光譜的概念ppt課件

1、光譜分析的基本概念光譜分析的基本概念1概述概述2光譜的基本理論光譜的基本理論3光譜儀器的基本結(jié)構(gòu)與功能光譜儀器的基本結(jié)構(gòu)與功能4光譜分析的基本方法光譜分析的基本方法5影響光譜分析的主要因素影響光譜分析的主要因素1概述概述1.1什麼叫光分析什麼叫光分析? 凡是利用輻射能與待測(cè)物質(zhì)相互作用后產(chǎn)生的輻射信號(hào)或引起信號(hào)的變化而采用的分析方法稱為光分析。1.2光譜的分類：光譜的分類： 光分析又可分為非光譜分析和光譜分析兩類。(1)光譜分析光譜分析：是以光吸收、發(fā)射和散射等作用而建立起來(lái)的光分析方法，稱為光譜分析。它是通過(guò)光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分析的方法。屬于這類分析的有原子吸收光譜、分子吸收光譜、紫外

2、可見(jiàn)吸收光譜、紅外吸收光譜、熒光發(fā)射光譜、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光等。(2)非光譜分析非光譜分析：是一些不以光的波長(zhǎng)為特征信號(hào)的分析方法，只是通過(guò)測(cè)量電磁輻射的某些基本性質(zhì)(反射、折射、干涉、衍射、偏振等)的變化的分析方法。屬于這類分析的有折射法、干涉法、散射法、旋光法，X衍射法。1.3光譜分析的特點(diǎn)：光譜分析的特點(diǎn)： 靈敏度高：可達(dá)1021/g 應(yīng)用廣：適用于許多化合物的分析鑒定 專一性強(qiáng)：對(duì)物質(zhì)的特殊結(jié)構(gòu)在特定的條件下發(fā)生特異性吸收1.2光譜分析的模式：光譜分析的模式： 1.2.1比色分析比色分析 在一定濃度范圍內(nèi),溶液中有色物質(zhì)的濃度與溶液顏色的深淺成正比.根據(jù)溶液顏色的深淺度,測(cè)定溶液中有色

3、物質(zhì)含量的方法,稱為比色分析法. 1.2.2分光光度分析分光光度分析： 分光光度分析法是根據(jù)溶液中被測(cè)物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸收能力強(qiáng)弱進(jìn)行的分析方法.通過(guò)該物質(zhì)的吸收光譜曲線的特征來(lái)鑒別物質(zhì)的分析方法。1.3光譜分析常用的符號(hào)及其物理意義光譜分析常用的符號(hào)及其物理意義(1). I0 : 入射光強(qiáng)度, 提供穩(wěn)定的光源(單色光)(2). I : 透過(guò)單色光, 透過(guò)光量的大小與溶液濃度和光程有關(guān)(3). L: 光程, 指光在溶液中經(jīng)過(guò)的實(shí)際距離,常用cm表示(4). C: 溶液濃度, 常用摩爾濃度或百分濃度表示(5). T: 透光度,又稱透光率,是透過(guò)光和入射光強(qiáng)度的比值(6). T% : 透過(guò)光的百

4、分率,在比色分析中,將透過(guò)一定量光視為100%(7). K: 消光系數(shù),是指溶液對(duì)光吸收的比例常數(shù),是指在一定的濃度和波長(zhǎng)等條件下物質(zhì)的光吸收值. K值取決于溶質(zhì)性質(zhì),入射光波長(zhǎng)和溫度(8). A: 吸光率,又稱光密度(O.D.)或消光度(E),表示溶液吸收光的強(qiáng)弱或吸收程度,A值越大溶液對(duì)光吸收的程度越大(9).: 摩爾消光系數(shù),溶液濃度為1mol/L,光程厚度為1cm時(shí)的消光系數(shù),其單位是L/mol.cm 值是物質(zhì)的特征常數(shù),由物質(zhì)的性質(zhì)與待測(cè)光波長(zhǎng)而定. 同一物質(zhì)在不同的波長(zhǎng)所測(cè)得的值不同.一般采用值最大的波長(zhǎng)進(jìn)行比色測(cè)定.(10). E%1cm百分消光系數(shù), 是指被測(cè)物質(zhì)的濃度以百分濃

