蕎麥內(nèi)轉錄間隔區(qū)(ITS)的擴增及序列分析-四川農(nóng)業(yè)大學

1、蕎麥內(nèi)轉錄間隔區(qū)（ITS）的擴增及序列分析生物科學2002級 曾子賢指導老師 吳 琦 副教授摘 要：本研究以野生金蕎麥、栽培苦蕎為材料，采用改進的CTAB法提取蕎麥總DNA。設計一對特異性引物，對三份蕎麥ITS區(qū)序列進行PCR擴增，均獲得長約700bp的單一條帶。PCR產(chǎn)物測序結果表明，野生金蕎麥1號測序片段為699bp，包含ITS區(qū)序列為660bp；野生金蕎麥2號測序片段為678bp，包含ITS序列為646bp；苦蕎測序片段為640bp，包括ITS序列為599bp。將所得到的三份蕎麥ITS區(qū)序列分別與GenBank中登錄的蕎麥ITS序列進行比較。結果表明，野生金蕎麥1號與已知金蕎麥ITS區(qū)同

2、源率為90.8%，野生金蕎麥2號與已知的金蕎麥ITS區(qū)序列同源率達到91.6%。供試苦蕎與已知苦蕎ITS區(qū)同源率為99.8%。關鍵詞：野生金蕎麥；苦蕎；內(nèi)轉錄間隔區(qū)（ITS）序列；5.8S rDNA；PCR；序列分析Amplification and Sequences analysis of Internal Transcribed Spacer of BuckwheatZENG Zi-xian Biological Science, Grade 2002 Directed by WU Qi (Associate Prof. Ph. D)Abstract：Wildness F. cymosu

3、m and cultivated F. tataricum were investigated in this article. By the improving method of CTAB DNA extraction, total DNA from three buckwheat was obtained. A pair of specific primers was designed. The ITS regions of three buckwheat were amplified. The amplified fragments, about 700bp in length, we

4、re sequenced directly. The results show that the sequencing fragments are 699bp, 678bp and 640bp in length, including ITS regions of F. cymosum and F. tataricum are 660bp, 646bp and 599bp in length. Comparing F. cymosum and F. tataricum with sequences reported, it suggests that the homology rate of

5、ITS sequence of F. cymosum, NO. 1 is 91.6% and NO. 2 is 90.8% and the homology rate of the ITS sequence of F. tararicum is 99.8%.Keywords: Wildness F. cymosum; F. tataricum; ITS sequences; 5.8S rDNA; Sequence Analysis蕎麥屬于蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum Mill）植物。蕎麥不僅是營養(yǎng)豐富的糧食作物，也是有較好藥用價值的藥用植物。因此開展蕎麥屬植物的系

6、統(tǒng)發(fā)育和分子進化研究，進一步完善蕎麥屬植物的分類和新種、野生種的鑒定，對豐富的蕎麥遺傳資源保護和利用以及蕎麥屬植物的開發(fā)和改良提供系統(tǒng)學資料。KweonHeo等1對蕎麥屬的野生種進行了分類，將其劃分為3大類（表1）。 表1 蕎麥屬的分類第1類F. esculentum F. homotropicum F. esculentum. Ancestralis第2類F. cymosum F. tataricum F. tataricum. potanini第3類F. callianthumF. capillatumF. gilesiiF. gracilipesF. leptopodumF. uroph

7、yllumF. lineareF. macrocarpumF .pleioramosumF. rubifoliumF. statice近年來，分子生物學研究技術如RFLP分析、AFLP分析、SSR分析、RAPD分析、DNA序列分析為分子系統(tǒng)學的研究提供了重要的分子標記資料。其中核糖體DNA內(nèi)轉錄間隔區(qū)（ITS）序列分析已被廣泛的用于植物屬內(nèi)、近緣屬間的系統(tǒng)發(fā)育分析2。對于蕎麥種間親緣關系，國際上多從傳統(tǒng)的形態(tài)學、種間可雜交性、同功酶、cpDNA、rDNA、rbcL、accD、RAPD和ITS等方面進行研究。植物基因組因其結構和功能上的差異，進化速率有所不同。核基因組(nDNA)進化最快，約為葉

