L天冬酰胺酶的生產(chǎn)工藝

1、（一）天冬酰胺酶的化學組成和性質（一）天冬酰胺酶的化學組成和性質 天冬酰胺酶是酰胺基水解酶，是大腸桿菌菌體中提取分離的酶類藥物，用于治療白血病。1922年Clementi發(fā)現(xiàn)豚鼠血清中存在天冬酰胺酶；1953年Kidd發(fā)現(xiàn)豚鼠血清中有抑癌作用的物質，其活性成分是蛋白質；1961年Broome確定了其有效成分是天冬酰胺酶，后來，Mashburn等報告指出從大腸桿菌中分離出天冬酰胺酶，具有同樣抗癌活性。 天冬酰胺酶呈白色粉末狀，微有濕性，溶于水，不溶于丙酮 三氯甲烷 乙醚和甲醇，水溶液20儲存7d，5儲存14d均不減少酶的活力。干品50 15min酶活力降低30，60 1h內失活，最適PH8.5，

2、最適溫度37。 （二）國內天冬酰胺酶的發(fā)展歷程（二）國內天冬酰胺酶的發(fā)展歷程 目前,國內臨床上應用的L2ASP 主要來源于大腸桿菌,我國天津生化廠于1974 年開始生產(chǎn)E1coli天冬酰胺酶,但由于菌種產(chǎn)酶能力低,提取精制工藝落后,難以與國外產(chǎn)品競爭,再加之其他原因最后停產(chǎn)。為了填補國內空白,1995 年,中國藥科大學吳梧桐教授等率先進行了E1coli 天冬酰胺酶ansB基因的克隆和表達研究,并首次在國內成功構建了高效表達L2ASP 的基因工程菌pKA/ CPU210009 ,工程菌發(fā)酵單位比野生株高出100 倍。隨后又優(yōu)化了基因工程菌的培養(yǎng)條件和發(fā)酵工藝,確定了重組L2ASP 的純化路線,并

3、對重組產(chǎn)品進行了鑒定。結果表明,基因工程菌生產(chǎn)的產(chǎn)品質量與天然品從基因序列、蛋白質一級結構到蛋白質的物理化學性質等方面均一致,兩者具有同質性 。這些研究成果為我國工業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)質、低價的注射用E1coliL2ASP 開辟了新的道路。 （三）抗腫瘤機制（三）抗腫瘤機制 L2ASP 抗腫瘤的作用機制在于它能夠降低人 體內L2天冬酰胺和L2谷氨酰胺的濃度,這兩種氨基胞缺乏天冬酰胺合成酶,不能合成L2天冬酰胺,需酸是合成嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的重要組成部分。腫瘤細要攝取外源L2天冬酰胺才能存活。當外源L2天冬酰胺被分解掉時,癌細胞合成核苷酸和蛋白質的能力就會顯著降低,因此L2ASP 能有效抑制腫瘤細胞的增殖。有

4、研究表明, L2ASP 能夠選擇性抑制體內Ra2pamycin2靶標信號傳導通路,從而抑制腫瘤的增值 。另有文獻報道,L2ASP 在體內發(fā)揮作用時可能是通過一種功能性的p53 蛋白因子來介導腫瘤細胞的凋亡 。（四）工藝流程（四）工藝流程 大腸桿菌產(chǎn)生的L2ASP 包括L2ASP 和L2ASP ,其中L2ASP 存在于細胞質中,與底物L2天冬酰胺的親和力很小(Km = 1 10 - 3 mol/ L) ,沒有抗腫瘤活性;而L2ASP 則分泌在細胞周質中,與L2天冬酰胺有很高的親和力( Km = 1 10 - 5 mol/ L) ,有抗癌活性3 ?，F(xiàn)今,產(chǎn)生L2ASP 的菌種主要包括Escheri

5、chia coli 、Erwinia carotovara、Serralia marcescem、PseudomonasSp1、Wolinella succinogenes 等。 主要采用的提純方法包括硫酸銨分級沉淀、乙醇分級沉淀、離子交換層析法、超濾、水系二相膠束系統(tǒng)、分批式吸附和直行式解吸附法、滲透休克法以及親和層析法等816 。采用不同方法最終得到目標產(chǎn)物的酶活力范圍為220520157 U/ mg ,總回收率為31 %86 %。天冬酰胺酶工藝流程圖天冬酰胺酶工藝流程圖 大腸桿菌大腸桿菌 肉湯菌種肉湯菌種 種子種子菌種菌種 發(fā)酵液發(fā)酵液 菌體菌體 提提取液取液 上清液上清液 沉淀沉淀 洗

6、脫液洗脫液 洗脫液洗脫液 凍干凍干 L-天冬酰胺酶天冬酰胺酶菌種培養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基37 48h玉米漿培養(yǎng)基37 4-8h種子培養(yǎng)發(fā)酵玉米漿培養(yǎng)基37 6-8h離心提取蔗糖抽提液PH7.5 30 分級沉淀（NH4)2SO455飽和度PH7.0分級沉淀（NH4)2SO490飽和度離子沉淀DEAE-纖維素(DE52)離子交換CM-纖維素(CM52)工藝過程及要點工藝過程及要點1 菌種培養(yǎng)菌種培養(yǎng)采用大腸桿菌采用大腸桿菌Escherichia coli A.S.1.357,培養(yǎng)基加牛培養(yǎng)基加牛肉汁肉汁100mL,蛋白胨蛋白胨1g,氯化鈉氯化鈉0.5g,瓊脂瓊脂2-2.5g 37,在在試管中培養(yǎng)試管中培養(yǎng)2