5、度(W/V)表示時(shí)的消光系數(shù)。當(dāng)溶液濃度為1g/100ml,光程為1cm時(shí)的消光系數(shù),其單位是100ml/g.cm.如：trypsin, E%1cm = 13.5, 溶液濃度為1g/100ml,光程為1cm,波長(zhǎng)為280nm時(shí)，其百分消光系數(shù)A = 13.5 E%1cm值是生物大分子常用的消光系數(shù)，由于生物大分子的分子量太大，一般不用mol濃度，而用百分濃度表示，所以測(cè)定時(shí)用E%1cm，它是表示生物大分子的一個(gè)特征常數(shù)。(11)S-桑德?tīng)?Sanddl)常數(shù)，表示在單位截面積內(nèi)能檢出物質(zhì)的最低含量，單位用ug/cm2表示。后來(lái)人們將此概念用來(lái)表示光學(xué)儀器的靈敏度，S被定為儀器檢測(cè)的最小極限，S

6、值越小儀器的靈敏度越高。1.4.光譜分析的術(shù)語(yǔ)：光譜分析的術(shù)語(yǔ)：1.4.1 單色光單色光： 當(dāng)一束混合光通過(guò)分光器后被分成單一波長(zhǎng)的光,稱為單色光。1.4.2光的互補(bǔ)性光的互補(bǔ)性： 有色溶液與相應(yīng)的單色光生成新的互補(bǔ)色 綠 黃 青 橙 白光 青藍(lán) 紅 藍(lán) 紫1.4.3 朗伯朗伯-比耳定律比耳定律(Lambert-Beer)也稱之為光吸收定律 A = KCL 朗伯-比耳定律同時(shí)反映了溶液厚度L和濃度C對(duì)光吸收的關(guān)系,其數(shù)值隨光的波長(zhǎng)、溶液濃度和溶液的性質(zhì)而定.1.4.4發(fā)射光譜發(fā)射光譜: 物質(zhì)經(jīng)輻射能照射被激發(fā)后，系統(tǒng)內(nèi)以光的形式釋放多余的能量產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)產(chǎn)生的光譜。 1.4.5吸收光譜吸收光

7、譜： 物質(zhì)在輻射能的照射下，系統(tǒng)吸收的能量所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)產(chǎn)生光譜.1.4.6散射光譜散射光譜： 物質(zhì)經(jīng)輻射能照射后,系統(tǒng)內(nèi)散射出來(lái)的能量產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)的光譜. 2光譜分析的基本理論光譜分析的基本理論2.1光譜產(chǎn)生的過(guò)程光譜產(chǎn)生的過(guò)程 構(gòu)成物質(zhì)的分子，原子或離子經(jīng)輻射能照射后物質(zhì)的總能量就會(huì)發(fā)生變化，在能量相互轉(zhuǎn)化的過(guò)程中產(chǎn)生輻射信號(hào)或引起輻射信號(hào)變化。根據(jù)產(chǎn)生的輻射信號(hào)或引起信號(hào)變化，均可進(jìn)行光譜分析。2.2光譜的分類光譜的分類 (1)發(fā)射光譜發(fā)射光譜: 構(gòu)成物質(zhì)的分子，原子或離子，受熱能或電能激發(fā)后系統(tǒng)發(fā)射的能量對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)產(chǎn)生的圖譜。發(fā)射光譜又分為線光譜、帶光譜、連續(xù)光譜. a.線光譜線光譜: 原

8、子或離子被激發(fā)產(chǎn)生的光譜,稱原子光譜或離子光譜。它是由不連續(xù)的明亮線條所組成光譜。 b.帶光譜帶光譜: 分子被激發(fā)產(chǎn)生的光譜，稱分子光譜。它是由數(shù)個(gè)光帶與暗區(qū)相間所組成光譜。 c.連續(xù)光譜連續(xù)光譜: 陽(yáng)光或燈光所發(fā)的光譜。它是由長(zhǎng)短波長(zhǎng)連續(xù)不斷順序排列組成光譜。(2).吸收光譜吸收光譜 ： 物質(zhì)受光照射后，系統(tǒng)吸收的能量所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)圖譜 。吸收光譜又分為原子吸收光譜、分子吸收光譜 a.原子吸收光譜原子吸收光譜：原子受光照射后吸收能量產(chǎn)生的光譜,稱原子吸收光譜。它是由不連續(xù)的明亮線條所組成光譜。 b.分子吸收光譜分子吸收光譜：分子受光照射后吸收能量產(chǎn)生的光譜，稱分子吸收光譜。是由數(shù)個(gè)光帶與暗區(qū)相

