非小細(xì)胞肺癌血漿EGFR突變

1、非小細(xì)胞肺癌血漿EGFR突變與血清腫瘤標(biāo)志物水平的關(guān)系肖何，王閣,王東，楊鎮(zhèn)洲，張輝，任育江，楊宇馨，馬俊剛，王正波，余嫻，何蓉，何軒，蔣渝涵，王帥，岳渝，李高偉，蘇曉娜，羅維，李娟，候俊，許明芳(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心，重慶400042)摘要：目的：探討非小細(xì)胞肺癌外周血游離DNA樣本EGFR突變率與臨床基線特 征和血清腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平的關(guān)系。方法：臨床確診祚小細(xì)胞肺癌166例。利 用PCR和變性高效液相色譜法分析EGFR19和21外顯子突變。其中89例同時利用 多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片檢測系統(tǒng)檢測癌胚抗原(CEA)、糖連抗原125 (CA125)、 糖連抗原153 (CA

2、153)等血清腫瘤標(biāo)志物，分析突變率與臨床基線特征和腫瘤標(biāo) 志物表達(dá)水平的關(guān)系。結(jié)果：166例非小細(xì)胞肺癌中，EGFR總突變率19.9%。女 性突率顯著高于男性(尸=0.037)。腺癌突變率高于其他組織學(xué)類型，但未達(dá)到顯著 水平(P=0.096)。CEA、CA153中高表達(dá)患者EGFR突變率顯著高于低表達(dá)者 (P=0.048, P=0.017), CA199高表達(dá)患者僅有高于中低表達(dá)者的趨勢(尸二0.070)。多 變量Logistic分析表明，腺癌、CA153、CEA中高表達(dá)與突變率相關(guān)。結(jié)論：對 于晚期非小細(xì)胞肺癌，血漿EGFR突變率與腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平明顯相關(guān)。血清 腫瘤標(biāo)志物水平可作為判

3、斷EGFR突變優(yōu)勢群體的參考因素。關(guān)鍵詞：非小細(xì)胞肺癌；表皮生長因子；血漿游離DNA；突變；腫瘤標(biāo)志物The relationship between EGFR mutations detected in plasma andexpressions of serum tumor markers in patients with advancednon-small cell lung cancerXiao He, Wang Ge, Wang Dong, Yang Zhenzhou, Zhang Hui, Ren Yujiang, Yang Yuxin, Ma Jungang, Wang Zhen

4、gbo. Yu Xian, He Rong, He Xuan, Jiang Yuhan, Wang Shuai, Yue Yu, Li Gaowei, Su Xiaona, Luo Wei, Li Juan, Hou Jun, Xu Mingfang (Cancer Center, Daping Hospital and Research Institute of Surgery, Third Military Medical University, Chongqing, 400042, China)Abstract: Objective: To investigate the relatio

5、nship between EGFR mutations rate detected in plasma free DNA and clinical characteristics of baseline as well as expression level of serum tumor markers in patients with advanced non-small cell lung cancer (NSCLC). Method: One hundred and sixty six patients with non-small cell king cancer confirmed

6、 pathologically were studied. PCR and DHPLC were performed to detect EGFR mutations in exons 19 and 21 in 166 cases with NSCLC. The serum levels of 12 tumor makers were analyzed with multi-tumor markers protein biochip detective system in 89 patients simultaneously. The associations between EGFR mut

7、ation rate and the patients' clinical characteristics at baseline along with the corresponding serum level of tumor makers were determined. Results： Mutation rate of EGFR was 19.9% in 166 NSCLC patients. Mutation rate in female was significantly higher than that in male patients (P=0.037). A non

8、significant trend for higher mutation rate in adenocarcinoma was observed compared with other histological types (P=0.096). The mutation rate in patients with high serum CEA and CA153 level was significantly higher than that in low serum CEA and CA153 patients (0=0.048, P=0.017), However, there was

