核酸是遺傳物質(zhì)

1、第六章核酸核酸是遺傳物質(zhì)1868年瑞士 Mieshe從膿細(xì)胞的細(xì)胞核中分離出可溶于堿而不溶于稀酸的酸性物質(zhì)。 間接證據(jù)：同一種生物的不同種類(lèi)的不同生長(zhǎng)期的細(xì)胞，DNA含量基本恒定。直接證據(jù)：T2噬菌體DNA感染E.coli用35S標(biāo)記噬菌體蛋白質(zhì)，感染E.coli,又用32P標(biāo)記噬菌體核酸，感染E.coliDNA、RNA的分布（DNA在核內(nèi)，RNA在核外）。第一節(jié)核酸的化學(xué)組成核酸是一種線形多聚核苷酸，基本組成單位是核苷酸。 結(jié)構(gòu)層次：核酸核苷酸磷酸核苷戊糖 堿基組成核酸的戊糖有兩種:：D-核糖和D-2-脫氧核糖，據(jù)此，可以將核酸分為兩種：核糖核酸（RNA） 和脫氧核糖核酸（DNA）P330表

2、5-1兩類(lèi)核酸的基本化學(xué)組成堿基1. 嘌呤堿:2. 嘧啶堿:腺嘌呤鳥(niǎo)嘌呤胞嘧啶 尿嘧啶胸腺嘧啶P331結(jié)構(gòu)式3.修飾堿基植物中有大量5-甲基胞嘧啶E.coli噬菌體中，5羌甲基胞嘧啶代替C。 稀有堿基：100余種，多數(shù)是甲基化的產(chǎn)物DNA由A、G、C、T堿基構(gòu)成。RNA由A、G、C、U堿基構(gòu)成。核苷核苷由戊糖和堿基縮合而成，糖環(huán)上Ci與嘧啶堿的N1或與嘌呤堿的N9連接 核酸中的核苷均為&型核苷P332結(jié)構(gòu)式腺嘌呤核苷胞嘧啶脫氧核苷DNA的戊糖是：脫氧核糖RNA的戊糖是：核糖三、核苷酸核苷中戊糖C3、C5羥基被磷酸酯化，生成核苷酸。1、構(gòu)成DNA、RNA的核苷酸P333表 5-32、細(xì)胞內(nèi)游離核

3、苷酸及其衍生物 核苷5多磷酸化合物ATP、GTP、CTP、ppppA PPPPG在能量代謝和物質(zhì)代謝及調(diào)控中起重要作用。 環(huán)核苷酸cAMP (3, 5-cAMP) cGMP(3 5-cGMP)它們作為質(zhì)膜的激素的第二信使起作用，cAMP調(diào)節(jié)細(xì)胞的糖代謝、脂代謝 核苷5多磷酸3多磷酸化合物ppGpp pppGpp ppApp 核苷酸衍生物HSCoA NAD+、NADP+、FAD 等輔助因子。GDP半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白生物合成的活性糖基供體。第二節(jié)DNA的結(jié)構(gòu)一級(jí)：脫氧核苷酸分子間連接方式及排列順序。二級(jí)：DNA的兩條多聚核苷酸鏈間通過(guò)氫鍵形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。 三級(jí)：DNA雙鏈進(jìn)一步折疊

4、卷曲形成的構(gòu)象。DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)是4種脫氧核苷酸（dAMP、dGMP、dCMP、dTMP）通過(guò)3/、5A磷酸二酯鍵連接起 來(lái)的線形多聚體。3/、5/-磷酸二酯鍵是DNA、RNA的主鏈結(jié)構(gòu)。P334 圖 5-1書(shū)寫(xiě)方法：5/ 3/:5-pApCpTpG3,或 5ACTG3（在 DNA 中，3/-OH一般是游離的）在DNA分子中，不變的骨架成分磷酸二酯鍵被逐漸省略，真正代表DNA生物學(xué)意義的是堿基的排列 順序。遺傳信息貯存在DNA的堿基排列順序中,生物界生物的多樣性即寓于DNA分子4種核苷酸千變?nèi)f化 的精確的排列順序中。二、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)1953年,Watson和Crick根據(jù)C