9、間所組成光譜 c 光吸收光吸收: 介質(zhì)有選擇地吸收某些波長(zhǎng)的光,經(jīng)棱鏡色散后所得到的光譜中,就出現(xiàn)一處或幾處暗的部分。這種通過(guò)介質(zhì)的透過(guò)光譜就稱為吸收光譜,可見(jiàn)-紫外分光光度法是分子吸收光譜,屬帶狀光譜。(3)散射光譜散射光譜： 散射光譜主要是以拉曼散射為基礎(chǔ)形成的光譜，它分布在紅外區(qū)屬于分子散射光譜。 拉曼散射是當(dāng)一束單色光與分子相互作用時(shí)，發(fā)生非彈性碰撞，光子與分子之間發(fā)生能量交換，光子不但改變了運(yùn)動(dòng)方向，同時(shí)光子的一部分能量傳遞給分子或分子的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能量傳遞光子，而改變了光子的頻率，這種散射過(guò)程稱為拉曼散射過(guò)程。 原子基態(tài) 激發(fā)態(tài)電子低能軌道 高能級(jí)軌道分子基態(tài) 激發(fā)態(tài) 低能級(jí) 高能級(jí)

10、在分子中，除了電子相對(duì)于原子核的運(yùn)動(dòng)外，還有核間相對(duì)位移引起的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)。這三種運(yùn)動(dòng)能量都是量子化的，并對(duì)應(yīng)有一定能級(jí)。上圖為分子的能級(jí)示意圖。分子總能量：E分子 = E電子 + E振動(dòng) + E轉(zhuǎn)動(dòng)2.3分子吸收光譜的產(chǎn)生分子吸收光譜的產(chǎn)生(1)分子的總動(dòng)能分子的總動(dòng)能物質(zhì)的分子吸收一定波長(zhǎng)的光產(chǎn)生特征吸收光譜,稱為分子吸收光譜(分子吸收光譜比較復(fù)雜)。不同能量的電磁波,可轉(zhuǎn)變?yōu)榉肿硬煌\(yùn)動(dòng)能。產(chǎn)生不同的能級(jí)，由相應(yīng)的能級(jí)產(chǎn)生相應(yīng)的分子光譜。(2)分子的能級(jí)與光譜分子的能級(jí)與光譜: 平動(dòng)能 平動(dòng)能級(jí) 轉(zhuǎn)動(dòng)能 轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí) 分子的轉(zhuǎn)動(dòng)光譜 振動(dòng)能 振動(dòng)能級(jí) 分子的振動(dòng)光譜 電子運(yùn)動(dòng)能 電子運(yùn)動(dòng)能級(jí)

11、分子的電子光譜 2.4分子光譜的分類分子光譜的分類(1) 分子轉(zhuǎn)動(dòng)光譜分子轉(zhuǎn)動(dòng)光譜:光子的能量被分子吸收后,轉(zhuǎn)變成分子的轉(zhuǎn)動(dòng)能,引起整個(gè)分子轉(zhuǎn)動(dòng),由原來(lái)的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)躍遷到較高的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的過(guò)程中,只吸收某一定能量的光子,從而產(chǎn)生吸收光譜. 分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)差在E = 0.05eV左右,遠(yuǎn)紅外及微波區(qū)屬分子轉(zhuǎn)動(dòng)光譜(2)分子振動(dòng)光譜分子振動(dòng)光譜: 光子的能量被分子吸收后,轉(zhuǎn)變成分子的振動(dòng)能,引起整個(gè)分子振動(dòng), 從而產(chǎn)生吸收光譜.轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)差在E = 0.05-1.0eV,中紅外屬分子振動(dòng)光譜 (3) 分子的電子光譜分子的電子光譜: 光子的能量被分子吸收后,轉(zhuǎn)變成分子的電子動(dòng)能, 由原來(lái)的電子能級(jí)躍遷到較高

12、的電子能級(jí), 從而產(chǎn)生吸收光譜. 分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)差在E = 1.0-2.0eV,可見(jiàn)光,紫外及遠(yuǎn)紫外屬分子的電子光譜 在生物化學(xué)分析中,最常用的光譜分析是分子的電子光譜.下面著重介紹分子的電子光譜.2.5分子的電子吸收光譜的機(jī)理分子的電子吸收光譜的機(jī)理(1).分子的化學(xué)鍵與電子分子的化學(xué)鍵與電子 有機(jī)化合物及生物大分子的紫外和可見(jiàn)光吸收光譜,取決于組成化合物的化學(xué)鍵及形成化學(xué)鍵的價(jià)電子.主要有以下三類形式。 H H HCCCH H O Ha. 形成單鍵的電子b. 形成雙鍵的電子c. 未形成化學(xué)鍵的n電子(未共享的電子對(duì))(2). 電子躍遷的方式電子躍遷的方式a.-: 在飽和價(jià)化合物中只有-的躍遷