9、no significant difference in the mutation rate between high serum CAI99 level and low serum CAI99 level group(P=0.070). Multivariable Logistic regression showed that adenocarcinoma, CEA and CA153 high expression were significantly associated with EGFR mutation. Conclusion： The mutation rate of EGFR

10、was significantly related with the expression level of serum tumor markers, which could be a potential indicator to determine the patients with EGFR mutantion. Keywords： Non-small cell lung cancer; epidermal growth factor receptor; plasma free DNA; mutation; tumor markersCorresponding author: Wang G

11、e, E-mail: wangge70自2004年Lynch”等報道了 EGFR激活突變與TKI治療緩解的藥理機(jī)制以 來，表皮生長因子受體(epidennal growth factor receptor, EGFR)酪氨酸激酶區(qū) (tyrosine kinase, TK)激活突變與晚期非小細(xì)胞肺癌小分子酪氨酸激酶抑制劑療效 的關(guān)系成為臨床研究的熱點(diǎn)。多項臨床實驗表明，EGFR19缺失突變和21外顯 子L858R置換突變是非小細(xì)胞肺癌TKI治療獲益的重要預(yù)測因子J1。特別是， 對于一線TKI治療，IPASS.WJTOG3405等III期臨床實驗均表明，治療前EGFR 突變情況是選擇治療策略的重

12、要因素回L變性高效液相色譜法(denaturing high-performance liquid chromatography, DHPLC)與突變檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”直接測序法相比，具有快速、高通量、費(fèi)用低廉 等優(yōu)點(diǎn)，其檢測靈敏度可達(dá)3%-5%件咒對于晚期非小細(xì)胞肺癌，國內(nèi)外多項研 究表明，從外周血檢測EGFR突變率與配對石蠟樣本直接測序法檢測有較高符合 率回。并且，國內(nèi)王潔19-網(wǎng)等已應(yīng)用DHPLC法建立了晚期非小細(xì)胞肺癌患者 血漿EGFR19、21外顯子兩個熱點(diǎn)突變與TKI治療后緩解及短期療效的關(guān)系。本文應(yīng)用DHPLC法檢測重慶地區(qū)經(jīng)治后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的晚期非小細(xì)胞肺癌 患者外周血EGFR19

13、外顯子缺失突變和21外顯子L858R置換突變情況，并分析 突變與臨床基線特征及血清腫瘤標(biāo)志物的關(guān)系。1 .材料與方法L1患者資料對166例重慶地區(qū)病理學(xué)證實為非小細(xì)胞肺癌患者外周血血漿 DNA樣本EGFR19外顯子缺失突變和21外顯子L858R置換突變與基線臨床 特征進(jìn)行分析。其中89例患者同時檢測了 12種血清腫瘤標(biāo)志物。1.2 EGFR突變分析和腫瘤標(biāo)志物檢測EGFR突變檢測樣本全為外周血血漿游 離DNA, EGFR突變采用變高效液相色譜法，由北京市表觀生物技術(shù)有限公 司完成。12種腫瘤標(biāo)志物采用湖北數(shù)康公司全自動化學(xué)發(fā)光檢測分析，在本 院腫瘤中心實驗室完成。1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPS

14、S 20軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，EGFR突變與基線特征組成 比采用f檢驗或Fisher確切概率法?；€特征和血清腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平與 EGFR突變率的關(guān)系采用X2檢驗或Fisher確切概率法以及Logistic回歸分析。 PV0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。2 .結(jié)果2.2 患者資料2011年6月到2012年6月共166例IIA-IV期非小細(xì)胞肺癌患者檢測EGFR 突變，平均年齡61歲。男性患者占74.4%,腺癌患者63.3%, 74.7%患者為晚期。 總共檢測到突變33例，EGFR總突變率19.9%,其中19外顯子缺失突變11例, 21外顯子L858R點(diǎn)突變22例。同時具有血清腫瘤標(biāo)志物結(jié)果的89例