7、4h，茄形瓶培養(yǎng)，茄形瓶培養(yǎng)8h，錐形瓶培養(yǎng)，錐形瓶培養(yǎng)16h。2 種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)培養(yǎng)基用玉米漿培養(yǎng)基用玉米漿30kg，加水至，加水至300kg，接種量，接種量1%-1。5%，37，通氣攪拌培養(yǎng)，通氣攪拌培養(yǎng)4-8h.一、總述一、總述3 發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)取玉米漿取玉米漿100Kg，接種量，接種量8%，37，通氣攪拌培養(yǎng)，通氣攪拌培養(yǎng)6-8h，離心分離發(fā)酵液，得，離心分離發(fā)酵液，得菌體加菌體加2倍量丙酮攪拌，壓濾，濾餅過篩，自然風干成菌體干粉。倍量丙酮攪拌，壓濾，濾餅過篩，自然風干成菌體干粉。4 蔗糖溶液抽提蔗糖溶液抽提將菌體細胞中加入將菌體細胞中加入5倍體積的蔗糖溶液（蔗糖倍體積的蔗糖溶

8、液（蔗糖40%溶菌酶溶菌酶200mg/L,EDTA10mmol/L,PH7.5),30振蕩振蕩2h,8000r/min離心，收取上離心，收取上層酶液。層酶液。5 硫酸銨分級沉淀取上述酶液，加入（NH4)2SO4至55%飽和度，調PH至7.0，室溫攪拌1h，離心除去沉淀，取上清液加入（NH4)2SO4到90%飽和度，離心收集沉淀。6 純化將沉淀用50mmol/L,PH7.0磷酸緩沖液溶解并透析，透析后的酶液，通過預先用10mmol/L，PH7.6磷酸緩沖液平衡的DEAE-纖維素層析柱（1cm30cm）,用30mmol/L磷酸緩沖液洗脫，流速為40mL/h,收集天冬酰胺酶活性組分，再調整PH4.8

9、,通過預先用50mmol/L,PH4.9的磷酸緩沖液平衡的CM-纖維素層析柱（1cm8cm）,用50mmol/L,PH5.2的磷酸緩沖液洗脫，收集酶活性組分，冷凍干燥，即得L-天冬酰胺酶凍干粉，總收率為31%，比活為220U/mg蛋白。二、工藝流程圖二、工藝流程圖 （1 1）絲狀菌三級絲狀菌三級發(fā)酵工藝流程發(fā)酵工藝流程冷凍管（冷凍管（2525C C，孢子培養(yǎng)，孢子培養(yǎng)，7 7天）天）斜面母瓶斜面母瓶（2525C C，孢子培養(yǎng)，孢子培養(yǎng)，7 7天）天）大米孢子（大米孢子（2626C C，種，種子培養(yǎng)子培養(yǎng)56h56h）一級種子培養(yǎng)液（一級種子培養(yǎng)液（2727C C，種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)，24h24

10、h）二級種子培養(yǎng)液（二級種子培養(yǎng)液（27262726C,C,發(fā)酵發(fā)酵,7,7天）天）發(fā)酵液。發(fā)酵液。（2 2）球狀菌二級球狀菌二級發(fā)酵工藝流程發(fā)酵工藝流程冷凍管（冷凍管（2525C C，孢子培養(yǎng)，孢子培養(yǎng)，6868天）天）親米（親米（2525C C，孢子培養(yǎng)，孢子培養(yǎng)，810810天）天）生產(chǎn)米（生產(chǎn)米（2828C C，孢子培養(yǎng)，孢子培養(yǎng)，5660h5660h）種子培養(yǎng)液（種子培養(yǎng)液（2625-242625-24C C，發(fā)酵，發(fā)酵，7 7天）天）發(fā)酵液。發(fā)酵液。三、青霉素發(fā)酵過程三、青霉素發(fā)酵過程 青霉素發(fā)酵時，青霉素生產(chǎn)菌在青霉素發(fā)酵時，青霉素生產(chǎn)菌在合適的培養(yǎng)基、合適的培養(yǎng)基、PHPH、溫