13、,這種躍遷需要很高的能量. 因此,吸收光譜出現(xiàn)在遠(yuǎn)紫外區(qū)(小于170nm),如:甲烷,在125nmb.-: 這種未成鍵電子躍遷到高能軌道也需要很高的能量, 因此,吸收光譜出現(xiàn)在遠(yuǎn)紫外和紫外區(qū)(170-400nm),如 三甲胺,在225nmc.-: 含雙鍵的化合物的電子躍遷需要的能量較小,吸收光譜出現(xiàn)在近紫外和紫外區(qū)(200-400nm),如苯,在203nmd. n-:這種未成對(duì)的電子躍遷需要的能量更小,吸收光譜出現(xiàn)在近紫外和可見(jiàn)光區(qū)(200-750nm),如 亞硝基-n-丁烷, 在665nm2.6化合物中的發(fā)色基團(tuán)及助色基團(tuán)化合物中的發(fā)色基團(tuán)及助色基團(tuán)2.6.1發(fā)色基團(tuán)發(fā)色基團(tuán):有機(jī)化合物的某

14、些基團(tuán),在紫外或可見(jiàn)光區(qū)有特殊的吸收峰,這些基團(tuán)稱為發(fā)色團(tuán)(Chromophoric group)表一表一:常見(jiàn)的發(fā)色基團(tuán)常見(jiàn)的發(fā)色基團(tuán) 化合物發(fā)色基團(tuán)吸收峰波長(zhǎng)溶劑CH3COCH3酮基270.6乙醇CH3COH醛基293.4乙醇CH3COOH羧基204.0水CH3CONH2酰胺基208.0水CH3COCH硝基300.7乙醚C4H9NO亞硝基271.0乙醚C6H11SOCH3硫醚210.0乙醚C6H5CS C6H5硫醇620.0乙醚2.6.2助色基團(tuán)助色基團(tuán):有機(jī)化合物的某些基團(tuán)本身并不產(chǎn)生吸收峰,但與發(fā)色團(tuán)同存于一分子中時(shí),能引起吸收峰的位移和吸收強(qiáng)度改變,這些基團(tuán)稱為助色團(tuán)(auxochr

15、omic group)。表二表二:常見(jiàn)的助色基團(tuán)常見(jiàn)的助色基團(tuán) 化合物取代基吸收峰波長(zhǎng)苯 254.3甲苯甲基262.0氯代苯氯264.0苯甲酸羧基267.0苯酚羥基273.0苯胺胺基284.5 如苯的主要吸收峰是254.3nm,但苯分子中的一個(gè)氫 原子被甲基取代后生成甲苯,后者的主要吸收峰是262nm,吸收峰向波長(zhǎng)長(zhǎng)的方向發(fā)生位移,亦稱向紅發(fā)生位移. 如果吸吸收峰向波長(zhǎng)短的方向發(fā)生位移,亦稱向紫發(fā)生位移.3紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)3.1基本結(jié)構(gòu)及各部件功能基本結(jié)構(gòu)及各部件功能 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)主要有光源、單色器、樣品室、光電轉(zhuǎn)換器及顯示器五部分組成(圖2)。3.1.1光源光源:(

16、1)功能： 其作用是儀器提供合適的光源，較為理想的光源應(yīng)具備以下功能：a.在所用的波長(zhǎng)范圍內(nèi)能提供連續(xù)的輻射,即光源應(yīng)發(fā)射連續(xù)光譜b.輻射能隨波長(zhǎng)的變化盡可能小,且有足夠的強(qiáng)度c.具有良好的穩(wěn)定性， d.使用壽命要長(zhǎng)(2)類型： a. 紫外光源： 氫燈(190-360nm) 氘燈(180-500nm) 汞燈(200-700nm) b. 可見(jiàn)光源： 鎢燈(320-3200nm) 碘鎢燈(240-1200nm) 鈉燈(400-1000nm)3.1.2單色器單色器:(1).功能功能： 單色器是將混合光源分成單色光,它由單色器和狹逢兩部分組成(2).類型類型： a.濾光片單色器濾光片單色器: 濾光片單

