hUVECs在不同切應(yīng)力作用下的形態(tài)及纖毛發(fā)生

1、https:/hUVECs 在不同切應(yīng)力作用下的形態(tài)及纖毛發(fā)生在不同切應(yīng)力作用下的形態(tài)及纖毛發(fā)生摘要：分別應(yīng)用紫杉醇熒光和免疫熒光標(biāo)記法顯示 hUVECs（humanumbilical vein endothelial cells， hUVECs）在不同切應(yīng)力加載下微管骨架的裝配動(dòng)態(tài)及初級(jí)纖毛的形態(tài)發(fā)生。結(jié)果表明，以梯度切應(yīng)力加載 24h，隨著切應(yīng)力增大，細(xì)胞由梭形逐漸變圓，長(zhǎng)寬比降低，胞質(zhì)微管向細(xì)胞核周?chē)Y(jié)并發(fā)生裝配；14dynes/cm2 切應(yīng)力加載 48h 后，微管向切應(yīng)力方向延伸導(dǎo)致細(xì)胞呈長(zhǎng)梭型，微管停止裝配；以 15dynes/cm2 切應(yīng)力加載 28h 后，纖毛基體在細(xì)胞表面的定

2、位不可見(jiàn)，纖毛微管解聚；再以 1dynes/cm2 切應(yīng)力加載 18h，又可觀(guān)察到纖毛基體在細(xì)胞表面的重新定位。因此，切應(yīng)力作用可誘導(dǎo) hUVECs 形態(tài)變化，該變化經(jīng)歷了微管骨架的解聚、向細(xì)胞核方向聚集及重新裝配過(guò)程；此外，切應(yīng)力能夠影響初級(jí)纖毛的形態(tài)發(fā)生，該現(xiàn)象可能導(dǎo)致了初級(jí)纖毛在心血管 系統(tǒng)中的分布不均，并為“纖毛疾病”的治療提供新的思路。關(guān)鍵詞：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；切應(yīng)力；微管類(lèi)細(xì)胞骨架；初級(jí)纖毛；纖毛發(fā)生中圖分類(lèi)號(hào)：Q245 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-7847（2015）01-0013-06Changes on Morphology and Ciliogenesis of h

3、UVECs Loaded on DifferentFlow Shear StressLI Xiu-mao1， SHENG Xin2*， GUO Peng-fei2， CHEN Cheng-he2，HE Lei2（ 1. Cardiothoracic Surgery Department ， Affiliated Hospital of ZunyiMedical College ， Zunyi 563000 ， Guizhou ， China ； 2. Department ofBiochemistry， Zunyi Medical College， Zunyi 563000， Guizhou，

4、 China）Abstract ：The microtuhular cytoskeleton assembly dynamics andciliogenesis of human umbilical vein en-dothelial cells （hUVECs） loaded ondifferent flow shear stress were separately visualized by using FLUTAX direct-flurescent labeling and immunofluorescence with anti-y-tubulin antibody. Theresu

5、lts demonstrated that when the cells were loaded on increased gradientflow shear stress for 24 h， the cell shape hecame spherical from spindle，the aspect ratio reduced ，and the microtubules in cytoplasm graduallygathered around the nucleus and initiated assembly. When some cells wereloaded on flow s

6、hear stress of 14 dynes/cm2 for about 48 h， the microtubuleselongated to the direction of the flow shear stress and accomplished assem-bly， and the cell shape became elongated and spindled. The basal bodies ofprimary cilia could not he ob-served on the cell surface and microtuhules ofcilia were depo

7、lymerased as cells were loaded on laminar shear stress （15dynes/cm2） for 28 h， but interestingly， the basal bodies appeared if cellswere further treated with flow shear stress of 1 dynes/cm2 for 18 h.Therefore ， flow shear stress can induce changes of cytomor- phology ofhUVECs which undergo a proces

8、s of depolymerization ，elongated andhttps:/reassembly of microtuhules. Moreover ， it also influent the ciliogenesis ，whichmayresultindisproportiondistributionoftheprimaryciliaincardiovascular system ，and provide new ideas for the treatment ofciliopathies.Key words： human umbilical vein endothelial c