5、hargaff規(guī)律和DNA Na鹽纖維的X光衍射數(shù)據(jù)提出了 DNA的雙螺旋 結(jié)構(gòu)模型。1、Watson-Crick雙螺旋結(jié)構(gòu)建立的根據(jù) Chargaff規(guī)律 1950年a. 所有 DNA 中，A=T, G=C 且 A+G=C+T。P334表 5 4。b. DNA的堿基組成具有種的特異性，即不同生物的DNA皆有自己獨(dú)特的堿基組成。c. DNA堿基組成沒(méi)有組織和器官的特異性。d. 年齡、營(yíng)養(yǎng)狀況、環(huán)境等因素不影響DNA的堿基組成。 DNA的Na鹽纖維和DNA晶體的X光衍射分析。相對(duì)濕度92%, DNA鈉鹽結(jié)晶，BDNA。相對(duì)濕度75%, DNA鈉鹽結(jié)晶，ADNA。ZDNA。生物體內(nèi)DNA均為BDN

6、A。Fran kli n的工作2、Watson-Crick雙螺旋結(jié)構(gòu)模型P335 圖 52a兩條反平行的多核苷酸鏈繞同一中心軸相纏繞，形成右手雙股螺旋，一條53另一條35 b嘌呤與嘧啶堿位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，磷酸與脫氧核糖在外側(cè)。磷酸與脫氧核糖彼此通過(guò)3/、5A磷酸二 酯鍵相連接，構(gòu)成DNA分子的骨架寬 1.2 nm寬 0.6nm小溝V深 0.85 nm深 0.75 nmc螺旋平均直徑2nm每圈螺旋含10個(gè)核苷酸堿基堆積距離：0.34nm螺距：3.4nmd兩條核苷酸鏈，依靠彼此堿基間形成的氫鏈結(jié)合在一起。堿基平面垂直于螺旋軸A=T、G=CP336圖 54堿基互補(bǔ)原則具有極重要的生物學(xué)意義，DNA的

7、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄等的分子基礎(chǔ)都是堿基互補(bǔ)3、穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的因素 堿基堆積力（主要因素）形成疏水環(huán)境。 堿基配對(duì)的氫鍵。GC含量越多，越穩(wěn)定。 磷酸基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽(yáng)離子或組蛋白的正離子之間形成離子鍵，中和了磷酸基上的負(fù)電荷 間的斥力，有助于DNA穩(wěn)定。 堿基處于雙螺旋內(nèi)部的疏水環(huán)境中，可免受水溶性活性小分子的攻擊。三、DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的不均一性和多型性（一）DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的不均一性1、反向重復(fù)序列（回文序列）DNA序列中，以某一中心區(qū)域?yàn)閷?duì)稱軸，其兩側(cè)的堿基對(duì)順序正讀和反讀都相同，即對(duì)稱軸一側(cè)的片 段旋轉(zhuǎn)180后，與另一側(cè)片段對(duì)稱重復(fù)。較長(zhǎng)的回文結(jié)構(gòu)，在某些因素作用下，可形成莖環(huán)式的十

8、字結(jié)構(gòu)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。功能還不完全清楚，但 轉(zhuǎn)錄的終止作用與回文結(jié)構(gòu)有關(guān)。較短的回文序列，可作為一種特別信號(hào)，如限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。2、富含A T的序列高等生物中，A+T與C+G的含量差不多相等，但在它們的染色體的某一區(qū)域，A T含量可能很高。在很多有重要調(diào)節(jié)功能（不是蛋白質(zhì)編碼區(qū)）的DNA區(qū)段都富含A T堿基對(duì)。特別是在復(fù)制起點(diǎn)和 啟動(dòng)的Pribnow框的DNA區(qū)中，富含A T對(duì)。這對(duì)于復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的起始十分重要，因?yàn)镚 C對(duì)有三個(gè)氫 鍵，而AT對(duì)只有兩個(gè)氫鍵，此處雙鍵易解開(kāi)。（二）DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的多型性P339 表 5-6 A- B-、Z-DNA 的比較1、 B DNA:典型的 Wats