17、色器是最簡(jiǎn)單,最廉價(jià)的單色器, 常在光電比色計(jì)中使用, 在分光光度計(jì)只是用來(lái)消除單色器的雜散光或用來(lái)校正波長(zhǎng).b.棱鏡單色器棱鏡單色器: 光學(xué)玻璃棱鏡(可用于可見(jiàn)紅外分光)石英玻璃棱鏡(可用于紫外可見(jiàn)紅外分光)人造藍(lán)寶石棱鏡(可用于紫外可見(jiàn)紅外分光)c.光柵單色器光柵單色器:透射光柵透射光柵:在玻璃或其它透明材料刻制平行線反射光柵反射光柵:在拋物線玻璃或鍍鋁金屬表面刻制平行線全息光柵全息光柵:根據(jù)雙光束干涉的原理制成的干涉條紋 全息光柵刻制方法是利用激光器照射出的兩束相關(guān)光源,照射到涂成有抗腐蝕層的毛坯上,是干涉條紋層像在抗腐蝕層上,再用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)容劑除去被照射的部分(顯影),從而腐蝕層產(chǎn)生一

18、定空間 結(jié)構(gòu)的干涉條紋,這種方法刻制的條紋最多可達(dá)4000/mm. 光柵單色器的性能優(yōu)劣決定于光柵的材料和該材料單位面積上刻的條紋的數(shù)目,刻的數(shù)目越多分辨率越高(一般是1200條/cm,較好的 6000條/cm).3.1.3狹逢狹逢： (1). 功能：狹逢是單色器的重要組成部分,直接關(guān)系到儀器的分辨率,它是由兩塊鋒利金屬刀片組成,兩刀片之間是嚴(yán)格平行的, 其主要作用是將來(lái)自單色器的散射光切割成單色光。 (2).類型類型： a. 入射狹逢：狹逢的位置設(shè)置在光源和單色器之間 b. 出射狹逢：狹逢的位置設(shè)置在單色器和比色池之間(3).狹逢的表示方法：狹逢的表示方法： a.以狹逢的實(shí)際寬度來(lái)表示,單位

19、是mm b.以出射狹逢所能透過(guò)的光譜寬度來(lái)表示, 單位是nm (4).狹逢的形狀狹逢的形狀 a.長(zhǎng)方形,是由兩塊平行刀片組成 b.弧形, 是由兩塊弧形刀片組成3.1.4樣品室樣品室:(1)功能：功能：樣品池由樣品架、保溫池、比色池三部分組成，其功能是使光和樣液發(fā)生作用,產(chǎn)生輻射信號(hào)變化(2).樣品架樣品架： 單孔、四孔、六孔、微孔、 膠孔(3)保溫池保溫池：電子保溫池、循環(huán)水保溫池(4)比色池比色池： 光學(xué)玻璃、有機(jī)玻璃、石英玻璃、藍(lán)寶石等材料制成 3.1.5光電轉(zhuǎn)換器光電轉(zhuǎn)換器(檢測(cè)器檢測(cè)器)：(1)功能：功能：是將光信號(hào)轉(zhuǎn)變成電信號(hào)，再通過(guò)換大器將信號(hào)輸送給顯示系統(tǒng)(2)類型：類型：a.光

20、電池光電池: 硒光電池: 僅限于可見(jiàn)光范圍,最靈敏的波長(zhǎng)范圍在500-600nm 硫化鉛光電池: 可以用于紫外-可見(jiàn)-紅外波長(zhǎng)范圍,但靈敏度較差.b.光電管光電管: 光電管是由密封在玻璃管或石英玻璃管內(nèi)的兩個(gè)金屬電極組成,常用的有藍(lán)敏和紅敏兩種,藍(lán)敏是在鎳陰極表面鍍銻和銫,適用于210-625nm的波長(zhǎng)范圍,紅敏是在鎳陰極表面鍍銀和氧化銫,適用于625-1000nm的波長(zhǎng)范圍 充氣光電管充氣光電管:在光的照射下,由于陰極發(fā)出的電子與管內(nèi)的氣體分子發(fā)生碰撞,導(dǎo)致氣體分子電離釋放出二次電子而產(chǎn)生較大的電流,光照強(qiáng)度與電流大小成正比. 但充氣光電管的線性關(guān)系較差. 真空光電管真空光電管: 在光的照射

