crispercas基因靶向技術

1、CRISPR技術CRISPR/Cas9 Systemu1987年，日本大阪大學（年，日本大阪大學（Osaka University）在對一種細菌）在對一種細菌編碼的堿性磷酸酶（編碼的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因進行研究時，）基因進行研究時，發(fā)現(xiàn)在這個基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的發(fā)現(xiàn)在這個基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，這些片段是由簡單的重復序列組成的，而且在片段的片段，這些片段是由簡單的重復序列組成的，而且在片段的兩端還存在一段不太長的特有的序列，正是這個特有的序列兩端還存在一段不太長的特有的序列，正是這個特有的序列以后被證明發(fā)揮了以后

2、被證明發(fā)揮了DNA的定向識別功能。的定向識別功能。2013以后，研究者們在包括以后，研究者們在包括science和和nature biotechnology等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹CRISPR-Cas系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實現(xiàn)精確系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實現(xiàn)精確的基因修飾。的基因修飾。CRISPR-Cas主要由兩部分組成：主要由兩部分組成：識別切割Cas（CRISPR associated）：）： 存在于存在于CRISPR位點附近，位點附近，是一種雙鏈是一種雙鏈DNA核酸酶。核酸酶。 CRISPR-Cas是很多細菌和大部

3、分古生菌的天然免疫系是很多細菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)。統(tǒng)。CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），被稱為規(guī)律成簇間隔短回文重復，實際上就是一種基因編輯器，是細菌用以保護自身對抗病毒的一個系統(tǒng)，也是一種對付攻擊者的基因武器。后來，研究人員發(fā)現(xiàn)，它似乎是一種精確的萬能基因武器，可以用來刪除、添加、激活或抑制其他生物體的目標基因，這些目標基因包括人、老鼠、斑馬魚、細菌、果蠅、酵母、線蟲和農作物細胞內的基因，這也意味著基因編輯器是一種可以廣泛使用的生物技術。CRISPRCRISPR擔當細菌的防護罩擔當細菌

4、的防護罩 CRISPRCRISPR簇是一個廣泛存在于細菌和古生菌基因簇是一個廣泛存在于細菌和古生菌基因組中的特殊組中的特殊DNADNA重復序列家族，其序列由一個前重復序列家族，其序列由一個前導區(qū)導區(qū)(Leader)(Leader)、多個短而高度保守的重復序列、多個短而高度保守的重復序列區(qū)區(qū)(Repeat)(Repeat)和多個間隔區(qū)和多個間隔區(qū)(Spacer)(Spacer)組成。組成。 前導區(qū)一般位于前導區(qū)一般位于CRISPRCRISPR簇上游，是富含簇上游，是富含ATAT長度長度為為300300500bp500bp的區(qū)域，被認為可能是的區(qū)域，被認為可能是CRISPRCRISPR簇簇的啟動子

5、序列。重復序列區(qū)長度為的啟動子序列。重復序列區(qū)長度為212148bp48bp，含有回文序列，可形成發(fā)卡結構。重復序列之含有回文序列，可形成發(fā)卡結構。重復序列之間被長度為間被長度為262672bp72bp的間隔區(qū)隔開。的間隔區(qū)隔開。SpacerSpacer區(qū)區(qū)域由俘獲的外源域由俘獲的外源DNADNA組成，類似免疫記憶，當含組成，類似免疫記憶，當含有同樣序列的外源有同樣序列的外源DNADNA入侵時，可被細菌機體識入侵時，可被細菌機體識別，并進行剪切使之表達沉默，達到保護自身別，并進行剪切使之表達沉默，達到保護自身安全的目的。安全的目的。 通過對通過對CRISPRCRISPR簇的側翼序列分析發(fā)現(xiàn)，在

6、其附簇的側翼序列分析發(fā)現(xiàn)，在其附近存在一個多態(tài)性家族基因。該家族編碼的蛋近存在一個多態(tài)性家族基因。該家族編碼的蛋白質均含有可與核酸發(fā)生作用的功能域白質均含有可與核酸發(fā)生作用的功能域( (具有核具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性) )，并且，并且與與CRISPRCRISPR區(qū)域共同發(fā)揮作用，因此被命名為區(qū)域共同發(fā)揮作用，因此被命名為CRISPRCRISPR關聯(lián)基因關聯(lián)基因(CRISPR associated)(CRISPR associated)，縮寫，縮寫為為CasCas。 目前發(fā)現(xiàn)的目前發(fā)現(xiàn)的CasCas包括包括Cas1Cas1Cas10Cas10等多

7、種類型。等多種類型。 CasCas基因與基因與CRISPRCRISPR共同進化，共同構成一個高度共同進化，共同構成一個高度保守的系統(tǒng)。保守的系統(tǒng)。 CRISPR的工作原理 當細菌抵御噬菌體等外源當細菌抵御噬菌體等外源DNADNA入侵時，在前導區(qū)的調控下，入侵時，在前導區(qū)的調控下，CRISPRCRISPR被轉錄為長的被轉錄為長的RNARNA前體前體(Pre RISPR RNA(Pre RISPR RNA，pre-crRNA)pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重復，然后加工成一系列短的含有保守重復序列和間隔區(qū)的成熟序列和間隔區(qū)的成熟crRNAcrRNA，最終識別并結合到與其互補的外