15、亞組基線 水平與總體無顯著差異，見表1。表1 166總體與89例亞群基線水平I；蹴臨床病理參數(shù)n=166n=89n百分?jǐn)?shù)n百分?jǐn)?shù)P性別男12474.70%7078.70%4225.30%192130%0.481非腺癌6136.70%3539.30%腺癟10563.30%5460.70%0.685吸煙史有9255.40%5460.70%無7444.60%3539.30%0.419分期IIA-IIIA4225.30%1618.00%IIIB-IV12474.70%7382.00%0.184突變狀態(tài)野生型13380.10%7078.70%突變3319.90%192130%0.7812.3 突變與基線

16、特征的關(guān)系166例EGFR突變與基線關(guān)系分析中，EGFR突變率僅與性別存在顯著相 關(guān)性。女性突率31.0%(13/42)顯著高于男性突變率16.1%(20/124)o腺癌突變率 23.8%(25/105)高于非腺癌突變率13.1%(8/61),但未達(dá)統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.096)。在 89例亞組中，EGFR突變總共19例，突變率2L3%。女性突變率高于男性(31.6% vs 18.6%),腺癌突變率高于非腺癌(27.8% vs 11.4%),但均無顯著差異(P=0. 220, P=0.066)o表2血漿EGFR突變與基線特征的關(guān)系臨床病n=l 66n=89n突變數(shù)Pn突變數(shù)P性別男12420(1

17、6.1%)女4213(31.0%)0.0377013(18.6%)196(31.6%)0.224組織學(xué)類型非腺癟618(13.1%)354(11.4%)腺癟10525(23.8%)0.0965415(27.8%)0.066吸煙史有9217(18.5%)5410(18.5%)無7416(21.6%)0.614359(25.7%)0.418分期IIA-IIIA429(21.4%)164(25.0%)IIIB-IV12424(19.4%)0.7717315(20.5%)0.7392.4 突變與腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平的關(guān)系89例患者12種血清腫瘤標(biāo)志物統(tǒng)計結(jié)果見表3。將血清表達(dá)水平高于相應(yīng) 標(biāo)志物中位值的

18、病例定為該種標(biāo)志物中高表達(dá)水平，高于75%分位數(shù)的病例定為 高表達(dá)水平。在12種腫瘤標(biāo)志物中，與非小細(xì)胞肺癌相關(guān)的CEA、CA125、 CA153、CA199、CA242血清表達(dá)水平與EGFR突變率用片檢驗分析得出，只 有CEA、CA153中高表達(dá)患者EGFR突變率顯著高于低表達(dá)者，CA199高表達(dá) 患者僅有高于中低表達(dá)者的趨勢（尸=0.070）。表3 12種血清腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平統(tǒng)計描述標(biāo)志物均值標(biāo)準(zhǔn)差25%分位數(shù)中位值75%分位數(shù)最小值最大值CEA(ng/ml)13.1119.581.934.8212.070.5190.53CA125(U/ml)69.12112.0510.7522.235

19、7.294.24651.19CA153(U/ml)11.9113.594.437.6813.980.5093.14CA199(U/ml)373281.716.1310.9422.482.0047532CA242(U/ml)23.0850.222.955.5710.091.16200.00Ferritin(ng/nil)187.38117.0787.36157.71273.1716.03568.45NSE(ng/inl)3.773.671.682.343.841.0019.09pHCG(mIU/ml)0.790.970.160.421.030.044.49AFP(ng/ml)8.3112.831

20、.563.5510.460.2484.97PSA(ng/ml)0.780.970.150.421.030.044.49fPSA(ng/ml)0.280.320.030.180.380.021.44HGH(ng/ml)0.480.990.010.180.540.017.76表4血清腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平與EGFR突變的關(guān)系標(biāo)志物表達(dá)水平n突變數(shù)P表達(dá)水平n突變數(shù)PCEA>12.07226(27.3%)>4.824313(30.2%)< 12.076713(19.4%)0.549<4.82466(13.0%)0.048CA125>57.29224(18.2%)>22

