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文檔簡介
1、(一)天冬酰胺酶的化學組成和性質(一)天冬酰胺酶的化學組成和性質 天冬酰胺酶是酰胺基水解酶,是大腸桿菌菌體中提取分離的酶類藥物,用于治療白血病。1922年Clementi發(fā)現(xiàn)豚鼠血清中存在天冬酰胺酶;1953年Kidd發(fā)現(xiàn)豚鼠血清中有抑癌作用的物質,其活性成分是蛋白質;1961年Broome確定了其有效成分是天冬酰胺酶,后來,Mashburn等報告指出從大腸桿菌中分離出天冬酰胺酶,具有同樣抗癌活性。 天冬酰胺酶呈白色粉末狀,微有濕性,溶于水,不溶于丙酮 三氯甲烷 乙醚和甲醇,水溶液20儲存7d,5儲存14d均不減少酶的活力。干品50 15min酶活力降低30,60 1h內失活,最適PH8.5,
2、最適溫度37。 (二)國內天冬酰胺酶的發(fā)展歷程(二)國內天冬酰胺酶的發(fā)展歷程 目前,國內臨床上應用的L2ASP 主要來源于大腸桿菌,我國天津生化廠于1974 年開始生產(chǎn)E1coli天冬酰胺酶,但由于菌種產(chǎn)酶能力低,提取精制工藝落后,難以與國外產(chǎn)品競爭,再加之其他原因最后停產(chǎn)。為了填補國內空白,1995 年,中國藥科大學吳梧桐教授等率先進行了E1coli 天冬酰胺酶ansB基因的克隆和表達研究,并首次在國內成功構建了高效表達L2ASP 的基因工程菌pKA/ CPU210009 ,工程菌發(fā)酵單位比野生株高出100 倍。隨后又優(yōu)化了基因工程菌的培養(yǎng)條件和發(fā)酵工藝,確定了重組L2ASP 的純化路線,并
3、對重組產(chǎn)品進行了鑒定。結果表明,基因工程菌生產(chǎn)的產(chǎn)品質量與天然品從基因序列、蛋白質一級結構到蛋白質的物理化學性質等方面均一致,兩者具有同質性 。這些研究成果為我國工業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)質、低價的注射用E1coliL2ASP 開辟了新的道路。 (三)抗腫瘤機制(三)抗腫瘤機制 L2ASP 抗腫瘤的作用機制在于它能夠降低人 體內L2天冬酰胺和L2谷氨酰胺的濃度,這兩種氨基胞缺乏天冬酰胺合成酶,不能合成L2天冬酰胺,需酸是合成嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的重要組成部分。腫瘤細要攝取外源L2天冬酰胺才能存活。當外源L2天冬酰胺被分解掉時,癌細胞合成核苷酸和蛋白質的能力就會顯著降低,因此L2ASP 能有效抑制腫瘤細胞的增殖。有
4、研究表明, L2ASP 能夠選擇性抑制體內Ra2pamycin2靶標信號傳導通路,從而抑制腫瘤的增值 。另有文獻報道,L2ASP 在體內發(fā)揮作用時可能是通過一種功能性的p53 蛋白因子來介導腫瘤細胞的凋亡 。(四)工藝流程(四)工藝流程 大腸桿菌產(chǎn)生的L2ASP 包括L2ASP 和L2ASP ,其中L2ASP 存在于細胞質中,與底物L2天冬酰胺的親和力很小(Km = 1 10 - 3 mol/ L) ,沒有抗腫瘤活性;而L2ASP 則分泌在細胞周質中,與L2天冬酰胺有很高的親和力( Km = 1 10 - 5 mol/ L) ,有抗癌活性3 ?,F(xiàn)今,產(chǎn)生L2ASP 的菌種主要包括Escheri
5、chia coli 、Erwinia carotovara、Serralia marcescem、PseudomonasSp1、Wolinella succinogenes 等。 主要采用的提純方法包括硫酸銨分級沉淀、乙醇分級沉淀、離子交換層析法、超濾、水系二相膠束系統(tǒng)、分批式吸附和直行式解吸附法、滲透休克法以及親和層析法等816 。采用不同方法最終得到目標產(chǎn)物的酶活力范圍為220520157 U/ mg ,總回收率為31 %86 %。天冬酰胺酶工藝流程圖天冬酰胺酶工藝流程圖 大腸桿菌大腸桿菌 肉湯菌種肉湯菌種 種子種子菌種菌種 發(fā)酵液發(fā)酵液 菌體菌體 提提取液取液 上清液上清液 沉淀沉淀 洗
