PTEN基因誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤SHG┐44細(xì)胞凋亡及bcl┐2表達(dá)下調(diào)

1、PTE睚因誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤 SH3 44細(xì)胞凋亡及bcl I 2表達(dá)下調(diào)付洛安章翔李俠費(fèi)舟郭衍高大寬【關(guān)鍵詞】神經(jīng)膠質(zhì)瘤關(guān)鍵詞：神經(jīng)膠質(zhì)瘤；基因；脫噬作用;bcl-2摘要：目的 探討PTE漉因?qū)θ四X膠質(zhì)瘤SHG-44田胞凋亡及凋 亡相關(guān)基因bcl-2表達(dá)的阻礙,說(shuō)明PTE漉因抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī) 制.方式PTEN基因體外轉(zhuǎn)染SHG-44田胞,挑選陽(yáng)性細(xì)胞克隆,以原 位雜交、免疫組化方式檢測(cè) PTEN®因的表達(dá)情形；采納透射電鏡、流 式細(xì)胞儀和核DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情形；以防止疫熒 光法檢測(cè)bcl-2基因的表達(dá).結(jié)果PTEN基因轉(zhuǎn)染的SHG-44細(xì)胞有 PTENg白的表達(dá).

2、透射電鏡下可見(jiàn)轉(zhuǎn)染PTENS因后細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮 邊集、胞質(zhì)濃縮、核碎裂及凋亡小體形成等典型的凋亡表現(xiàn)；流式細(xì)胞 儀顯示細(xì)胞周期從G1期到S期發(fā)生抑制,而且在G1期峰前顯現(xiàn)一明 顯的凋亡峰衿；細(xì)胞核DN堿脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)凋亡細(xì)胞特有的梯 狀條帶；bcl-2的表達(dá)也顯著下調(diào).結(jié)論P(yáng)TENM因可誘導(dǎo)SHG-44I田胞 凋亡,并下調(diào)bcl-2蛋白的表達(dá),這可能是PTENS因抑制腫瘤細(xì)胞增 殖的分子機(jī)制之一.Keywords:glioma；genes；apoptosis；genes , bcl-2Abstract:AIM To investigate the effects of exotic PTE

3、N on the apoptosis and expression of bcl-2gene in human brain glioma SHG-44cells and to probe into the mechanism thatPTENgene inhibits the proliferation of the tumor Human glioma SHG-44cells were transfected with a plasmid vector containing PTENgene in vitro , and then positive cell clones were sele

4、cted and ex-pression of PTEN gene was examined by in situ hybridization and immunohistochemistry detect the apopto-sis , examinations of transfected cells were performed by transmission electronic microscope , flow cytometry and nu-cleus DNA agarose gel expression of bcl-2was also detected by immuno

5、fluorescent i SULTSSHG-44cells stably transfected with PTENgene were obtained by selection , and expression of PTENgene was able to be body and changes of ul-trastructure , including the concentration , side-accumulation of the nuclear chromatin and the fragmentation of the nucle-ar were detected by

6、 transmission electron cycle detected by flow cytometry showed that the percentage of cells increased in G1and decreased in S visible apoptosis peak (% prior to the peak of G1also was found by characteristic DNA ladder was found in the agarose gel electrophoresis of the nucleus DNAof trans-fected ex

7、pression of bcl-2gene was down-regulat-ed in PTEN gene SHG-44cells caninduce apoptosis and down-regulation of expression of bcl-2gene in SHG-44cells , which maybe one of the rea-sons that PTENgene inhibits the proliferation of human tu-mor cells.0引言PTEN®因是1997年覺(jué)察的定位于人體第10q23染色體上的 腫瘤抑制基因,人類多種腫瘤組

8、織中伴有該基因的缺失1.許多學(xué)者已研究了人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本和細(xì)胞系中PTEN8因的變異,其中Duerr等2以SSC而直接測(cè)序法研究了 331例膠質(zhì)瘤中PTEN勺表達(dá), 覺(jué)察10q23染色體上PTEN8因位點(diǎn)雜合性缺失LOH發(fā)生頻率較高, 提示該基因的突變或缺失可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進(jìn)展緊密相關(guān).咱們將外源性人PTEN8因?qū)朐摶蛉笔У腟HG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中,以 揭露外源性PTENS因?qū)θ四X膠質(zhì)瘤細(xì)胞系凋亡和凋亡相關(guān)基因bcl-2表達(dá)的阻礙,探討PTEN®因抑制腫瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制.1材料和方式材料SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞系蘇州醫(yī)學(xué)院；RPMI1640培育 基、胰蛋白酶Hyclone;

9、脂質(zhì)體lipo-fectamine Gibco;喋吟霉素Clontech ;pBP-PTEN及 pBP質(zhì)粒美國(guó) Furnari 博士惠贈(zèng)；各類限制性內(nèi)切酶Clontech ;鼠抗人PTEh#抗,鼠抗人bcl-2單抗(Santa Cruz) ;FITC 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG (Jackson), 6wk齡 BALB/c裸鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中央).方式%菌株,挑選氨節(jié)抗性的克隆,擴(kuò)贈(zèng)培育,堿裂解法提取純化質(zhì) 粒DNA脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pBP-PTE腳口 pBP載體別離轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 SHG-44田胞.挑選培育基中喋吟霉素濃度為 2mg L-1,維持挑選30d,挑選陽(yáng)性細(xì)胞克隆,擴(kuò)增培育.別離將