9、on-Crick雙螺旋 DNA右手雙股螺旋每圈螺旋10.4個(gè)堿基對(duì)每對(duì)螺旋扭角36螺距：3.32nm堿基傾角：12、A-DNA在相對(duì)濕度75%以下所獲得的DNA纖維。A-DNA也是右手雙螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-DNA雜交分子具有這種結(jié)構(gòu)。3、Z-DNA左手螺旋的DNA。天然B-DNA的局部區(qū)域可以形成Z0-DNA。4、DNA三股螺旋在多聚嘧啶和多聚嘌呤組成的DNA螺旋區(qū)段，序列中有較長(zhǎng)的鏡像重復(fù)時(shí)，可形成局部三股螺旋， 稱 H-DNA。鏡像重復(fù)：TAT配對(duì)C+GC酸對(duì)DNA的三鏈結(jié)構(gòu)常出現(xiàn)在DNA復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄的起始或調(diào)節(jié)位點(diǎn)，第三股鏈的存在可能使一些調(diào) 控蛋白或RNA聚合酶

10、等難以與該區(qū)段結(jié)合，從而阻遏有關(guān)遺傳信息的表達(dá)。四、環(huán)狀DNA生物體內(nèi)有些DNA是以雙鏈環(huán)狀DNA的形式存在，包括：某些病毒DNA 某些噬菌體DNA某些細(xì)菌染色體DNA細(xì)菌質(zhì)粒DNA真核細(xì)胞中的線粒體DNA、葉綠體DNA1、環(huán)形DNA的不同構(gòu)象P340圖5-8松馳環(huán)、解鏈環(huán)、負(fù)超螺旋(1) 、松弛環(huán)形DNA線形DNA直接環(huán)化(2) 、解鏈環(huán)形DNA線形DNA擰松后再環(huán)化(3) 、正超螺旋與負(fù)超螺旋DNA線形DNA擰緊或擰松后再環(huán)化，成為超螺旋結(jié)構(gòu)。繩子的兩股以右旋方向纏繞，如果在一端使繩子向纏緊的方向旋轉(zhuǎn)，再將繩子兩端連接起來(lái)，會(huì)產(chǎn)生 一個(gè)左旋的超螺旋，以解除外加的旋轉(zhuǎn)造成的脅變，這樣的超螺旋

11、叫正超螺旋。如果在繩子一端向松纏方向旋轉(zhuǎn)，再將繩子兩端連接起來(lái)，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)右旋的超螺旋，以解除外加的 旋轉(zhuǎn)所造成的脅變，這樣的超螺旋稱負(fù)超螺旋。對(duì)于右手螺旋的DNA分子，如果每圈初級(jí)螺旋的堿基對(duì)數(shù)小于10.4,則其二級(jí)結(jié)構(gòu)處于緊纏狀態(tài)， 是正超螺旋。如果每圈初級(jí)螺旋的堿基對(duì)數(shù)大于10.4,則其二級(jí)結(jié)構(gòu)處于松纏狀態(tài)，是負(fù)超螺旋。2、環(huán)形DNA的拓?fù)鋵W(xué)特性以260bp組成的線形B-DNA為例，螺旋周數(shù)260/10.4=25P340圖25-8松馳環(huán)、解鏈環(huán)、負(fù)超螺旋 連環(huán)數(shù)(L)DNA雙螺旋中，一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù)，以L表示。松馳環(huán)：L=25解鏈環(huán)：L=23超螺旋：L=23 纏繞數(shù)(

