熒光光譜分析實驗講義

1、實驗 熒光光譜分析一、實驗目的與要求：1. 了解熒光分光光度計的構造和各組成部分的作用；2. 掌握熒光分光光度計的工作原理；3. 掌握激發(fā)光譜、發(fā)射光譜及余輝衰減曲線的測試方法。二、基本概念1. 發(fā)射光譜 是指發(fā)光的能量按波長或頻率的分布。通常實驗測量的是發(fā)光的相對能量。發(fā)射光譜中，橫坐標為波長（或頻率） ，縱坐標為發(fā)光相對強度。 發(fā)射光譜常分為帶譜和線譜 ，有時也會出現(xiàn)既有帶譜、又有線譜的情況。2. 激發(fā)光譜是指發(fā)光的某一譜線或譜帶的強度隨激發(fā)光波長 （或頻率）變化的曲線。 橫 坐標為激發(fā)光波長，縱坐標為發(fā)光相對強度。激發(fā)光譜反映不同波長的光激發(fā)材料產(chǎn)生發(fā)光的效果。 即表示發(fā)光的某一譜 線或

2、譜帶可以被什么波長的光激發(fā)、 激發(fā)的本領是高還是低； 也表示用不同波長 的光激發(fā)材料時，使材料發(fā)出某一波長光的效率。3. 余輝衰減曲線是指激發(fā)停止后發(fā)光強度隨時間變化的曲線。 橫坐標為時間， 縱坐標為發(fā)光強度 （或相對發(fā)光強度）。三、測試儀器激發(fā)光譜、發(fā)射光譜及余輝衰減曲線的測試采用日本島津 RF-5301PC型熒光 分光光度計。從150W氙燈光源發(fā)出的紫外和可見光經(jīng)過激發(fā)單色器分光后，再經(jīng)分束器 照到樣品表面， 樣品受到該激發(fā)光照射后發(fā)出的熒光經(jīng)發(fā)射單色器分光， 再經(jīng)熒 光端光電倍增管倍增后由探測器接收。 另有一個光電倍增管位于監(jiān)測端， 用以倍 增激發(fā)單色器分出的經(jīng)分束后的激發(fā)光。光源發(fā)出的

3、紫外 -可見光或者紅外光經(jīng)過激發(fā)單色器分光后，照到熒光池中 的被測樣品上，樣品受到該激發(fā)光照射后 發(fā)出的熒光經(jīng)發(fā)射單色器分光，由光 電倍增管轉換成相應電信號， 再經(jīng)放大器放大反饋進入 A/D 轉換單元，將模擬電 信號轉換成相應數(shù)字信號，并通過顯示器或打印機顯示和記錄被測樣品譜圖。四、樣品制備 液體試樣 液體試樣應放入專用的液體樣品槽中，固定到樣品座中。五、測試過程（一） RF-5301PC熒光分光光度計測試發(fā)射、激發(fā)光譜及余輝衰減曲線步驟 先開機：打開Xe燈開關 和 主機開關。開電腦。雙擊 電腦桌面的 “RFPC程 序快捷鍵 進入測試程序， 會出現(xiàn) 初始化界面， 儀器依次檢測 ROM、 RAM

4、、 EEPROM 激發(fā)狹縫、發(fā)射狹縫、激發(fā)單色器、發(fā)射單色器和基線，初始化完成后，進入到 測試界面。1. 發(fā)射光譜的測試 第一步：參數(shù)設置。 點擊 Configure 設置 / Parameter 參數(shù)，進行測試參數(shù)設置：(1) 第一行為光譜類型。選擇“ Emission ”發(fā)射光譜(2) 第二行為激發(fā)波長。輸入激發(fā)波長(3) 第三行為發(fā)光波長范圍。 輸入掃描的起始波長和終止波長 (對于未知樣， 也 可選擇可見光全波段 400760nm)(4) 第四行為記錄范圍。輸入縱坐標的最小和最大顯示值(5) 第五行為掃描速度。由快至慢有 6 種速度選擇(6) 第七行為狹縫寬度。 可分別選擇 激發(fā)和發(fā)射狹