8、源，最終識別并結合到與其互補的外源DNADNA序列上發(fā)揮序列上發(fā)揮剪切作用剪切作用。 CRISPR-Cas系統(tǒng)賦予原核細胞針對外源DNA特異性免疫，而這種特異性是由間隔序列（spacer）決定的。如果改造成我們的目的如果改造成我們的目的基因，就可以定向的進基因，就可以定向的進行基因修飾行基因修飾 目前發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas系統(tǒng)有三種不同類型即I型、II型和III型，它們存在于大約40%已測序的真細菌和90%已測序的古細菌中。 其中II型的組成較為簡單，以Cas9蛋白以及向導RNA(gRNA)為核心組成，也是目前研究中最深入的類型。 在在IIII型系統(tǒng)中型系統(tǒng)中pre-crRNApre-cr

9、RNA的加工由的加工由CasCas家族中的家族中的Cas9Cas9單單獨參與。獨參與。 Cas9Cas9含有含有RuvCRuvC和和HNH2HNH2個獨特的活性位點，在個獨特的活性位點，在crRNAcrRNA成熟成熟和雙鏈和雙鏈DNADNA剪切中發(fā)揮作用。此外，剪切中發(fā)揮作用。此外，pre-crRNApre-crRNA轉錄的轉錄的同時，與其重復序列互補的反式激活同時，與其重復序列互補的反式激活crRNA(Trans-crRNA(Trans-activating crRNAactivating crRNA，tracrRNA)tracrRNA)也轉錄出來，并且激也轉錄出來，并且激發(fā)發(fā)Cas9Cas

10、9和雙鏈和雙鏈RNARNA特異性特異性RNaseIIIRNaseIII核酸酶對核酸酶對pre-crRNApre-crRNA進行加工。加工成熟后，進行加工。加工成熟后，crRNAcrRNA、tracrRNAtracrRNA和和Cas9Cas9組成組成復合體，識別并結合于復合體，識別并結合于crRNAcrRNA互補的序列，然后解開互補的序列，然后解開DNADNA雙鏈，形成雙鏈，形成R-loopR-loop，使，使crRNAcrRNA與互補鏈雜交，另一與互補鏈雜交，另一條鏈保持游離的單鏈狀態(tài)，然后由條鏈保持游離的單鏈狀態(tài)，然后由Cas9Cas9中的中的HNHHNH活性位活性位點剪切點剪切crRNAc

11、rRNA的互補的互補DNADNA鏈，鏈，RuvCRuvC活性位點剪切非互補活性位點剪切非互補鏈，最終引入鏈，最終引入DNADNA雙鏈斷裂雙鏈斷裂(DSB)(DSB)。 CRISPRCas9的剪切位點位于crRNA互補序列下游鄰近的PAM區(qū)(Protospacer Adjacent Motif)的5-GG-N18-NGG-3特征區(qū)域中的NGG位點，而這種特征的序列在每128bp的隨機DNA序列中就重復出現(xiàn)一次。研究結果表明，Cas9還可以剪切線性和超螺旋的質粒，其剪切效率堪比限制性內切酶。 由于crRNA參與并且起到精確導向的作用，所以CRISPRCas9打靶系統(tǒng)也被稱為RNA導向(RNA gu

12、ided)打靶系統(tǒng)。 Limitations of the CRISPRi methodFirst, the requirement for an NGG PAM sequence for S. pyogenes Cas9 limits the availability of target sites in the genome. And recent studies have suggested that the S. pyogenes Cas9 protein could partially recognize an NAG PAM, which might increase both t

13、he number of targeta -ble genome sites and that of potential off-target sites.Second, the targeting specificity is determined only by a 14-nt-long region (the 12 nt of the sgRNA and the 2 nt of the PAM), which might confer off-target effects in organisms with large genomes. The theoretical sequence

14、length for unique targeting with a 14-nt recognition sequence is 268 Mb (414).Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. 一種用來編輯基因組中DNA指令的強大科學工具現(xiàn)在也可以應用于RNA。來自加州大學伯克利分校和勞倫斯伯克利國家實驗室的一個研究人員小組，證實借助于一種方法可以編程CRISPR/Cas9蛋白復合物在序列特異性的靶位點識別并切割RNA。這一研究發(fā)現(xiàn)有可能改變RNA功能研究的模式，為檢測、分析和操控RNA轉錄物鋪平了道路。相關論文發(fā)表

15、在9月28日的Nature雜志上。 論文核心：就像可以利用Cas9以一種序列特異性方式來切割或結合DNA一樣，RCas9可以一種序列特異性方式切割或結合RNA。 Cas9之所以可能具有基因組編輯能力是因為PAM的存在，PAM標記出了切割的位點，并激活了Cas9酶的切割活性。在這項最新的研究中，Doudna、Mitchell和合作者們證實，以一種相似的方式PAMmers還可以促進對靶ssRNA的位點特異性內切核苷酸切割 盡管RNA干擾已被證實可用于操控某些生物體內的基因調控，我們仍抱著強烈的興趣開發(fā)出了RCas9這一基于核酸的RNA識別系統(tǒng)。現(xiàn)在我們清楚了RCas9的RNA識別分子基礎，就只需要設計并合成出一條匹配的導向RNA和互補PAMmer?！?RNA-directed gene editing specifically eradicates latent and prevents new HIV-1 infection 美國坦普爾大學研究人員7月21日，他們利用基因組編輯技術，首次成功地把艾滋病病毒從培養(yǎng)的人類細胞中徹底清除。 PNAS雜志 謝謝大家