12、T)DNA分子中的Watson-Cric螺旋數(shù)目，以T表示松馳環(huán)T=25解鏈環(huán)T=23超螺旋T=25 超螺旋周數(shù)(扭曲數(shù)W)松馳環(huán)W=0解鏈環(huán)W=0超螺旋W= -2L=T+W 比連環(huán)差（為表示DNA的超螺旋程度入=（LLo） /LoLo是指松馳環(huán)形DNA的L值天然DNA的超螺旋密度一般為-0.03-0.09平均每100bp上有3-9個(gè)負(fù)超螺旋。負(fù)超螺旋DNA是由于兩條鏈的纏繞不足引起，很易解鏈，易于參加DNA的復(fù)制、重組和轉(zhuǎn)錄等需要 將兩條鏈分開(kāi)才能進(jìn)行的反應(yīng)。3、拓?fù)洚悩?gòu)酶此酶能改變DNA拓?fù)洚悩?gòu)體的L值。 拓?fù)洚悩?gòu)酶酶I （擰緊）能使雙鏈負(fù)超螺旋DNA轉(zhuǎn)變成松馳形環(huán)狀DNA，每一次作用可使

13、L值增加1,同時(shí)，使松馳環(huán)狀 DNA轉(zhuǎn)變成正超螺旋。 拓?fù)洚悩?gòu)酶酶II （擰松）能使松馳環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變成負(fù)超螺旋形DNA，每次催化使L減少2,同時(shí)能使正超螺旋轉(zhuǎn)變成松馳 DNA。五、染色體的結(jié)構(gòu)1、大腸桿菌染色體大腸桿菌染色體是由4.2X106bp組成的雙鏈環(huán)狀DNA分子，約3000個(gè)基因大腸桿菌DNA結(jié)合蛋白：每個(gè)細(xì)胞H兩個(gè)28KD的相同亞基30000個(gè)二聚體HU兩個(gè)各9KD的不同亞基40000個(gè)二體聚體HLP117KD的亞基20000個(gè)單體P3KD的亞基未知這些DNA結(jié)合蛋白，使4.2Xl06bp的E.coli染色體DNA壓縮成為一個(gè)手腳架形結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)中心是多 種DNA結(jié)合蛋白，DNA雙螺

14、旋分子有許多位點(diǎn)與這些蛋白結(jié)合，形成約100個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)的DNA 都是負(fù)超螺旋，一個(gè)小區(qū)的DNA有兩個(gè)端點(diǎn)被蛋白質(zhì)固定，每個(gè)小區(qū)相對(duì)獨(dú)立。圖用極微量的DNA酶I處理時(shí)，只能使少量小區(qū)的DNA成為松馳狀態(tài)，而其它小區(qū)仍然保持超螺旋狀2、真核生物染色體主要由組蛋白和DNA組成組蛋白是富含堿性a.a（Lys Arg）的堿性蛋白質(zhì)，根據(jù)Lys/Arg比值不同，可分為Hi、H2A、H2B、H3、 H4五種，均為單鏈蛋白質(zhì)，分子量11000-21000H2A、H2B、H3、H4各兩分子對(duì)稱聚集成組蛋白八聚體。146bp長(zhǎng)度的DNA雙螺旋盤(pán)繞在八聚體上形成核小體。核小體間DNA長(zhǎng)度15-100bp （般

15、60bp其上結(jié)合有H1圖2HA、2H2B、2H3、2H4組蛋白八聚體 146bpDNA *核小體串聯(lián)染色質(zhì)折疊一染色體DNA （直徑 2nm）1盤(pán)繞組蛋白八聚體上，結(jié)合H1,壓縮比1/7核小體（一級(jí)結(jié)構(gòu)）螺旋化，壓縮比1/6螺線管（二級(jí)結(jié)構(gòu)）再螺旋化，壓縮比1/40超螺線管（三級(jí)結(jié)構(gòu)）折疊，壓縮比1/5染色單體（四級(jí)結(jié)構(gòu)）總壓縮比：1/84001/10000六、DNA的生物學(xué)功能首次直接證明DNA的遺傳功能的是Avery的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。P342 14 Avery的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第三節(jié) RNA的結(jié)構(gòu)RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)RNA是AMP、GMP、CMP、UMP通過(guò)3/、5麟酸二酯鍵形成的線形多