10、成功 轉(zhuǎn)染 pBP-PTENF口 pBP載體的 SHG-44細(xì)胞命名為 SHG44-pBP-PTENl SHG44-pBP 田胞.PTENM因表達(dá)的檢測(cè)pBP-PTENg EcoRI和Cla I雙酶切以 后,回收1212bp的人全長(zhǎng)PTENS因片斷,隨機(jī)引物法標(biāo)記雜交探針, 利用原位雜交方式另U離檢測(cè) SHG44-pBP-PTENSHG44-pB環(huán)口 SHG44田 胞.同時(shí)用免疫組化方式檢測(cè)PTENS白在上述3種細(xì)胞中是不是表達(dá). 一抗為鼠抗人PTENII克隆抗體,1 1000稀釋,具體操作見(jiàn)博士德公 司SABC式劑盒說(shuō)明書.以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照.細(xì)胞周期、超微結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)速度及核

11、 DNA電泳檢測(cè)3種細(xì) 胞別離經(jīng)L-1胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液后,進(jìn)行以下檢測(cè)：各取 約1X106個(gè)細(xì)胞,PBS洗滌2遍,預(yù)冷的750mL L-1乙醇固定,PI染色,流式細(xì)胞儀行細(xì)胞周期檢測(cè).各取約1X106個(gè)細(xì)胞,1000r min-1離心5min,細(xì)胞沉淀以20g L-1戊二醛固定,常規(guī)包埋,切片, 雙鉛染色后透射電鏡檢測(cè).別離接種于6孔板,每種細(xì)胞接種7孔, 每孔約1X104個(gè)細(xì)胞,每日取1孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲 線.各取約1X106個(gè)細(xì)胞,PBSa滌2遍后,采納氯仿-酚抽提法提 取細(xì)胞核DNA取15區(qū)L核DNAk樣,行15g L-1瓊脂糖凝膠電泳細(xì) 胞核DNA分析,EB染色后紫

12、外燈下觀看.bcl-2蛋白表達(dá)的檢測(cè)3種細(xì)胞各約1X106個(gè),40g L-1多聚甲醛固定,含1mL L-1 Triton X-100的PB夠 4c下作用5min,參加1 80稀釋的鼠抗人bcl-2單抗, 室溫孵育,再參加1 100稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG,利用流式細(xì) 胞術(shù)檢測(cè)bcl-2特異性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度MIF,以判定bcl-2表 達(dá)情形.SHG44細(xì)胞作為對(duì)照,計(jì)算 SHG44-pBP-PTE和SHG44-pBPffl 胞MIF與對(duì)照細(xì)胞 MIF的比值.陰性對(duì)照為SHG44細(xì)胞不加鼠抗人 bcl-2單抗,代之以小鼠IgG.統(tǒng)計(jì)學(xué)處置：數(shù)據(jù)以SPS費(fèi)計(jì)軟件包進(jìn)行x 2查驗(yàn). 2結(jié)果

13、PTEN基因轉(zhuǎn)染SHG 44細(xì)胞成功將pBP-PTE腳口 pBP載體 轉(zhuǎn)染入SHG44腫瘤細(xì)胞,取得陽(yáng)性轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆,相差顯微鏡下 SHG44-pBP-PTENSHG44-pBPW SHG44E種細(xì)胞之間,形態(tài)無(wú)明顯不PTEN表達(dá)的檢測(cè)原位雜交顯示僅SHG44-pBP-PTENE胞有 PTEN基因 mRNA勺表達(dá)FiglA, 1B.免疫組化顯示：SHG44-pBP和 SHG-4壟田胞中PTENS白陰性,而SHG44-pBP-PTEN胞中該蛋白表達(dá) 陽(yáng)性,可見(jiàn)胞質(zhì)中大量的棕黃色顆粒FigIC, 1D.表1流式細(xì)胞儀顯示細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變略PTEN基因?qū)HG 44細(xì)胞周期、超微結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)速度及核 D

14、NA電泳的阻礙 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期顯示 SHG44-pBP-PTEN3 胞的G1期細(xì)胞數(shù)量增加,S期細(xì)胞減少,從G1期到S期發(fā)生抑制, G1峰左側(cè)顯現(xiàn)凋亡峰A?,所占比例為.SHG-4琳口 SHG44-pBP田胞 周期正常Tab1.3種細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可見(jiàn)SHG44-pBP-PTEN3胞的 生長(zhǎng)曲線平緩,生長(zhǎng)速度較另兩種細(xì)胞明顯降低Fig2.透射電鏡 下,可見(jiàn)SHG44-pBP-PTEN胞核染色質(zhì)濃縮、邊集,呈境遇清楚的塊 狀或半月?tīng)?亦有細(xì)胞核碎裂,胞質(zhì)濃縮；胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較完整,并檢 測(cè)到明顯的凋亡小體,為典型的腫瘤細(xì)胞凋亡表現(xiàn),SHG-44和 SHG44-pBP田胞超微結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異樣Fig3