6、脫液洗脫液 洗脫液洗脫液 凍干凍干 L-天冬酰胺酶天冬酰胺酶菌種培養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基37 48h玉米漿培養(yǎng)基37 4-8h種子培養(yǎng)發(fā)酵玉米漿培養(yǎng)基37 6-8h離心提取蔗糖抽提液PH7.5 30 分級沉淀(NH4)2SO455飽和度PH7.0分級沉淀(NH4)2SO490飽和度離子沉淀DEAE-纖維素(DE52)離子交換CM-纖維素(CM52)工藝過程及要點工藝過程及要點1 菌種培養(yǎng)菌種培養(yǎng)采用大腸桿菌采用大腸桿菌Escherichia coli A.S.1.357,培養(yǎng)基加牛培養(yǎng)基加牛肉汁肉汁100mL,蛋白胨蛋白胨1g,氯化鈉氯化鈉0.5g,瓊脂瓊脂2-2.5g 37,在在試管中培養(yǎng)試管中培養(yǎng)2
7、4h,茄形瓶培養(yǎng),茄形瓶培養(yǎng)8h,錐形瓶培養(yǎng),錐形瓶培養(yǎng)16h。2 種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)培養(yǎng)基用玉米漿培養(yǎng)基用玉米漿30kg,加水至,加水至300kg,接種量,接種量1%-1。5%,37,通氣攪拌培養(yǎng),通氣攪拌培養(yǎng)4-8h.一、總述一、總述3 發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)取玉米漿取玉米漿100Kg,接種量,接種量8%,37,通氣攪拌培養(yǎng),通氣攪拌培養(yǎng)6-8h,離心分離發(fā)酵液,得,離心分離發(fā)酵液,得菌體加菌體加2倍量丙酮攪拌,壓濾,濾餅過篩,自然風干成菌體干粉。倍量丙酮攪拌,壓濾,濾餅過篩,自然風干成菌體干粉。4 蔗糖溶液抽提蔗糖溶液抽提將菌體細胞中加入將菌體細胞中加入5倍體積的蔗糖溶液(蔗糖倍體積的蔗糖溶
8、液(蔗糖40%溶菌酶溶菌酶200mg/L,EDTA10mmol/L,PH7.5),30振蕩振蕩2h,8000r/min離心,收取上離心,收取上層酶液。層酶液。5 硫酸銨分級沉淀取上述酶液,加入(NH4)2SO4至55%飽和度,調PH至7.0,室溫攪拌1h,離心除去沉淀,取上清液加入(NH4)2SO4到90%飽和度,離心收集沉淀。6 純化將沉淀用50mmol/L,PH7.0磷酸緩沖液溶解并透析,透析后的酶液,通過預先用10mmol/L,PH7.6磷酸緩沖液平衡的DEAE-纖維素層析柱(1cm30cm),用30mmol/L磷酸緩沖液洗脫,流速為40mL/h,收集天冬酰胺酶活性組分,再調整PH4.8
9、,通過預先用50mmol/L,PH4.9的磷酸緩沖液平衡的CM-纖維素層析柱(1cm8cm),用50mmol/L,PH5.2的磷酸緩沖液洗脫,收集酶活性組分,冷凍干燥,即得L-天冬酰胺酶凍干粉,總收率為31%,比活為220U/mg蛋白。二、工藝流程圖二、工藝流程圖 (1 1)絲狀菌三級絲狀菌三級發(fā)酵工藝流程發(fā)酵工藝流程冷凍管(冷凍管(2525C C,孢子培養(yǎng),孢子培養(yǎng),7 7天)天)斜面母瓶斜面母瓶(2525C C,孢子培養(yǎng),孢子培養(yǎng),7 7天)天)大米孢子(大米孢子(2626C C,種,種子培養(yǎng)子培養(yǎng)56h56h)一級種子培養(yǎng)液(一級種子培養(yǎng)液(2727C C,種子培養(yǎng),種子培養(yǎng),24h24
10、h)二級種子培養(yǎng)液(二級種子培養(yǎng)液(27262726C,C,發(fā)酵發(fā)酵,7,7天)天)發(fā)酵液。發(fā)酵液。(2 2)球狀菌二級球狀菌二級發(fā)酵工藝流程發(fā)酵工藝流程冷凍管(冷凍管(2525C C,孢子培養(yǎng),孢子培養(yǎng),6868天)天)親米(親米(2525C C,孢子培養(yǎng),孢子培養(yǎng),810810天)天)生產(chǎn)米(生產(chǎn)米(2828C C,孢子培養(yǎng),孢子培養(yǎng),5660h5660h)種子培養(yǎng)液(種子培養(yǎng)液(2625-242625-24C C,發(fā)酵,發(fā)酵,7 7天)天)發(fā)酵液。發(fā)酵液。三、青霉素發(fā)酵過程三、青霉素發(fā)酵過程 青霉素發(fā)酵時,青霉素生產(chǎn)菌在青霉素發(fā)酵時,青霉素生產(chǎn)菌在合適的培養(yǎng)基、合適的培養(yǎng)基、PHPH、溫