16、聚體。P343圖5-10 RNA基本結(jié)構(gòu)組成RNA的戊糖是核糖 堿基中RNA的U替代DNA中的T,此外，RNA中還有一些稀有堿基。 天然RNA分子都是單鏈線形分子，只有部分區(qū)域是A-型雙螺旋結(jié)構(gòu)。雙螺旋區(qū)一般占RNA分子 的50%左右。二、RNA的類(lèi)型細(xì)胞中的RNA，按其在蛋白質(zhì)合成中所起的作用，主要可分為三種類(lèi)型。核糖體RNA rRNA轉(zhuǎn)運(yùn) RNA tRNA信使 RNA mRNA此外，真核生物細(xì)胞中有少量核內(nèi)小RNA (small nuclear RNA snRN)P344表5-7 大腸桿菌中的RNA沉降系數(shù)：?jiǎn)挝浑x心場(chǎng)中的沉降速度，以S為單位，即1013秒。如23S rRNA，單位離心場(chǎng)中

17、沉降23X10-13秒5S rRNA，單位離心場(chǎng)中沉降 5X1013秒三、tRNA的結(jié)構(gòu)tRNA約占全部RNA的15%主要功能：在蛋白質(zhì)生物合成過(guò)程中轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸。已知一級(jí)結(jié)構(gòu)的tRNA有160種，每種tRNA可運(yùn)載一種特定的a.a, 一種a.a可由一種或多種tRNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 分子量在25kd左右，70-90b沉降系數(shù)4S左右 堿基組成中有較多稀有堿基圖 3末端為CpCpA-OH,用來(lái)接受活化的氨基酸，此末端稱接受末端。 5末端大多為pG或pC 二級(jí)結(jié)構(gòu)是三葉草形P345圖5-12 tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)(三葉草模型)1966年Crick對(duì)于tRNA能識(shí)別幾種密碼子的現(xiàn)象，提出堿基配對(duì)的“擺動(dòng)學(xué)說(shuō)”

18、認(rèn)為除A-U、G-C配對(duì)外，還有非標(biāo)準(zhǔn)配對(duì)，l-A、l-C、I-U，并強(qiáng)調(diào)密碼子的5端第1、2個(gè)堿基嚴(yán) 格遵循標(biāo)準(zhǔn)配對(duì)，而第3個(gè)堿基可以非標(biāo)準(zhǔn)配對(duì)，具有一定程度的擺動(dòng)靈活性。四、mRNA的結(jié)構(gòu)mRNA是從DNA上轉(zhuǎn)錄而來(lái)的，其功能是依據(jù)DNA的遺傳信息，指導(dǎo)各種蛋白質(zhì)的生物合成，每 一種蛋白質(zhì)都由一種相應(yīng)的mRNA編碼，細(xì)胞內(nèi)mRNA種類(lèi)很多，大小不一，每種含量極低。從功能上講，一個(gè)基因就是一個(gè)順?lè)醋?，原核生物的mRNA是多順?lè)醋?，真核mRNA是單順?lè)醋印?順?lè)醋樱菏怯身樂(lè)丛囼?yàn)所規(guī)定的遺傳單位，相當(dāng)于一種蛋白質(zhì)的基因。1、真核mRNA(1) 、3-端有一段約30-300核苷酸的polyAPol

19、yA是轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)polyA聚合酶添加上，polyA聚合酶對(duì)mRNA專一。原核mRNA 般無(wú)polyAo polyA與mRNA半壽期有關(guān)，新合成的mRNA，其polyA較長(zhǎng)；而衰老 的mRNA，其polyA較短。polyA功能：PolyA是mRNA由核進(jìn)入胞質(zhì)所必需的形式。PolyA大大提高mRNA在胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。(2) 、5-帽子帽子5末端的鳥(niǎo)嘌呤N7被甲基化，鳥(niǎo)嘌呤核苷酸經(jīng)焦磷酸與相鄰的一個(gè)核苷酸相連，形成5-5-磷酸二酯 鍵。P346 帽子結(jié)構(gòu)帽子的功能：可抵抗5核酸外切酶降解mRNA?？蔀楹颂求w提供識(shí)別位點(diǎn)，使mRNA很快與核糖體結(jié)合，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成起始復(fù)合物的形成。2、原核mRNA