8、綠體基因組(cpDNA)的2倍，線粒體基因組(mtDNA)進化最慢，還不到葉綠體基因組的1/33。由于cpDNA的進化速率遠遠低于nDNA，限制了其在較低分類階元（如屬、亞屬）中的應用。因此，眾多的研究者將注意力集中到nDNA中進化較快的DNA序列上，18S-26S核核糖體DNA（nrDNA）的內(nèi)轉錄間隔區(qū)ITS(Internal transcribed spacer）正是符合要求的序列之一。植物細胞核中，編碼rRNA的基因是一些高度重復序列組成的多基因家族，其中，編碼核糖體小亞基rRNA的18S基因與5.8S、26S基因共同構成一轉錄單位（圖1所示）。其中，18S與5.8S、26S間的基因間

9、區(qū)分別為內(nèi)轉錄間隔區(qū)（ITS）1和2。也就是說，ITS區(qū)被5.8S分隔成ITS1和ITS2兩個區(qū)域。ITS1和ITS2的轉錄物在rRNA加工的過程中被切掉，但這兩部分在nrRNA成熟過程中具有重要作用4。18s Nuclear rDNAITS15.8s rDNAITS226s Nuclear rDNAITS Region圖 1 ITS區(qū)域結構（仿劉金姐 2000）本實驗通過GenBank中發(fā)表的蕎麥ITS序列（AB000325-AB000329，AB000339，AB000340）比對，根據(jù)White等（1990）5所報道的4條經(jīng)典ITS序列的引物,設計一對特異性引物，以三份蕎麥總DNA為模板

10、進行PCR擴增，用擴增產(chǎn)物直接測序（包括ITS1、5.8s rDNA和ITS2），將這三份蕎麥的ITS序列與GenBank中登錄的蕎麥ITS序列進行同源性比較和序列分析，為蕎麥的系統(tǒng)演化以及蕎麥的分類鑒定提供分子遺傳學證據(jù)。1材料與方法1.1材料三份實驗植物中，野生金蕎麥（F. cymosum）1號采集于四川農(nóng)業(yè)大學老板山，野生金蕎麥（F. cymosum）2號和苦蕎（F. tataricum）栽培種由成都高等烹飪?？萍夹g學校唐宇教授提供。1.2試劑和儀器DNA提取液(50mmol/L Tris-Cl，25mmol/L EDTA，300mmol/L NaCl，1%SDS，1%PVP)，無水乙醇

11、，70%乙醇，氯仿和異戊醇（24：1），5 mol/L KAc，TE（10mmol/L Tris-Cl，1mmol/L EDTA，H2O），RNaseA，ddH2O，10×PCR buffer，25 mmol/L MgCl2，10mmol/L dNTPs，Taq酶（PCR擴增試劑均購自上海生工），GoldView（購自賽百盛），0.8%瓊脂糖凝膠。 Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)，Eppendorf PCR儀，水平電泳儀，-20冰箱，制冰機，Thermo冷凍離心機，普通離心機，Unico UV-2102C型紫外可見分光光度計，恒溫水浴鍋，滅菌鍋，研缽，離心管，冰盤。1.3方法1.3.1三

12、份蕎麥總DNA的提取采用在CTAB法6以及王莉花等7提取方法基礎上改進的SDS微量快速提取DNA。1.3.1.1將100mg蕎麥嫩葉放入置于冰上已滅菌的研缽中，再加入300L DNA提取液充分研磨；1.3.1.2將磨細的樣品轉移到置于冰上的已滅菌的1.5mL離心管中，再向研缽中加入300L DNA提取液并轉入同一離心管中；1.3.1.3將離心管置于65水浴1小時，并不時輕輕上下顛倒離心管；1.3.1.4再加入125L 5M KAc冰浴30分鐘，再向離心管中加入400L氯仿/異戊醇（24：1），冰浴20min；1.3.1.5將樣品于4下，4000rpm離心15min，取上清液并轉入另一滅菌的離心