15、.細(xì)胞核DNAt泳分析可 見(jiàn)SHG44-pBP-PTEN3胞核DNAS解為180200bp及其整倍數(shù)的寡核 甘酸片段,形成典型的階梯狀電泳圖譜 DNA ladder .SHG-44及 SHG44-pBP田胞核DNAX在加樣孔周圍顯現(xiàn)基因組條帶,無(wú)DNAadder 形成Fig4.圖1 圖3略bcl 2表達(dá)水平轉(zhuǎn)變流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯 示:SHG44-pBP-PTEM田胞的 MIF為對(duì)照細(xì)胞 MIF的 (P<);而 SHG44-pBP田胞的MIF為對(duì)照細(xì)胞乂尸的結(jié)果說(shuō)明PTEN®因轉(zhuǎn)染可 明顯抑制細(xì)胞bcl-2蛋白的表達(dá).圖4略3討論研究說(shuō)明PTEN®因位于人類第

16、10q23染色體上,具有9個(gè)外 顯子,其序列內(nèi)含有由1212個(gè)核甘酸組成的開(kāi)放閱讀框,編碼 403 個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)3 .Chiariello 等4檢測(cè)了 41例原發(fā) 性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中PTE虛因的表達(dá),結(jié)果顯示59%勺標(biāo)本中存在10q23 染色體上PTEhB點(diǎn)的雜合性缺失.也有學(xué)者比擬了不同病理品級(jí)膠質(zhì) 瘤中PTEN勺表達(dá)量,證實(shí)低分化膠質(zhì)瘤中 PTEN勺突變率明顯高于高 分化腫瘤,提示PTEN勺突變與膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展緊密相關(guān).目前有關(guān)PTEN®因抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不明晰,但有 研究以為PTENI能是一種凋亡誘導(dǎo)基因.本實(shí)驗(yàn)將PTE盅因體外轉(zhuǎn)染 SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞系,挑

17、選陽(yáng)性轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆后作相關(guān)檢測(cè), 結(jié)果 證實(shí)轉(zhuǎn)染PTEN®因的SHG44交質(zhì)瘤細(xì)胞周期明顯改變,細(xì)胞從G1期到S期發(fā)生抑制,而且在G1期前顯現(xiàn)了明顯的凋亡峰.細(xì)胞透射電鏡 顯示染色質(zhì)濃縮并邊集于核膜,形成境遇清楚的顆粒塊狀或新月形小 體,細(xì)胞質(zhì)也濃縮,有的胞核裂解成質(zhì)膜包繞的碎片,并脫落形成凋 亡小體,為明顯的凋亡表現(xiàn).氯仿-酚抽提法提取細(xì)胞核DNA亍L-1瓊 脂糖凝膠電泳,于PTEN®因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞泳道上覺(jué)察了典型的“梯狀 條帶,這是由于細(xì)胞凋亡時(shí)核小體間連接部雙股螺旋斷裂形成多個(gè) 180200bp及其整數(shù)倍大小的寡核甘酸碎片,因此會(huì)在含澳化乙錠的 瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)典

18、型的“梯狀條帶,目前以為這是細(xì)胞凋亡 的特點(diǎn)性轉(zhuǎn)變之一.以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)PTENS因可誘導(dǎo)SHG-4以腦 膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡.誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制較為復(fù)雜,其中下調(diào)凋 亡抑制基因的表達(dá)是一種重要的分子機(jī)制 .bcl-2 蛋白是一種膜結(jié)合 蛋白,存在于細(xì)胞的線粒體、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上,具抑制凋亡的作用 目前已取得公認(rèn)6.有學(xué)者證實(shí)bcl-2能拮抗bax等介導(dǎo)的腫瘤細(xì) 胞凋亡7.本研究在證實(shí)PTENS因可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時(shí), 檢測(cè)到bcl-2蛋白的表達(dá)下調(diào),提示PTENS因誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡可 能是通過(guò)下調(diào)bcl-2的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的.綜上所述,PTENS因是與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生和進(jìn)展緊密相關(guān)的一 種

19、抑癌基因,將其導(dǎo)入到該基因缺失的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中, 可下調(diào)bcl-2 蛋白的表達(dá),并進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡,這將為膠質(zhì)瘤的基因醫(yī) 治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù).參考文獻(xiàn):1 Li DM Sun , encoded by a candidate tumor suppressor locus , is a novel protein tyrosine phosphatase regulated by transforming growth factor beta J .Cancer Res, 1997;57 (11) :2124-2129.2 Duerr EM, Rollbrocker B , Hayashi Y, Tumber K, Mori mutations in gliomas and glioneuronal tumorsJ .Onco-gene ,1998;16 (17) :2259-2264.3 Jing JJ, Zhang X, WuJVV Liu XZ, CaoWD Fan QT Duan between PTEN and CB expression and inva-sion of astrocytomaJ .Di-si Junyi DaxueXueb