9、ells （hUVECs）； flowshear stress （ FSS ） ；microtuhular cy-toskeleton ；primary cilia ；ciliogenesis（Life Science Research， 2015 ， 19（1）： 013018） 近年來(lái)，基于局部血流動(dòng)力學(xué)與心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的密切關(guān)系，血流切應(yīng)力（flow shear stress， FSS）對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cells，VECs）的形態(tài)及功能影響成為研究熱點(diǎn)1，2。人們發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)較高切應(yīng)力區(qū)域的 VECs 多為橢圓形，而低切應(yīng)力區(qū)域多為多角形3。

10、體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在切位力作用下，細(xì)胞傾向于向切應(yīng)力方向定位4。大多數(shù)的研究認(rèn)為切應(yīng)力對(duì)細(xì)胞形態(tài)變化的影響主要源于肌動(dòng)蛋鵲鬧刈5，相比之下有關(guān)微管類(lèi)細(xì)胞骨架在此過(guò)程中的作用還缺乏深入的研究在細(xì)胞功能方面，高速、單向的血流所產(chǎn)生的層流切應(yīng)力（15dynes/cm2）對(duì) VECs 具有抗血栓、抗增生、抗炎癥等作用，而低速、擺動(dòng)或回旋的血流所產(chǎn)生的低切應(yīng)力（1 材料與方法1.1 材料hUVECs 購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，傳代培養(yǎng)。1.2 方法以平行平板流動(dòng)小室（parallel-plate flow chamber， glycotech）為流室，以數(shù)字精密蠕動(dòng)泵為動(dòng)力，并以真空泵維持系統(tǒng)密封性建立起

11、內(nèi)皮細(xì)胞體外流動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)（見(jiàn)圖 1）12。直接熒光采用本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的 FLUTAX 方法13，主要步驟如下：1）分別將靜置和切應(yīng)力加載培養(yǎng)的 hUVECs 以 4%的多聚甲醛中固定 30min，0.01mol/LPBS 清洗 3 次，每次 5min；2）1mol/LFLUTAX2（Molecular Probes）染色 10min，0.01mol/LPBS 漂洗 5min；3）以防猝滅劑封片，Olym-pus IX71 熒光顯微鏡觀(guān)察、拍照。免疫熒光采用本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的方法14：1）分別將靜置和切應(yīng)力加載培養(yǎng)的 hUVECs 以 4%的多聚甲醛中固定 30min，0.01mol/LPBS 清洗

12、3 次，每次5min ； 2 ） 以 0.2%TritonX-100 覆 蓋 于 細(xì) 胞 上 ， 室 溫 下 處 理 2min ；0.01mol/LPBS 清洗 3 次，每次 5min；3）以 PBS-3%BSA 清洗 3 次，每次5min；4）以 20L1：1000 稀釋的抗 y-微管蛋白抗體一抗覆蓋于細(xì)胞上，4下孵育過(guò)夜，以 PBS-3%BSA 清洗 3 次，每次 5min；5）以 20L1：100 稀釋的FITC 標(biāo)記的二抗覆蓋于細(xì)胞上，室溫下孵育 45min，以 PBS-3%BSA 清洗 3次，每次 5min；6）以防粹滅劑封片，OlympusIX71 突光顯微鏡觀(guān)察、拍照。細(xì)胞周期檢

13、測(cè)方法參照試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，CellCycle Detection Kit）說(shuō)明進(jìn)行，步驟如下：1）細(xì)胞以 PBS 洗去培養(yǎng)基，加入無(wú) EDTA 胰蛋白酶消化，離心收集；2）PBS 清洗 3 次；3）制備的單細(xì)胞懸液https:/用體積分?jǐn)?shù)為 70%乙醇固定，4保存，染色前用 PBS 洗去固定液；4）加100LRNaseA37水浴 30min，再加入 400LPI 染色混勻，4避光 30min；5）以正常細(xì)胞作對(duì)照，在 30min 內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢。2 結(jié)果2.1 梯度切應(yīng)力加載 24 后 hUVECs 微管類(lèi)細(xì)胞骨架及細(xì)胞形態(tài)變化FLUTAX 為紫杉醇的熒光衍生物，其相