11、度和、溫度和通氣攪拌通氣攪拌等發(fā)酵條件下進行生長并合成青霉素。等發(fā)酵條件下進行生長并合成青霉素。 發(fā)酵開始前,有關設備和培養(yǎng)基(主要是碳源、氮源、前體發(fā)酵開始前,有關設備和培養(yǎng)基(主要是碳源、氮源、前體和無機鹽等)必須先經(jīng)過和無機鹽等)必須先經(jīng)過滅菌滅菌,后接入種子。,后接入種子。 在整個過程中,需要不斷通氣和攪拌,維持一定的罐溫和罐在整個過程中,需要不斷通氣和攪拌,維持一定的罐溫和罐壓,在發(fā)酵過程中往往要加入壓,在發(fā)酵過程中往往要加入泡沫劑泡沫劑,假如酸堿控制發(fā)酵液,假如酸堿控制發(fā)酵液的的PHPH,還需要間歇或連續(xù)的加入葡萄糖及銨鹽等化合物以補,還需要間歇或連續(xù)的加入葡萄糖及銨鹽等化合物以補
12、充充碳源及氮源碳源及氮源,或補進其他料液和前體等以促進青霉素的生,或補進其他料液和前體等以促進青霉素的生產(chǎn)。產(chǎn)。青霉素發(fā)酵過程中的代謝變化分為青霉素發(fā)酵過程中的代謝變化分為菌體生長、青霉素合成和菌體自溶菌體生長、青霉素合成和菌體自溶三三個階段。個階段。菌體生長階段菌體生長階段:發(fā)酵培養(yǎng)基接種后生產(chǎn)菌在合適的:發(fā)酵培養(yǎng)基接種后生產(chǎn)菌在合適的環(huán)境中經(jīng)過短時間的適應,即開始發(fā)育、生長和繁環(huán)境中經(jīng)過短時間的適應,即開始發(fā)育、生長和繁殖,直至達到菌體的臨界濃度。殖,直至達到菌體的臨界濃度。 青霉素合成階段青霉素合成階段:這個階段主要合成青霉素,青霉:這個階段主要合成青霉素,青霉素的生產(chǎn)速率達到最大,并一
13、直維持到青霉素合成素的生產(chǎn)速率達到最大,并一直維持到青霉素合成能力衰退。在這個階段,菌體重量有所增加,但產(chǎn)能力衰退。在這個階段,菌體重量有所增加,但產(chǎn)生菌的呼吸強度一般無顯著變化。生菌的呼吸強度一般無顯著變化。菌體自溶階段菌體自溶階段:這個階段菌體衰老,細胞開始自溶,:這個階段菌體衰老,細胞開始自溶,合成青霉素能力衰退,青霉素生產(chǎn)速率下降,氨基合成青霉素能力衰退,青霉素生產(chǎn)速率下降,氨基氮增加,氮增加,PHPH上升。上升。(四)工藝流程(四)工藝流程 大腸桿菌產(chǎn)生的L2ASP 包括L2ASP 和L2ASP ,其中L2ASP 存在于細胞質中,與底物L2天冬酰胺的親和力很小(Km = 1 10 -
14、 3 mol/ L) ,沒有抗腫瘤活性;而L2ASP 則分泌在細胞周質中,與L2天冬酰胺有很高的親和力( Km = 1 10 - 5 mol/ L) ,有抗癌活性3 。現(xiàn)今,產(chǎn)生L2ASP 的菌種主要包括Escherichia coli 、Erwinia carotovara、Serralia marcescem、PseudomonasSp1、Wolinella succinogenes 等。 主要采用的提純方法包括硫酸銨分級沉淀、乙醇分級沉淀、離子交換層析法、超濾、水系二相膠束系統(tǒng)、分批式吸附和直行式解吸附法、滲透休克法以及親和層析法等816 。采用不同方法最終得到目標產(chǎn)物的酶活力范圍為22
15、0520157 U/ mg ,總回收率為31 %86 %。5 硫酸銨分級沉淀取上述酶液,加入(NH4)2SO4至55%飽和度,調PH至7.0,室溫攪拌1h,離心除去沉淀,取上清液加入(NH4)2SO4到90%飽和度,離心收集沉淀。6 純化將沉淀用50mmol/L,PH7.0磷酸緩沖液溶解并透析,透析后的酶液,通過預先用10mmol/L,PH7.6磷酸緩沖液平衡的DEAE-纖維素層析柱(1cm30cm),用30mmol/L磷酸緩沖液洗脫,流速為40mL/h,收集天冬酰胺酶活性組分,再調整PH4.8,通過預先用50mmol/L,PH4.9的磷酸緩沖液平衡的CM-纖維素層析柱(1cm8cm),用50mmol/L,PH5.2的磷酸緩沖液洗脫,收集酶活性組分,冷凍干燥,即得L-天冬酰胺酶凍干粉,總收率為31%,比活為220U/mg蛋白。青霉素發(fā)酵過程中的代謝變化分為青霉素發(fā)酵過程中的代謝變化分為菌體生長、青霉素合成和菌體自溶菌體生長、青霉素合成和菌體自溶三三個階段。個階段。菌體生長階段菌體生長階段:發(fā)酵培養(yǎng)基接種后生產(chǎn)菌在合適的:發(fā)酵培養(yǎng)基接種后生產(chǎn)菌在合適的環(huán)境中經(jīng)過短時間的適應,即開始發(fā)育、生長和繁環(huán)境中經(jīng)過短時間的適應,即開始發(fā)育、生長和繁殖,直至達到菌體的臨界濃度。殖,直至達到菌體的臨界濃度。 青霉素合成階段青霉素合成階段:這個階段
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