13、管中，并加入2.5倍體積的無水乙醇，上下輕輕顛倒；1.3.1.6在4下，8000rpm離心4min，而后棄上清液；1.3.1.7用70%乙醇漂洗沉淀1-2次，放入50烘箱干燥15min；1.3.1.8用50L TE溶解DNA，用含GoldenView的0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，測定OD260及OD280,確定DNA的純度及含量。置于-20冰箱中保存?zhèn)溆谩?.3.2 ITS序列引物的設計根據(jù)GenBank里已登陸的蕎麥ITS序列AB000325-AB000329，AB000339，AB000340和Yasuo Yasui等8、White等5報道的引物序列，設計、選取出一對特異引物：Primer

14、1：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3Primer2: 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3這對引物的擴增區(qū)包含了ITS1、5.8S和ITS2完整區(qū)域。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。1.3.3 三份蕎麥ITS序列的PCR擴增在趙暉等9報道的雪腐核盤菌ITS序列擴增體系及循環(huán)程序基礎上，改進反應體系以及退火溫度和延伸時間。采用PCR總體積50L，反應體系如下：ddH2O 38.5 L10×Buffer 5L25mmol/L MgCl2 2LdNTP mixture 1L20umol/L Primer1 1L20umol/L Primer2 1L模板DNA

15、1LTaq DNA聚合酶 0.5L（5U）總體積 50L按照上述順序分別加入，反應循環(huán)程序：95 3min30個循環(huán) 94 30sec 52.5 1min72 55sec72 10min4 保存1.3.4 PCR擴增產(chǎn)物的檢測取5L PCR產(chǎn)物與1L 6×Loading buffer混勻，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。1.3.5 PCR產(chǎn)物直接測序將PCR產(chǎn)物直接送上海英駿生物技術有限公司純化和測序。本實驗選取的一對引物均位于ITS序列以外（圖2），ITS1位于18s rDNA，ITS4位于26s rDNA5。因此直接采用下游引物進行單向測序，另一條鏈則以互補配對原則得出序列。

16、 圖2 ITS序列引物所在位置1.3.6 ITS序列分析將三份蕎麥rDNA的ITS序列的測序結果與已登陸的蕎麥ITS序列（AB000325-AB000329，AB000339，AB000340）比較，確定ITS1和ITS2的范圍。用生物信息學分析軟件DNASTAR 5.0對本實驗序列及GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中蕎麥屬ITS序列進行比對和分析。 2結果與分析2.1蕎麥總DNA的提取實驗所提取的野生金蕎麥1號、野生金蕎麥2號和苦蕎總DNA經(jīng)Unico UV-2102C型紫外可見分光光度檢測，三個樣品的OD260/OD280分別為：1.9、1.8和1.8。野生金蕎麥1號DNA有明顯的RNA的污染，可

17、通過電泳圖分析，但已滿足PCR反應對模板DNA純度的要求。三份蕎麥總DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖3，條帶較為清晰，完整性較好，可以用于PCR反應。15kb10Kb7.5kb5kb2.5kb1kbMarker 1 2 3 圖3 蕎麥總DNA電泳檢測1.野生金蕎麥1號；2.苦蕎；3.野生金蕎麥2號2.2三份蕎麥ITS區(qū)的PCR擴增以總DNA為模板，利用所設計的引物Primer1和Primer2（圖2 所示ITS1和ITS4） PCR擴增出野生金蕎麥1號、2號和苦蕎ITS區(qū)的特異性條帶。野生金蕎麥1號、2號擴增片段大小約700bp左右，苦蕎擴增片段略小于700bp與Yasuo Yas

18、ui（1998）8報道的蕎麥屬ITS區(qū)序列長度相近，結果見圖4。4500bp3000bp2000bp1200bp800bp500bp200bpMarker 1 2 3圖4 三份蕎麥ITS區(qū)PCR擴增圖譜1.野生金蕎麥1號；2.苦蕎；3.野生金蕎麥2號2.3三份蕎麥ITS區(qū)序列所獲得三份蕎麥ITS區(qū)序列由于測序的原因，在ITS1上游可能有14bp-26bp處未能測出，ITS區(qū)全序列下游有55bp-58bp在ITS區(qū)以外，測序結果如下。2.3.1野生金蕎麥ITS區(qū)序列*GAGAGACCCGCGTACCCGTTCTCAAACACCCCCGCGGGGCGCCTTCCCCGACCCCGGGAGAGATC