20、(多順?lè)醋?原核mRNA由先導(dǎo)區(qū)、插入序列、翻譯區(qū)和末端序列組成。沒(méi)有5/帽子和3/polyAo舉列：MS2病毒mRNA, 3569 b有三個(gè)順?lè)醋?，分別編碼A蛋白、外殼蛋白和復(fù)制酶三種蛋白質(zhì)。圖 MS2 病 mRNA5端先導(dǎo)區(qū)中，有一段富含嘌呤的堿基序列，典型的為5-AGGAGGU-3；位于起始密碼子AUG前約 10核苷酸處，此序列由Shine和Dalgarnc發(fā)現(xiàn)，稱SD序列。SD序列和核糖體16S的rRNA的3末端富含嘧啶堿基的序列互補(bǔ)，這種互補(bǔ)序列與mRNA對(duì)核糖體 的識(shí)別有關(guān)。原核mRNA代謝很快，半壽期幾秒至十幾分鐘。五、rRNA的結(jié)構(gòu)rRNA占總RNA的80%左右。功能：rRNA

21、是構(gòu)成核糖體的骨架，與核糖體結(jié)合蛋白一起構(gòu)成核糖體，為蛋白質(zhì)的合成提供場(chǎng)所。 大腸桿菌中有三類(lèi)rRNA （原核）5S rRNA16S rRNA23S rRNA真核細(xì)胞有四類(lèi)rRNA5S rRNA5.8S rRNA18S rRNA28S rRNA圖 原核核糖體（rRNA部分）圖 真核核糖體（rRNA部分）P346圖5-14 大腸桿菌 5S rRNA 結(jié)構(gòu)第四節(jié) 核酸的性質(zhì)解離性質(zhì)多聚核苷酸有兩類(lèi)可解離的基團(tuán)：磷酸和堿基能發(fā)生兩性解離。 磷酸是中等強(qiáng)度的酸，堿基的堿性較弱，因此，核酸等電點(diǎn)在較低的pH范圍內(nèi)。DNA等電點(diǎn)44.5RNA等電點(diǎn)22.5RNA鏈中，核糖COH的氫能與磷酸酯中的羥基氧形成

22、氫鏈，促進(jìn)磷酸酯羥基氫原子的解離水解性質(zhì)1、堿水解室溫，0.1mol/LNaOH可將RNA完全水解，得到2或3-磷酸核苷的混合物。圖在相同條件下，DNA不被水解。這是因?yàn)镽NA中C2-OH的存在，促進(jìn)了磷酸酯鍵的水解。DNA、RNA水解難易程度的不同具有極為重要的生理意義。DNA穩(wěn)定，遺傳信息。RNA是DNA的信使，完成任務(wù)后降解。2、酶水解生物體內(nèi)存在多種核酸水解酶RNA水解酶RNaseDNA水解酶 DNase核酸外一切酶核酸內(nèi)切酶 最重要的：限制性核酸內(nèi)切酶三、光吸收性堿基具有共軛雙鍵，使堿基、核苷、核苷酸和核酸在24029 Onm的紫外波段有強(qiáng)烈的光吸收,入 max=260nm1、鑒定純

23、度純 DNA 的 A260/A280應(yīng)為 1.8 （1.65-1.85,若大于 1.8,表示污染了 RNA 純 RNA 的 A260/A28o應(yīng)為 2.0。若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260A280比值明顯降低。2、含量計(jì)算1 ABS值相當(dāng)于：50ug/mL雙螺旋DNA或：40ug/mL單螺旋 DNA （或 RNA）或：20ug/mL核苷酸3、增色效應(yīng)與減色效應(yīng)P347圖5-15 DNA的紫外吸收光譜增色效應(yīng)：在DNA的變性過(guò)程中，摩爾吸光系數(shù)增大 減色效應(yīng)：在DNA的復(fù)性過(guò)程中，摩爾吸光系數(shù)減小。四、沉降特性（DNA）不同構(gòu)象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），起密度和沉降速率不同，用Cs-Cl