14、對(duì)分子質(zhì)量小，易透過(guò)細(xì)胞膜并特異性結(jié)合于-微管蛋白二聚體，能夠清晰地顯示微管類(lèi)細(xì)胞骨架在細(xì)胞中的分布和走向，進(jìn)一步通過(guò)熒光的細(xì)胞定位和強(qiáng)度對(duì)細(xì)胞形態(tài)、微管的聚集和走向進(jìn)行定 性 和 定 量 分 析 ： 本 研 究 分 別 對(duì) hUVECs 進(jìn) 行 了 梯 度 切 應(yīng) 力 （ 0-14dynes/cm2）加載作用，并以 FLUTAX 法對(duì)微管類(lèi)細(xì)胞骨架進(jìn)行了染色和觀(guān)察（圖 2）。結(jié)果顯示，靜置培養(yǎng)（0dynes/cm2）時(shí)，hU-VECs 的細(xì)胞形態(tài)主要呈梭形或三角形，胞質(zhì)微管以細(xì)胞核為中心向多個(gè)方向延仲，細(xì)胞長(zhǎng)寬比較大，排列無(wú)明顯的方向性（圖 2A），且細(xì)胞核內(nèi)部熒光染色較淺（圖 2 白色箭頭

15、所示）；通過(guò)熒光強(qiáng)度可見(jiàn)微管在胞質(zhì)中的分布均勻，除個(gè)別處于形態(tài)發(fā)生時(shí)期的細(xì)胞外，未見(jiàn)明顯的微管裝配現(xiàn)象發(fā)生。隨著切應(yīng)力的增大，細(xì)胞由梭形逐漸變圓，細(xì)胞長(zhǎng)寬比逐漸降低，胞質(zhì)微管逐漸聚集到細(xì)胞核周?chē)?，熒光在?xì)胞核周?chē)黠@增強(qiáng)，大部分細(xì)胞可觀(guān)察到微管在此集結(jié)和裝配（圖 2B-H），其中，以 14dynes/cm2 加載 24h 最為明顯。當(dāng) 14dynes/cnr 加載 48h 后，在部分區(qū)域可觀(guān)察到微管骨架向切應(yīng)力方向延伸使整個(gè)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭型；絕大多數(shù)細(xì)胞熒光染色較淺，微管裝配停止（圖 3B）。2.2 層流切應(yīng)力加載 1228h 后 hUVECs 初級(jí)纖毛發(fā)生為探索 hUVECs 的纖毛發(fā)生和定位情

16、況，本實(shí)驗(yàn)以抗微管蛋白抗體標(biāo)記纖毛 基 體 ， 并 以 DAPI 標(biāo) 記 細(xì) 胞 核 ； 分 別 觀(guān) 察 加 載 同 一 層 流 切 應(yīng) 力（15dynes/cnr）0、12、28h，以及在 28h 之后改變切應(yīng)力大小為 1dynes/cm2繼續(xù)加載 18h.-微管蛋白在細(xì)胞表面的定位情況定位于細(xì)胞核周?chē)募t色亮點(diǎn)為纖毛基體所在（圖 4 箭頭所示）結(jié)果表明，在靜置培養(yǎng)的細(xì)胞表面存在初級(jí)纖毛的定位，但纖毛多定位于細(xì)胞中央（圖 4A、A）；隨著切應(yīng)力加載時(shí)間的逐漸增大，在細(xì)胞核周?chē)捎^(guān)察到微管在某一區(qū)域逐漸集結(jié)和裝配，纖毛基體定位逐漸偏離細(xì)胞中央，與細(xì)胞質(zhì)延伸方向一致（圖 4B）當(dāng)以層流切應(yīng)力加載