19、CCGGGAGAGGAGGAGGTGTCCCGCGGTGCCTGTGGGGCAAGCTCTCCCGAAACGCCAAGTACGGTGGGGGGACCCTTCCCGGCTCCAACGAACCCCGGCGCGGACCGCGCCAAGGACCACGAACAGAGCCGCGTCCCGCCCCTCCCGGGCCCCGGGAGGGGCGGATACCTCACGTCGTTTCTAACAAACAGAACGACTCTCGGCAACTGATATCTCGGCTCTCACATCAATGAAAAACGTAACTAAATGCGATACTTGGAGTGAATTGCACAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACG

20、CAAGTTGCGCCCGAGGGCTTCGGCTGAGGGGACGCCTGTCTGGGCGTCACCCATCCCGTCTCCCCCTCTCCCTCCTCCGTTCCTCGGAAGGAGGCGGGCGGCTAGGGCCCGACAGTGGCCCCCCGTGCGTCGCCTCGCGGCCGACCTAAAGGCCGACCCCGTGGCCGCCAACGGCCGCTACAATTGATGGTGTACTGGACTACGCATCGCGTCGCGTCCCCGCGTGCCCCGGGAGCTCAACCCAGACAACCGGATAGCCACGGTCTTCAGAACCGATGCGACCGCACATCACACTGAACT

21、ACACGCTGATTTAAGCATATCATTAAAGCGGAAA擴增片段為699bp，包含ITS區(qū)序列為660bp。由于測序原因序列上游可能有18bp未能測出，用*標記；下游有57bp位于26S rDNA上。全序列包括開端到箭頭處。2.3.2苦蕎ITS區(qū)序列*AGCAGACAGACCCGCGCACCCGTTCTCAAACACCCCTGCCGGCGGGGCGAGCTCTCCCGAAACACCAAGTACGGAGGGCGGACCCTTCCCGGCCCCAACGAACCCCGGCGCGGACCGCGCCAAGGACCACGAACAGAAGCGCGTCCCGCCCCTCCCGGTCCCCGGGAG

22、GGGCGGCGGCGCCGCGTCGTTTCTAAGAAACAGAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCTCCCGGCTGAGGGCACGCCTGTCTGGGCGTCACGCACCGCGTCGCCCCCCTCCCCCTCCTCCCTCCGCGGAAGGCGGGCGGTAAGGGGCGGACAGTGGCCCCCCGTGCGTCCTCGCGCGGCCGGCCTAAACGCAGACCCC

23、GTGGCCGCGAACGGCCGCGACGATTGGTGGTGTACCGGACTACGCATCGCGTCGCGTCCCCGCGAGCCGCGGGAGCTCAACCCGTGAAACCGGAGGGCCCCGGCCCTCCGAACCGTTGCGACCCCAGATCAGACGGGACTACCCGCTGAGTTTAAGCATATCATAAGCGGAA擴增片段為640bp，包含ITS區(qū)序列為599bp。由于測序原因序列上游可能有14bp未能測出，用*標記；下游有55bp位于26S rDNA上。全序列包括開端到箭頭處。2.3.3野生金蕎麥2號ITS區(qū)序列*CGCGTACCCGTTCTCAACACCCCCG

24、CGGGGCACCTTCCCCGACCCTAGGAGAGGAGGAGGTGTCCCGCGATGCCGGTGGGGCGAGCTCTCGCGAAAGCCAAGTACGGTGGGCGGACCCTTCCCGGGTCCCACGAACCCCGGCGCGGACCGCGCCGCGGACCACGAACAGAACCGCGTCCCGAGCCTCCCGGTCCCCGGGAGGGGCGGCGACATCGCGTCGTTTCTAACAAACAGAACGACTCTCGGAAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAACAACGTAACGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGTGGAATCCCTTGAA

25、CCATCCAGTCTTTGAACGCAACTTGCACCCGAGGCCTTCGGCTAAGGCTACGCCTGTCTGGGCGTCAGGCATCGCGTCGCCCCCTCCCCCTCCTCCCTTCCTCGGAAGGATGCGGGCGGCTAGGGGCGGACAGTGGCCCCCCGTGCGTCCCCCCGCGGCCGGCCTAAACGCAGACCCCGTGGCCGACAACGGGCGCGACAATTGGTGGTGTACTAGACTACGCATCGCGTCACGTCCCCGCGTGCCCCGGGAGCTCAACCCACAAAACCGGAGAGCCCCGGCCTTCCGAACCGTTGTGAC

26、ACCCGATCAGACGGCACTACCCGCTGAGTTTAACGATATCTTTAAACAGAACA擴增片段為678bp，包含ITS區(qū)序列為646bp。由于測序原因序列上游可能有26bp未能測出，用*標記；下游有58bp位于26S rDNA上。全序列包括開端到箭頭處。2.4三份蕎麥ITS區(qū)序列相似性比較野生金蕎麥1號野生金蕎麥2號苦蕎圖 5 三份蕎麥ITS區(qū)序列相似性比較將序列測定的三條ITS區(qū)序列均去掉位于26S rDNA上的序列進行比對。ITS區(qū)變化主要集中在ITS1，而5.8S rDNA和ITS2序列比較保守?？嗍wITS1序列中缺失了一段59bp（37bp-96bp）富含CG的片斷

27、。由圖5 可以看出野生金蕎麥1號和野生金蕎麥2號ITS序列之間的相似性較高，達到了86.6%，而兩份野生金蕎麥與苦蕎ITS序列之間的相似性則要低一些，但也能達到81.0-82.4%。表明，在同一蕎麥屬中不同種的蕎麥ITS序列之間存在一定的差異。2.5三份蕎麥ITS序列長度及CG含量將所測三份蕎麥ITS序列與已發(fā)表的金蕎麥和苦蕎ITS序列進行比較，確定ITS1和ITS2范圍，結果見表2。表2 三份蕎麥ITS1、ITS2和5.8S rDNA長度供試蕎麥ITS-15.8sITS-2(C+G)%野生金蕎麥1號野生金蕎麥2號苦蕎254bp232bp195bp162bp163bp160bp226bp226

28、bp230bp65.26%66.18%68.72%（注：ITS1中未包含由于測序原因可能未測出的14bp-26bp）GenBank中登錄的金蕎麥序列ITS1序列長度變化較大60bp（212bp-272bp），ITS2長度變化僅為4bp（221bp-225bp），5.8s rDNA序列長度變化僅為3bp。野生金蕎麥1號與已知金蕎麥序列對比，ITS區(qū)序列單核苷酸多態(tài)性位點為80個，其中ITS1單核苷酸多態(tài)性位點為28個；ITS2單核苷酸多態(tài)性位點為37個；5.8S rDNA單核苷酸多態(tài)性位點為15個；缺失2個。野生金蕎麥2號與已知金蕎麥序列對比，ITS區(qū)序列單核苷酸多態(tài)性位點為66個，其中ITS1

29、單核苷酸多態(tài)性位點為28個；ITS2單核苷酸多態(tài)性位點為23個；5.8S rDNA單核苷酸多態(tài)性位點為15個；缺失3個。將已知兩條苦蕎ITS序列對比，其序列完全相同，ITS1長度為213bp，ITS2長度為222bp，5.8S rDNA長度為164bp，與實驗所測苦蕎ITS序列相比，ITS區(qū)序列單核苷酸多態(tài)性位點為33個，其中ITS1單核苷酸多態(tài)性位點為10個；ITS2單核苷酸多態(tài)性位點為14個；5.8S rDNA單核苷酸多態(tài)性位點為9個；缺失14個。從表2可以看出兩份野生金蕎麥的ITS區(qū)序列長度是相當保守的，CG含量接近，而苦蕎與兩份野生金蕎麥的ITS區(qū)序列差異稍大一些。但是三條ITS區(qū)的5