11、度和、溫度和通氣攪拌通氣攪拌等發(fā)酵條件下進行生長并合成青霉素。等發(fā)酵條件下進行生長并合成青霉素。 發(fā)酵開始前，有關設備和培養(yǎng)基（主要是碳源、氮源、前體發(fā)酵開始前，有關設備和培養(yǎng)基（主要是碳源、氮源、前體和無機鹽等）必須先經(jīng)過和無機鹽等）必須先經(jīng)過滅菌滅菌，后接入種子。，后接入種子。 在整個過程中，需要不斷通氣和攪拌，維持一定的罐溫和罐在整個過程中，需要不斷通氣和攪拌，維持一定的罐溫和罐壓，在發(fā)酵過程中往往要加入壓，在發(fā)酵過程中往往要加入泡沫劑泡沫劑，假如酸堿控制發(fā)酵液，假如酸堿控制發(fā)酵液的的PHPH，還需要間歇或連續(xù)的加入葡萄糖及銨鹽等化合物以補，還需要間歇或連續(xù)的加入葡萄糖及銨鹽等化合物以補

12、充充碳源及氮源碳源及氮源，或補進其他料液和前體等以促進青霉素的生，或補進其他料液和前體等以促進青霉素的生產(chǎn)。產(chǎn)。青霉素發(fā)酵過程中的代謝變化分為青霉素發(fā)酵過程中的代謝變化分為菌體生長、青霉素合成和菌體自溶菌體生長、青霉素合成和菌體自溶三三個階段。個階段。菌體生長階段菌體生長階段：發(fā)酵培養(yǎng)基接種后生產(chǎn)菌在合適的：發(fā)酵培養(yǎng)基接種后生產(chǎn)菌在合適的環(huán)境中經(jīng)過短時間的適應，即開始發(fā)育、生長和繁環(huán)境中經(jīng)過短時間的適應，即開始發(fā)育、生長和繁殖，直至達到菌體的臨界濃度。殖，直至達到菌體的臨界濃度。 青霉素合成階段青霉素合成階段：這個階段主要合成青霉素，青霉：這個階段主要合成青霉素，青霉素的生產(chǎn)速率達到最大，并一

13、直維持到青霉素合成素的生產(chǎn)速率達到最大，并一直維持到青霉素合成能力衰退。在這個階段，菌體重量有所增加，但產(chǎn)能力衰退。在這個階段，菌體重量有所增加，但產(chǎn)生菌的呼吸強度一般無顯著變化。生菌的呼吸強度一般無顯著變化。菌體自溶階段菌體自溶階段：這個階段菌體衰老，細胞開始自溶，：這個階段菌體衰老，細胞開始自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生產(chǎn)速率下降，氨基合成青霉素能力衰退，青霉素生產(chǎn)速率下降，氨基氮增加，氮增加，PHPH上升。上升。（四）工藝流程（四）工藝流程 大腸桿菌產(chǎn)生的L2ASP 包括L2ASP 和L2ASP ,其中L2ASP 存在于細胞質中,與底物L2天冬酰胺的親和力很小(Km = 1 10 -

14、 3 mol/ L) ,沒有抗腫瘤活性;而L2ASP 則分泌在細胞周質中,與L2天冬酰胺有很高的親和力( Km = 1 10 - 5 mol/ L) ,有抗癌活性3 。現(xiàn)今,產(chǎn)生L2ASP 的菌種主要包括Escherichia coli 、Erwinia carotovara、Serralia marcescem、PseudomonasSp1、Wolinella succinogenes 等。 主要采用的提純方法包括硫酸銨分級沉淀、乙醇分級沉淀、離子交換層析法、超濾、水系二相膠束系統(tǒng)、分批式吸附和直行式解吸附法、滲透休克法以及親和層析法等816 。采用不同方法最終得到目標產(chǎn)物的酶活力范圍為22

15、0520157 U/ mg ,總回收率為31 %86 %。5 硫酸銨分級沉淀取上述酶液，加入（NH4)2SO4至55%飽和度，調PH至7.0，室溫攪拌1h，離心除去沉淀，取上清液加入（NH4)2SO4到90%飽和度，離心收集沉淀。6 純化將沉淀用50mmol/L,PH7.0磷酸緩沖液溶解并透析，透析后的酶液，通過預先用10mmol/L，PH7.6磷酸緩沖液平衡的DEAE-纖維素層析柱（1cm30cm）,用30mmol/L磷酸緩沖液洗脫，流速為40mL/h,收集天冬酰胺酶活性組分，再調整PH4.8,通過預先用50mmol/L,PH4.9的磷酸緩沖液平衡的CM-纖維素層析柱（1cm8cm）,用50mmol/L,PH5.2的磷酸緩沖液洗脫，收集酶活性組分，冷凍干燥，即得L-天冬酰胺酶凍干粉，總收率為31%，比活為220U/mg蛋白。青霉素發(fā)酵過程中的代謝變化分為青霉素發(fā)酵過程中的代謝變化分為菌體生長、青霉素合成和菌體自溶菌體生長、青霉素合成和菌體自溶三三個階段。個階段。菌體生長階段菌體生長階段：發(fā)酵培養(yǎng)基接種后生產(chǎn)菌在合適的：發(fā)酵培養(yǎng)基接種后生產(chǎn)菌在合適的環(huán)境中經(jīng)過短時間的適應，即開始發(fā)育、生長和繁環(huán)境中經(jīng)過短時間的適應，即開始發(fā)育、生長和繁殖，直至達到菌體的臨界濃度。殖，直至達到菌體的臨界濃度。 青霉素合成階段青霉素合成階段：這個階段