24、密度梯度離心就可以將它 們區(qū)分開(kāi)來(lái)，這一方法常用于質(zhì)粒DNA的純化P348圖516 Cs-CI密度梯度離心純化質(zhì)粒DNA相對(duì)沉降常數(shù)線型雙螺旋分子1.00松馳雙鏈閉環(huán)1.14切刻雙鏈環(huán)1.14單鏈環(huán)1.14線型單鏈1.30正超或負(fù)超螺旋雙鏈環(huán)狀1.41坍縮3.0五、變性、復(fù)性及雜交變性、復(fù)性是核酸的重要的物化性質(zhì)，相對(duì)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，核酸可以耐受反反復(fù)復(fù)的變性、復(fù)性。這也 是核酸研究技術(shù)的基礎(chǔ)。1、變性（1）、變性：核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價(jià)鍵斷裂。多核苷酸骨架上共價(jià)鍵的斷裂稱核酸的降 解。DNA的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)。P350圖5-18變性過(guò)程熱變

25、性因素*酸堿變性（pH小于4或大于11,堿基間氫鍵全部斷裂）變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛）r 260nm吸收值升高。變性后彳粘度降低，浮力密度升高。 、二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，部分失活。（2）、熔解溫度（Tm或稱熔點(diǎn)：DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度。DNA的Tm一般在70-85C之間。濃度50ug/mL時(shí)，雙鏈DNA A260=1.00,完全變性（單鏈）A26（= 1.37當(dāng)A260增加到最大增大值一半 時(shí)，即1.185時(shí)，對(duì)應(yīng)的溫度即為T(mén)m。（3）、影響DNA的Tm值的因素 DNA均一性均一性高，熔解過(guò)程發(fā)生在很小的溫度范圍內(nèi)。 G-C含量與Tm值成正比，G-C含量高，則Tm越高，測(cè)定Tm,可推

26、知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3 X2.44P351圖5-19 圖5-20 Tm值與GC含量的關(guān)系 介質(zhì)中離子強(qiáng)度其它條件不變，離子強(qiáng)度高，Tm高。P351 圖 5-212、復(fù)性變性DNA在適當(dāng)（一般低于Tm20-25C）條件下，兩條鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)。變性DNA在緩慢冷卻時(shí)（快速冷卻可防止復(fù)性），可以復(fù)性。DNA片段越大，復(fù)性越慢；DNA濃度 越大，復(fù)性越快。復(fù)性速度可用Co t衡量。Co為變性DNA原始濃度molL-1, t為時(shí)間，以秒表示。P352圖5-22,不同DNA的復(fù)性時(shí)間。A. 1個(gè)核苷酸對(duì)（A.U）圖上查出 Cot1/2=4X 10“mol.s/L若濃度為Co=1.

27、0m mol/L則復(fù)性50%所需時(shí)間t=0.004秒若要全部復(fù)性，Cot=104 t=0.1秒B. E.coli 4.2X 106堿基對(duì)圖上查出 Cot1/2=10 mol.s/L若濃度 Co=1.0 umol/L則復(fù)性 50%所需時(shí)間 t=107秒，約 115天。復(fù)性 100%Ct=500 mol.s/Lt=5X 108 秒，5758天。對(duì)于E.coli，4.2X 106bp,濃度達(dá)到umol/L級(jí)時(shí)，濃度已很高。復(fù)性機(jī)制：10-20bp成、拉鏈3、雜交（DNADNA、DNARNA）將不同來(lái)源的DNA混合加熱，變性后，慢慢冷卻使它復(fù)性。若這些異源DNA之間，在某些區(qū)域有相 同的序列，則復(fù)性時(shí)