21、.234411(25.0%)< 57.296715(22.4%)0.773< 22.23458(17.8%)0.406CA153>13.98214(19.0%)>7.684414(31.8%)< 13.986815(22.1%)1.000<7.68455(11.1%)0.017CA199>22,48228(36.4%)>10,944412(27.3%)< 22.486711(16.4%)0.070< 10.94457(15.6%)0.177CA242>10.09216(28.6%)>5.574412(27.3%)<

22、10.096813(19.1%)0.372<5.57457(15.6%)0.1772.5 Logistic回歸構(gòu)建預(yù)測突變模型選擇上述/檢驗P<0.1者和兩個重要臨床參數(shù)即性別和組織學(xué)類型作為二 分類變量，以突變與否作為因變量，分別進(jìn)行單變量Logistic回歸分析。單變量 分析結(jié)果見表5o僅CA153和CEA回歸系數(shù)的似然比假設(shè)檢驗有統(tǒng)計學(xué)意義。 性別和組織學(xué)類型是重要的臨床參數(shù)，因此這5個變量全作為候選變量，進(jìn)行逐 步向前回歸，以PvO.15作為變量入選標(biāo)準(zhǔn)，以P>0.2作為變量排除標(biāo)準(zhǔn)。初步 主效應(yīng)模型見表6。其中，CA153中高表達(dá)是與EGFR突變最相關(guān)因素，其次為

23、組織學(xué)類型和CEA中高表達(dá)。判斷EGFR突變優(yōu)勢人群的傳統(tǒng)臨床參數(shù)包括腺 癌，女性，不吸煙等。在該研究群體中，Logistic回歸模型表明，腺癌且CA153 和CEA大于中位濃度與EGFR突變相關(guān)。腺癌群體中，CA153和CEA均大于 中位濃度患者EGFR突變率大概是小于中位濃度EGFR突變率的8.31倍， OR=8.31 95%CI(1.71,40.23)o 而在這 89 例中，實際 OR=6.00 (8/8)/(2/12)。表5單變量Logistic回歸分析結(jié)果回歸系數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)誤 優(yōu)勢比OR 95.0%置信變量P(P) (SE) (OR)區(qū)間MiddleCA1531.3170.5743.73

24、31.211, 11.5050.0155MiddleCEA1.0610.5492.889(0.984.8.4810.0462HighCA1991.0680.5522.9090.985, 8.5900.0570Histology1.0920.6122.9810.898,9.8920.0574Sex0.7050.5812.0240.648,6.3200.2355表6多變量逐步Logistic回歸分析結(jié)果變量回歸系數(shù)(p)標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)優(yōu)勢比(OR)OR 95.0%置信區(qū)間PMiddleCA1531.2720.5953.5671.111, 11.4560.033Histology1.0850.640

25、2.9590,845, 10.3680.090MiddleCEA0.8450.5762.3290,754, 7.1960.1423 .討論本研究中EGFR總體突變率只有20%左右，低于同樣用外周血游離DNA和 DHPLC方法檢測報道的34.3%和35.4%【，前者有230例總樣本數(shù)量，后者有 744例。盡管為單中心研究，由于樣本量大，很能代表國內(nèi)大多數(shù)腫瘤中心晚期 非小細(xì)胞肺癌外周血EGFR突變率。最近，王潔等發(fā)現(xiàn)一線化療可顯著降低外周 血EGFR突變率【川。264例IHB-IV期非小細(xì)胞肺癌患者一線兩個化療周期后， 外周血EGFR突變率從治療前34.5%下降到治療后23.1%。本研究群體幾乎