17、 28h 時(shí)，大多數(shù)細(xì)胞觀(guān)察不到纖毛基體在細(xì)胞表面的定位，組成纖毛的微管發(fā)生了解聚（圖 4C、C）；但當(dāng)細(xì)胞再加載 1dynes/cm2 切應(yīng)力 18h 后，又可觀(guān)察到纖毛基體在細(xì)胞表面的重新定位，且位于細(xì)胞質(zhì)延伸區(qū)（圖 4D、D），表明在較低切應(yīng)力加載下細(xì)胞又發(fā)生了微管的重新裝配并形成了新的纖毛。另外，為檢測(cè) FSS 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及周期的影響，通過(guò)細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒對(duì)細(xì)胞層流切應(yīng)力加載 28h 后再加載 1dynes/cm2 切應(yīng)力 18h 的細(xì)胞進(jìn)行了 PI 染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。結(jié)果表明，與對(duì)照組相似，大部分細(xì)胞處于 G0、G1 期且未見(jiàn) S 期及凋亡細(xì)胞，但處于 G2、M 期的細(xì)胞較對(duì)照

18、少，幾乎看不到，細(xì)胞生長(zhǎng)處于平臺(tái)期（圖 5），源于加載切應(yīng)力的近 48h 期間細(xì)胞基本長(zhǎng)滿(mǎn)載玻片使分裂期細(xì)胞相對(duì)較少。由此可見(jiàn)，在長(zhǎng)時(shí)間加載切應(yīng)力期間，細(xì)胞的生長(zhǎng)和https:/周期并未受到影響。 3 討論3.1 切應(yīng)力可誘導(dǎo) hUVECs 微管類(lèi)細(xì)胞骨架發(fā)生重新裝配并導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)變化hUVECs 在靜置培養(yǎng)條件下，細(xì)胞融合后呈鵝卵石狀，細(xì)胞形態(tài)為梭型或多角形，細(xì)胞的長(zhǎng)寬較為分明15。早在 20 世紀(jì) 90 年代，就有報(bào)道顯示血流動(dòng)力學(xué)能夠使細(xì)胞形態(tài)由鵝卵石狀轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)梭型14，這一變化主要來(lái)源于細(xì)胞骨架重構(gòu)16，最新的研究也顯示，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞加載適當(dāng)?shù)那袘?yīng)力可導(dǎo)致細(xì)胞逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭型，其長(zhǎng)軸與血流

19、切應(yīng)力方向一致，且切應(yīng)力越大所需要的加載時(shí)間相應(yīng)越短17。而本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，內(nèi)皮細(xì)胞骨架的改變并非直接變?yōu)殚L(zhǎng)梭型，而是隨著切應(yīng)力的增大，經(jīng)過(guò)了一個(gè)過(guò)渡狀態(tài)即圓形，再逐漸向切應(yīng)力方向伸展，且細(xì)胞骨架可觀(guān)察到明顯的裝配階段：因此推測(cè)，在切應(yīng)力誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)變化過(guò)程中，細(xì)胞骨架首先發(fā)生了解聚，再進(jìn)一步向切應(yīng)力方向重新裝配成長(zhǎng)梭型。同時(shí)，我們也注意到按照“鋪路石”樣排列緊密的細(xì)胞在切應(yīng)力作用下更容易形成鈍圓的形態(tài)，而非長(zhǎng)梭型，由此推測(cè)，細(xì)胞之間沒(méi)有間隙的狀態(tài)下，細(xì)胞形態(tài)的改變受到了彼此的約束，切應(yīng)力的誘導(dǎo)作用更傾向于導(dǎo)致細(xì)胞骨架的解聚.并向細(xì)胞核周?chē)蹟n.而要使細(xì)胞骨架按照相應(yīng)的作用力方向重新排列