28、會(huì)形成雜交分子。第五節(jié)核酸研究技術(shù)一、核酸的分離純化要求：盡可能保持其天然狀態(tài)。條件溫和，防止過(guò)酸、過(guò)堿。 避免劇烈攪拌，抑制核酸酶。1、DNA分離純化真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或鹽（1mol/L）,但不溶于0.14mol/L Nac中，利 用此性質(zhì)，可將DNP與RNA核蛋白分開(kāi)，提取出DNP。DNA核蛋白可用水飽和的酚抽提，去除蛋白質(zhì)。還可用氯仿異戊醇去除蛋白質(zhì)。2、RNA的制備（重點(diǎn)介紹mRNA的分離、純化）用0.14mol/L Nac使 DNP沉淀，上清中即為RNA核蛋白（RNP）。去蛋白：鹽酸胍、苯酚等必須防止RNA酶對(duì)RNA的破壞。二、核酸的凝膠電泳1、瓊脂糖

29、電泳 核酸分子的大小，遷移率與分子量的對(duì)數(shù)成反比 凝膠濃度 DNA的構(gòu)象，超螺旋最快，線形其次，環(huán)形最慢。 電流，不大于5V/cm2、PAGE電泳三、限制性核酸內(nèi)切酶（1979年發(fā)現(xiàn)）1、限制修飾系統(tǒng)2、II型核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶有I、II、III三種類(lèi)型，其中II型酶在DNA克隆中十分有用。II型酶的特點(diǎn)：限制和修飾活性分開(kāi)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是單一成分，輔助因子Mg2+,位點(diǎn)序列旋轉(zhuǎn)對(duì)稱（反 向重復(fù)）。II型酶的切割頻率識(shí)別位點(diǎn)444=2564 =4096Not I GCGGCCGC限制酶的命名：第一位：第二、三位：第四位：第五位：48=65536E.coRI（大寫(xiě)）屬名E種名的頭兩個(gè)字母小寫(xiě)co

30、菌株R羅馬字，從該細(xì)菌中分離出來(lái)的這一類(lèi)酶的編號(hào)。同裂酶：來(lái)源不同的限制酶（名稱自然不同），識(shí)別同樣的核苷酸靶序列，產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣 的末端。|BamH:GGATCC同裂酶 BstIBamHI：同裂酶:識(shí)別位點(diǎn)相同，切割位點(diǎn)相同，產(chǎn)生同樣的粘性末端。 同尾酶：來(lái)源各異，識(shí)別的靶序列不同，但都產(chǎn)生相同的粘性末端。GGATCCBstI GGATCC同尾酶:BclI TGATCA BglII AGATCTMbol GATC Sau3A GATC星號(hào)活力：在一定條件下（低離子強(qiáng)度，堿性pH,或50%甘油），限制酶的特異性降低。結(jié)果，它的 識(shí)別與切割所需的典型的核苷酸序列的數(shù)量和種類(lèi)會(huì)發(fā)生變化。

31、例女口 Hi ndHI AAGCTT四、DNA物理圖譜及構(gòu)建（限制酶切圖譜、DNA酶切位點(diǎn)圖譜）在研究某一種DNA時(shí)，弄清該DNA分子有哪些限制酶切位點(diǎn)是很重要的。建立物理圖譜是進(jìn)一步分 析此DNA的基礎(chǔ)，末端標(biāo)記法構(gòu)建DNA物理圖譜：（1）單酶完全降解和部分降解雙酶降解圖五、分子雜交1、 Southern BlottingP353 圖 5-23DNA樣酶切電泳* 變性轉(zhuǎn)膜定雜交洗滌放射自顯影變性（NaOH 0.5mol/L轉(zhuǎn)膜（NC膜）固定（80C, 4-6h雜交（高鹽濃度，68C，幾小時(shí)）Southern Blottin可用于DNA之間同源性分析，確定特異性DNA序列的大小和定位?？捎肈NA或RNA探針。2、 Northern Blotting研究對(duì)象是mRNA檢測(cè)可與探針DNA同源雜交的mRNA分子的存在，因而可以研