21、下陰極發(fā)出的電子在真空管內(nèi)向陽(yáng)極高速運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生電流. 光照強(qiáng)度與電流大小成正比. 真空光電管的線性關(guān)系較好. (圖3) c.光電倍增管光電倍增管: 光電倍增管產(chǎn)生光電流的基本原理同光電管一樣,所不同的是在光電管的陰極和陽(yáng)極之間增加了若干個(gè)倍增電極.當(dāng)光照射時(shí),各 電極都產(chǎn)生電壓,陰極的電位最低,各倍增電極的電位依次增加,陽(yáng)極的電位最高(圖4).d.光電二極管矩陣光電二極管矩陣(photodiode array) 光電二極管矩陣是由很多二極管并聯(lián)而成的, 光電二極管的數(shù)目多少?zèng)Q定了儀器的分辨率, 光電二極管的數(shù)目越多, 儀器的分辨率越高.通常由數(shù)十到數(shù)百個(gè)光電二極管組成. 3.1.6顯示器顯示器

22、:(1)功能：是將獲得的電信號(hào)轉(zhuǎn)變成圖形數(shù)字,以一定的方式顯示出來(lái)。(2)類型： 指針式顯示 LD數(shù)字顯示 VGA屏幕顯示 計(jì)算機(jī)顯示3.2紫外分光光度計(jì)的分類與技術(shù)指標(biāo)紫外分光光度計(jì)的分類與技術(shù)指標(biāo)3.2.1紫外分光光度計(jì)的分類紫外分光光度計(jì)的分類(1)按儀器使用的波長(zhǎng)分類a.真空紫外分光光度計(jì)(0.1-200nm)b.可見(jiàn)分光光度計(jì)(350-700nm)c.紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(185-900nm)d.紫外可見(jiàn)-紅外分光光度計(jì)(185-2500nm)(2).按儀器使用的光學(xué)系統(tǒng)分類按儀器使用的光學(xué)系統(tǒng)分類a.單光束分光光度計(jì)b.雙光束分光光度計(jì)c.雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)d.雙波長(zhǎng)雙光束分光光度計(jì)e

23、.動(dòng)力學(xué)分光光度計(jì)4.光譜分析的方法光譜分析的方法4.1 定性分析定性分析 利用測(cè)定某些未知物的一些理化性質(zhì)與已知化合物的理化性質(zhì)比較,從而確定未知物是何種化合物,稱為定性鑒定. 在做定性鑒定時(shí),要注意以下幾點(diǎn)(1)溶劑:對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物和被測(cè)物有良好的溶解度,本身在測(cè)定的波長(zhǎng)內(nèi)無(wú)光吸收(2)在同樣的條件下(如溶劑,pH,離子強(qiáng)度,溫度,及所用的儀器)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物和待測(cè)物的吸收光譜(3)同時(shí)改變測(cè)定條件, 標(biāo)準(zhǔn)物和待測(cè)物的吸收光譜仍然完全相同4.2 純度鑒定純度鑒定 一種純物質(zhì)在紫外區(qū)有其特征吸收光譜,如核酸在260nm,蛋白質(zhì)在280nm 純核酸的標(biāo)準(zhǔn)光吸收比為 280/260 = 0.5 純蛋白的標(biāo)

24、準(zhǔn)光吸收比為 280/260 = 1.8 采用紫外吸收光譜測(cè)定樣品的純度即方便又靈敏,測(cè)得結(jié)果可靠.4.3定量分析定量分析 分光光度法定量分析的基本原理與比色法相同,符合光吸收定律,分析的方法有:(1).單組分的定量分析單組分的定量分析 測(cè)定單組分的樣品,首先測(cè)出該樣品的吸收光譜曲線,找到其max,然后,用此波長(zhǎng)作比色分析.用分光光度法作定量分析有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn) a.入射光的單色性好,最大吸收峰波長(zhǎng)準(zhǔn)確,靈敏度高,受干擾因素少. b.即可測(cè)定有色物質(zhì)含量,又可測(cè)定無(wú)色物質(zhì)的含量(2).多組分混合物的定量定量測(cè)定多組分混合物的定量定量測(cè)定 含有一種以上的多組分樣品,可根據(jù)各組分的吸收光譜曲線作定量分析, 混合樣品的定量分析大致可分兩類:a. 吸收光譜不重疊的混合定量測(cè)定吸收光譜不重疊的混合定量測(cè)定 在被測(cè)樣品中存在著兩種或兩種以上的物質(zhì), 但它們的吸收光譜不互相重疊,可根據(jù)各自的最大吸收峰來(lái)測(cè)定