5、縫 寬度，對于發(fā)光較弱的樣 品，測試時可以適當增大狹縫寬度。(7) 第八行為測試靈敏度選框。(8) 第九行為響應時間選框，由快至慢有 9 種速度選擇(9) 參數(shù)設置完成后，點擊“ OK”。第二步：光譜測試。點擊屏幕右下角“ Start ”按鈕，開始發(fā)射光譜測試。測試完成后，屏幕會自動 彈出一個保存界面：上欄可輸入文件名稱，下欄可輸入注解，若輸入注解，則該 注解將會在打印出的報告中顯示出來。輸入文件名后，點擊“Save”保存。注意：這種保存只是臨時保存， 關機后將消失。 永久保存需使用 File / Save as， 選擇存儲路徑和文件夾，點擊“Save As”保存。保存后的文件，擴展名是“.S

6、PC, 只能用“ RF-5301PC程序打開。若想將測試結果轉換為數(shù)據(jù)，以利于使用其他 軟件作圖和編輯，需進行數(shù)據(jù)轉換。第三步：自動尋峰。 對于測試所得的發(fā)射光譜，程序能夠進行自動尋峰。步驟是：點擊 Manipulate 操作 / 選擇 Peak pick / 鼠標左鍵點住屏幕下方彈 出的窗口，上拉，調(diào)整窗口大小，即可讀出峰值。第四步：數(shù)據(jù)轉換。點擊 File / Data translation / AscII Export /則詢問轉換哪個通道？選擇通道后，點擊0K則數(shù)據(jù)轉換過程完成。轉換后的擴展名為“ .ASC”的文件自動保存在了 C盤/ RFPC文件夾/ Data子 夾中。第五步：數(shù)據(jù)

7、處理。打開Origin軟件，點擊工具菜單中的“導入ASC碼文件”快捷鍵，按照路徑 尋 找 我們剛剛轉換的 擴展名為“ .ASC” 的文件，點擊“打開” ，則數(shù)據(jù)被導入。 點擊屏幕下方的“直線”工具，即可完成作圖。 調(diào)整 橫、縱坐標的字號。 輸入 橫、 縱坐標名稱和單位。數(shù)據(jù)處理完成后，可直接復制到Word文件中。2. 激發(fā)光譜的測試 第一步：參數(shù)設置。點擊 Configure 設置 / Parameter 參數(shù)，進行測試參數(shù)設置：(1) 在光譜類型選框中，選擇“ Excitation ”激發(fā)光譜，選擇后，下面幾行選項 隨之變化。(2) 第二行為監(jiān)測的發(fā)光波長。通常，選擇發(fā)射光譜的峰值位置作為監(jiān)

8、測波長。(3) 第三行為激發(fā)波長范圍。 輸入掃描的起始波長和終止波長 (通常終止波長應小于發(fā)射光譜的短波邊，但允許有適量交叉)(4) 以下“記錄范圍”、“掃描速度”、“狹縫寬度”、“靈敏度”及“響應時間”的 設置，與發(fā)射光譜測試時的設置相類似。(5) 參數(shù)設置完成后，點擊“ OK”。第二步：光譜測試。點擊屏幕右下角“ Start ”按鈕，開始激發(fā)光譜測試。測試完成后，自動尋峰、 數(shù)據(jù)轉換、數(shù)據(jù)處理的操作與發(fā)射光譜相類似。3. 余輝衰減曲線的測試 第一步：參數(shù)設置。點擊“ Acquire Mode ,在下拉菜單中選擇“ Time Course”模式，進行測試參數(shù) 設置。其中，參數(shù)設置對話框上半部分：激發(fā)波長、監(jiān)測發(fā)光波長、狹縫寬度、 靈敏度、響應時間及記錄范圍的設置與發(fā)射光譜、 激發(fā)光譜測試時的設置相類似。 參數(shù)設置對話框下半部分： 反應時間是指余輝衰減曲線的測試時間， 即橫坐標的 掃描時間段；時間模式可選自動或手動；時間單位默認為秒。參數(shù)設置完成后， 點擊“ OK”。第二步：余輝衰減曲線測試點擊屏幕右下角“ Start ”按鈕，開始余輝衰減曲線