20、需要電大的切應(yīng)力作用更多的時(shí)間，而這樣的切應(yīng)力大小是體內(nèi)靜脈血流所不能達(dá)到的，因此，在活體靜脈管壁中的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)不易形成按照血流方向的梭型排列方式。綜上所述，切應(yīng)力作用是可以誘導(dǎo) hUVECs 發(fā)生形態(tài)變化的，這一變化的發(fā)生經(jīng)歷了微管類(lèi)細(xì)胞骨架的解聚、向細(xì)胞核方向聚集以及重新裝配等過(guò)程。3.2 切應(yīng)力可影響 hUVECs 初級(jí)纖毛在細(xì)胞表面的定位和發(fā)生纖毛的形成過(guò)程被稱(chēng)為纖毛發(fā)生，涉及纖毛基體的定位和纖毛軸絲裝配。通常情況下，纖毛發(fā)生受到細(xì)胞周期的調(diào)控18。然而近年來(lái)的研究顯示藥理學(xué)作用或外界環(huán)境的變化均能夠影響纖毛的發(fā)生或長(zhǎng)度，這種現(xiàn)象不依賴(lài)于細(xì)胞周期，屬于自我裝配過(guò)程。更有直接證據(jù)顯示來(lái)

21、自于細(xì)胞基質(zhì)的機(jī)械信號(hào)能夠快速調(diào)節(jié)腱細(xì)胞纖毛長(zhǎng)度19。在心血管系統(tǒng)中，初級(jí)纖毛在動(dòng)脈及胚胎心臟內(nèi)表面的分布也與血流模式相關(guān)20，但血流模式是否能夠調(diào)節(jié)初級(jí)纖毛的發(fā)生及長(zhǎng)度變化還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)表明 hUVECs 初級(jí)纖毛在 15dynes/cm2 切應(yīng)力作用 28h 以上將發(fā)生解聚，該切應(yīng)力大小接近于體內(nèi)正常血流產(chǎn)生的層流切應(yīng)力，因此初級(jí)纖毛較少出現(xiàn)于正常血流區(qū)域血管內(nèi)皮細(xì)胞表面；此外，當(dāng)再次以低切應(yīng)力（1dynes/cm2）誘導(dǎo)細(xì)胞 18h 后，可觀(guān)察到纖毛裝配的發(fā)生，而該過(guò)程與細(xì)胞周期無(wú)關(guān)。因此，本研究進(jìn)一步證實(shí)了外界機(jī)械作用力能夠影響初級(jí)纖毛的形態(tài)發(fā)生過(guò)程，該現(xiàn)象可能導(dǎo)致了初級(jí)纖毛在心血

22、管系統(tǒng)中的分布不均。3.3 外界環(huán)境對(duì)纖毛發(fā)生的影響為纖毛疾病的治療提供新思路初級(jí)纖毛作為機(jī)械和化學(xué)信號(hào)傳感器，廣泛存在于上皮、軟骨、成纖維以及神經(jīng)元等多種細(xì)胞表面，大量的研究表明初級(jí)纖毛能夠通過(guò)調(diào)節(jié)多條信號(hào)通https:/路（如 Hh、Wm 等）參與細(xì)胞的增殖、遷移、分化及動(dòng)態(tài)平衡等過(guò)程18。纖毛 結(jié) 構(gòu) 和 功 能 異 常 將 導(dǎo) 致 一 系 列 疾 病 的 發(fā) 生 ， 包 括 多 囊 腎 ?。╬olycystickidneydisease，PKD）、腎結(jié)核、Bardet-Biedl 綜合征等21。此外，由于新纖毛基體的定位方向決定了細(xì)胞乃至胚胎發(fā)育的極性方向22，初級(jí)纖毛的缺失將導(dǎo)致細(xì)胞

23、乃至胚胎極性分化的隨機(jī)性23。因此，纖毛結(jié)構(gòu)的完整性及正常的纖毛發(fā)生對(duì)維持機(jī)體正常功能和發(fā)育具有不可忽視作用，而本研究的結(jié)果證實(shí)了一定的外界機(jī)械作用力可影響初級(jí)纖毛的形態(tài)發(fā)生，進(jìn)一步探索該現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)制將為纖毛相關(guān)疾病的治療提供新的思路參考文獻(xiàn)（References）：1HOVE J R. KOSTE R W，F(xiàn)OROUHAR A S，et al.Intracardiac fluidforcesareanessentialepigeneticfactorforembryoniccardiogenesisJ.Nature，2003，421（2）：172-177.2姜宗來(lái).心血管生物力學(xué)研究的新進(jìn)

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