30、.8S rDNA和ITS2長度都很保守，長度和堿基位點的變異主要在ITS1。2.6三份蕎麥ITS區(qū)的種內(nèi)相似性比較將野生金蕎麥1號、2號和苦蕎的ITS序列分別與GenBank上登錄的蕎麥ITS序列作種內(nèi)相似性的比較，結果見圖6和圖7。金蕎麥3號金蕎麥4號金蕎麥5號金蕎麥6號金蕎麥7號野生金蕎麥1號野生金蕎麥2號圖 6 野生金蕎麥1號和野生金蕎麥2號ITS區(qū)序列相似性比較（野生金蕎麥1號和野生金蕎麥2號為供試材料；金蕎麥3號-7號為GenBanBank登錄序列）野生金蕎麥1號ITS序列在種內(nèi)的相似性為70.6%-90.8%；野生金蕎麥2號ITS序列在種內(nèi)的相似性為82.6%-91.1%。結果表明

31、野生金蕎麥2號與已知的金蕎麥ITS區(qū)序列很接近，比野生金蕎麥1號與已知金蕎麥ITS區(qū)同源性高。苦蕎1號苦蕎2號實驗苦蕎圖 7 苦麥ITS區(qū)序列相似性比較（苦蕎1號、2號為GenBank登錄序列；實驗苦蕎為供試材料）供試苦蕎與已知苦蕎ITS區(qū)序列種內(nèi)相似性為99.0%-99.8%。表明苦蕎ITS區(qū)序列在種內(nèi)相似性很高。3討論與結論3.1蕎麥總DNA的提取本文采用了三種總DNA提取方法，均為小量DNA提取。方法一6是將與DNA提取液共同被研磨成勻漿的樣品加入一定量的氯仿，離心后取上清液用無水乙醇沉淀DNA；方法二9則是將研磨成勻漿的樣品于65水浴10min，離心之后加入氯仿/異戊醇（24：1），離

32、心后取上清用無水乙醇沉淀DNA；方法三(3.2 ITS序列PCR擴增的引物設計ITS成為系統(tǒng)和進化等研究中重要的分子標記，它具有兩個基礎：第一，作為18S和26SrDNA的組成部分，ITS在核基因組中高度重復，而且通過不等交換和基因轉換，這些重復單位間已經(jīng)發(fā)生了位點內(nèi)和位點間的同步進化11，即不同ITS拷貝間的序列趨于相近或完全一致，這就為對PCR產(chǎn)物直接進行測序奠定了理論基礎12,13。第二，DNA測序工作的難易程度與DNA片段長度有密切關系，被子植物的ITS區(qū)長度比較穩(wěn)定，包括5.8S rDNA在內(nèi)，總長度只有565-700bp，測序方便。同時，ITS1、ITS2分別位于18S-5.8S

33、rDNA、5.8S-26S rDNA之間，而18S、5.8S、26SrDNA的序列非常保守，這樣就可以用與它們序列互補的通用引物對ITS區(qū)進行PCR擴增、測序14。本實驗中的上游引物（Primer1）位于18S rDNA下游，上游引物位于26S rDNA上游。因此，能夠擴增到完全的ITS區(qū)序列。3.3蕎麥ITS序列的PCR擴增對于PCR反應中出現(xiàn)的非特異性條帶，通?？赡苡?個原因：1.模板DNA由于引物同源性高的非特位異性位點；2.退火溫度太低；3.過量的酶、引物和dNTP造成PCR反應混亂。本實驗擴增的目的片斷約為700bp，Tm值分別為62和58，根據(jù)Tm=4(C+G)+2(A+T)計算，

34、一般退火溫度比理論Tm值低5。因此最初將退火溫度設定為52，72延伸1min，但擴增結果出現(xiàn)大于1200bp和約500bp的非特異性條帶。將退火溫度調(diào)高0.5至52.5，延伸時間相應減少5s，擴增得到特異性很好的單一條帶。由于PCR擴增產(chǎn)物的特異性受Mg2+濃度的影響較大，因此篩選了Mg2+濃度。固定PCR反應體系的其他條件，使Mg2+終濃度分別為0.75mmol/L、1mmol/L、1.25mmol/L和1.5mmol/L。結果表明，Mg2+終濃度為0.75mmol/L的特異擴增條帶幾乎不可見；Mg2+終濃度為1mmol/L的特異擴增條帶單一，亮度最佳；Mg2+終濃度為1.25mmol/L特