26、所有 患者接受了一線或二線化療，可能是總體突變率較低的原因。在沒有根據(jù)基線特征選擇病例的前期臨床研究中，EGFR突變率僅為 12.1%-14.8%(12-,3o在IPASS研究中，基于臨床特征選擇病人其總體突變率高達(dá) 59.7%,總?cè)后wTKI治療的客觀緩解率為43.0%,而在突變亞組中，TKI治療客 觀緩解率達(dá)71.2%。在完全由EGFR突變患者構(gòu)成的病例群體一線TKI治療相 似研究中，TKI治療客觀緩解率為73.7%,與IPASS突變亞組非常接近【川。因此, 檢測EGFR突變是患者接受TKI治療受益的重要預(yù)測因素。傳統(tǒng)的初步判斷潛 在突變的臨床標(biāo)準(zhǔn)為女性、腺癌、不吸煙，亞裔人群等。該研究表明

27、，血清腫瘤 標(biāo)志物表達(dá)水平與突變相關(guān)。通過Logistic回歸分析，在傳統(tǒng)的臨床標(biāo)準(zhǔn)女性和 腺癌基礎(chǔ)上增加了兩個因素，即CEA和CA153中位水平以上表達(dá)。在89例群 體中，總體突變率21%(19/89),女性且為腺癌突變率31%(5/16),而通過CEA、 CA153及腺癌篩選，突變率增加到50%(8/16),盡管與女性腺癌群體突變率無顯 著差異(=1.166 P=0.280)o由于突變檢測方法靈敏度的限制，起始基因組DNA質(zhì)量是決定分析成功的 關(guān)鍵。在病理標(biāo)本情況下，可通過簡單的HE染色，收集富含腫瘤細(xì)胞的區(qū)域作 為基因組提取的起始材料。但是對于血漿樣本，并沒有判斷游離DNA來源的標(biāo) 志物

28、。晚期肺癌III于腫瘤負(fù)荷大，大量腫瘤細(xì)胞的壞死和凋亡其基因組DNA釋 放到血液循環(huán)中，因此在以組織配對樣本突變作為標(biāo)準(zhǔn)下，血漿游離DNA樣本 檢測突變有較高的靈敏度(68.4%),而對早期肺癌卻非常低(14.8%)1。對于二、 三線治療患者，其腫瘤突變性質(zhì)和腫瘤負(fù)荷都較初診時有所變化。而血清腫瘤特 異性表達(dá)標(biāo)志物水平可作為反映腫瘤負(fù)荷的指標(biāo)，間接地反映了血漿游離DNA 的來源。事實上，在89例群體中，Mann Whitney U檢驗表明，突變亞群CA153 水平有高于野生型亞群的趨勢(尸二0。56),而完全與分期無關(guān)(P=0.627)。由于樣本數(shù)量的限制，以及總體突變比例較小的緣故，使得多項

29、假設(shè)檢驗的 產(chǎn)值未達(dá)到顯著性，本研究也并未用獨(dú)立驗證集檢驗該預(yù)測模型的效能。Logistic 回歸中，保留P值未到達(dá)統(tǒng)計學(xué)意義的因子是為了與EGFR突變?nèi)后w傳統(tǒng)臨床 因素比較。實際上，在嚴(yán)格的0.05顯著水平上，只有CA153與突變相關(guān)(尸二0.022)。 這恰好說明了經(jīng)治后的NSCLC群體與初診群體在EGFR突變優(yōu)勢臨床特征上的 不同。近來，細(xì)胞角蛋白19片段(cytokeratin 19fragment, CYFRA21-1)和鱗狀細(xì) 胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen, SCCAg)與 CEA 一起，在非小細(xì)胞肺癌 診斷，晚期肺癌一線化療療效評估等方

30、面有越來越多的研究，并且顯示出較高的 診斷價值和化療療效預(yù)測判斷作用“5-。本研究血清標(biāo)志物未分析細(xì)胞角蛋白 19片段和鱗狀細(xì)胞癌抗原的表達(dá)情況，將這兩個因素加入預(yù)測模型可能會得到 更穩(wěn)健的結(jié)果。參考文獻(xiàn)：1 Lynch TJ, Bell DW, Sordella R. et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinibJ. N Engl J Med, 2004. 350(2

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