(shè)流速為一分 鐘三滴，若流動相中含有緩沖鹽，設(shè)流速為三秒鐘一滴。 流動相使用前要進(jìn)行脫氣，脫氣前一定要將閥打開 1212 圈，purgepurge 時(shí)要仔細(xì)檢查濾頭和管路中是否有氣泡，脫氣完后將流速設(shè)為 1ml/min1ml/min 后，迅速將閥擰緊（不要擰的過緊）。注意觀察壓力，若壓 力大于 10bar,10b

12、ar,要與管理員聯(lián)系。 一定要將柱頭和柱尾擰緊，防止漏液。如果漏液，將流速設(shè)為 0ml/min0ml/min，然后再將柱子裝好。用 100100 用醇或乙臘沖洗柱子時(shí)，注意 觀察柱壓如果柱壓過大，要將流速設(shè)為 0ml/min ,0ml/min ,然后檢查原因，防 止將臟東西流入檢測器。 為保護(hù)檢測器，等柱壓穩(wěn)定后再開啟檢測器。 進(jìn)樣品前要修改樣品信息，否則會將上一個樣品的信息覆蓋。 進(jìn)樣前后都要用甲醇清洗進(jìn)樣針和進(jìn)樣閥。 樣品分析完后，為保護(hù)濾頭，要將水相中的管路放入有機(jī)相中 purge35 purge35 分鐘。 為什么溶劑和樣品要過濾？ 溶劑和樣品過濾非常重要，它會對色譜柱、儀器起到保護(hù)作

13、用， 消除由于污染對分析結(jié)果的影響。 色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小 顆11 粒會使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。 儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損， 同時(shí)也 會增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。 為什么 HPL3HPL3 緩沖鹽時(shí)要加在線 SealSeal- -washwash 選項(xiàng)？ HPLCHPLC 用緩沖鹽時(shí)，由于泵頭內(nèi)的緩沖鹽溶液存在高壓析鹽現(xiàn)象， 析出的細(xì)小鹽粒非常堅(jiān)硬，它附著在藍(lán)寶石活塞桿上，隨著藍(lán)寶石活 塞桿的往復(fù)運(yùn)動，容易產(chǎn)生劃痕，并磨損密封墊，造成漏液等故障現(xiàn) 象。在線SealSeal- -washwash 選項(xiàng)能有效的帶走可能存在的緩沖鹽結(jié)晶。 緩沖 鹽的濃度在0.1mol0.1mol 或大