35、異擴增條帶亮度與Mg2+終濃度1mmol/L特異擴增條帶相當，但是1200bp和500bp左右出現(xiàn)非特異性條帶；Mg2+終濃度為1.5mmol/L的特異擴增條帶亮度有所減弱，而非特異條帶亮度逐漸增加。一般認為PCR反應的Mg2+濃度為1.5-4mmol/L之間15，由于Mg2+濃度與酶的工作效率有關，過低的Mg2+濃度大造成擴增不出特異性的條帶；Mg2+濃度過高可能會產(chǎn)生非特異性條帶，甚至可能由于Mg2+與PCR混合物中DNA模板、引物和dNTP的磷酸基結合，降低了游離dNTP的濃度，從而抑制特異性擴增16。本實驗Mg2+的最佳工作濃度為1mmol/L。3.4蕎麥ITS序列及5.8S rDNA

36、序列的分析日本研究者于1998年對20種蕎麥屬的植物ITS區(qū)序列進行過較為完善的分析。ITS1和ITS2的長度比較保守。據(jù)統(tǒng)計，被子植物ITS1的長度為187-298bp，ITS2的長度為187-252bp。在目前所研究過的被子植物中，大多數(shù)類群中這兩個片段所提供的信息量相近，雖然單獨根據(jù)ITS1或ITS2均可得出重要的系統(tǒng)學結論17，但考慮到這兩個片段的長度有限，各自的信息量并不充足。因此，大多數(shù)情況下都是將這兩個片段綜合起來考慮。關系密切的物種間ITS長度非常接近，而序列有一定程度的變異。 被子植物核rDNA的ITS區(qū)中，5.8SrDNA的長度非常保守，一般為163bp或164bp，僅在大

37、豆屬中發(fā)現(xiàn)其長度為168bp18，而且它的序列也很保守，在有些類群中根本沒有變異19。因此，5.8SrDNA提供的信息有限，在研究中可不必測該片段的序列20。但近幾年也有研究表明，高度保守的5.8SrRNA基因序列對揭示遠緣屬間的系統(tǒng)發(fā)育關系能提供一定的信息量，在研究中可將5.8S與ITS序列結合起來14。本研究將ITS1、5.8S rDNA和ITS2序列結合起來對實驗中野生金蕎麥和苦蕎進行同源性分析。結果發(fā)現(xiàn)，本研究中的野生金蕎麥1號和2號ITS序列與GenBank登錄的金蕎麥序列比對，野生金蕎麥2號與已知的金蕎麥ITS區(qū)序列很接近，比野生金蕎麥1號與已知金蕎麥ITS區(qū)同源性高?？嗍w與已知苦

38、蕎ITS區(qū)序列對比，種內(nèi)相似性很高，同源率為99.8%。不同種的蕎麥在ITS區(qū)序列上存在一定的差異。由于種的不同，ITS區(qū)序列長度和堿基有較大的差異，這正符合了利用ITS區(qū)序列分析對蕎麥屬的分類。在種間，ITS區(qū)序列存在的較小差異，可能由于實驗材料采集地的不同，生活環(huán)境使蕎麥的進化不同，同時豐富了蕎麥的遺傳多樣性。本研究由于供試材料樣本和時間限制，僅將野生金蕎麥1號、2號和苦蕎這三種蕎麥分別與已知的金蕎麥和苦蕎ITS序列進行比對，難以構建蕎麥屬的系統(tǒng)發(fā)育樹，不足以對蕎麥屬進行系統(tǒng)分類和遺傳評價。因此需要對更多的蕎麥屬材料進行分子遺傳分析，這對蕎麥種質資源的保護和利用具有重要意義。參考文獻1Kw

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