第9章酶促反應(yīng)動力學(xué)

1、l濃度對酶反應(yīng)速率的影響l抑制劑對酶反應(yīng)速率的影響l溫度對酶反應(yīng)速率的影響lpH對酶反應(yīng)速率的影響l激活劑對酶反應(yīng)速率的影響酶促反應(yīng)動力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的速率以及影響此速率的各種因素的科學(xué)?；瘜W(xué)動力學(xué)化學(xué)動力學(xué)的研究內(nèi)容具體為確定反應(yīng)速率，了解濃度、溫度、pH值、催化劑等因素對反應(yīng)速率的影響，揭示化學(xué)反應(yīng)機(jī)制。反應(yīng)速率：單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)物或者生成物濃度的改變。v=()dc/dt一、化學(xué)動力學(xué)基礎(chǔ)一、化學(xué)動力學(xué)基礎(chǔ)化學(xué)反應(yīng)化學(xué)反應(yīng)的方向、可能性和限度化學(xué)反應(yīng)的速率和機(jī)制化學(xué)熱力學(xué)(結(jié)果)化學(xué)動力學(xué)（過程）反應(yīng)速率：單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)物或者生成物濃度的改變。1. 反應(yīng)速率及測定v=(c2-c1)/(t2

2、-t1)= -dc/dt監(jiān)測反應(yīng)物的濃度變化：監(jiān)測生成物的濃度變化：v=(c2-c1)/(t2-t1)= dc/dt反應(yīng)分子數(shù)反應(yīng)級數(shù)整個(gè)化學(xué)反應(yīng)的速率服從哪種分子反應(yīng)速率單分子反應(yīng) A P例如：放射性元素的蛻變、分子重排、同分異構(gòu)體互變等。v=-dc/dt=kc雙分子反應(yīng) A+B P+Q例如：2H2+O2 2H2O; v=-dc/dt=kc1c2一級反應(yīng) v=-dc/dt=kc二級反應(yīng) v=-dc/dt=kc1c2零級反應(yīng) v=-dc/dt=k例如酶促反應(yīng)的最大速度2. 反應(yīng)分子數(shù)及反應(yīng)級數(shù)反應(yīng)中真正相互作用的分子數(shù)目總反應(yīng)速率與濃度的關(guān)系能以單分子反應(yīng)的速率方程式表示。注意：水解反應(yīng)（雙分

3、子、一級反應(yīng)）以雙分子反應(yīng)的速率方程式表示；反應(yīng)速率與反應(yīng)物質(zhì)濃度二次方成正比反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度的關(guān)系分類3. 各級反應(yīng)的特征：1. 一級反應(yīng)：t1/2 0.693/k不論反應(yīng)物初濃度的多少，其半衰期是一樣的2. 二級反應(yīng)t1/2=1/ka初濃度越大，反應(yīng)物減少一半所需時(shí)間越短3. 零級反應(yīng)t1/2=a/2k初濃度越大，半衰期越長v=-dc/dt=kcv=-dc/dt=kc1c2v=-dc/dt=k概念 酶促反應(yīng)動力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的速率以及影響此速率的各種因素的科學(xué)，是酶工程研究中的一個(gè)重要內(nèi)容。影響因素包括有 酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑、激活劑等。 研究一種因素的影響時(shí)，其余各

4、因素均認(rèn)為恒定。二、酶促反應(yīng)動力學(xué)二、酶促反應(yīng)動力學(xué)02468101214161820020406080100C oncentration of S ubstrate(um ol/L)Rate of Reaction(v)SvHenri的蔗糖水解實(shí)驗(yàn)保持酶濃度不變1903 年Henri用蔗糖酶水解蔗糖研究底物濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系，當(dāng)保持酶濃度不變時(shí)，得到雙曲線圖，并提出酶底物中間絡(luò)合學(xué)說。2.1 底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響2.1.1 中間絡(luò)合物學(xué)說l酶與底物先絡(luò)合成一個(gè)過渡態(tài)絡(luò)合物，然后絡(luò)合物進(jìn)一步分解為產(chǎn)物和游離態(tài)酶。這個(gè)學(xué)說的前提是酶與底物反應(yīng)的“快速平衡”，即在反應(yīng)的開始階段，兩者反應(yīng)速

5、度很快，迅速建立平衡關(guān)系。 l 第一步：酶（E）與底物（S）作用，形成酶-底物中間產(chǎn)物 （ES）：E+SES (k1和k2是正、逆反應(yīng)的速度常數(shù)) 第二步：中間產(chǎn)物分解，形成產(chǎn)物（P），釋放出游離酶(E)： ESP+El 許多實(shí)驗(yàn)事實(shí)證明了ES復(fù)合物的存在，ES復(fù)合物形成的速率與酶和底物的性質(zhì)有關(guān)。E+SESE+PK1K2K3酶和底物中間復(fù)合體的證據(jù)：ES復(fù)合物已經(jīng)被電子顯微鏡和X射線晶體結(jié)構(gòu)分析直接觀察到；酶和底物形成ES復(fù)合物后光譜特性發(fā)生改變；形成ES復(fù)合物后，酶的物理性質(zhì)，例如溶解度或熱穩(wěn)定性發(fā)生改變；某些酶和底物相互作用的ES復(fù)合物已經(jīng)得到分離；酶和底物可形成共沉淀。在底物濃度低時(shí),

6、 酶未被飽和，反應(yīng)速度V 取決于底物濃度，與底物濃度S成正比，表現(xiàn)為一級反應(yīng)特征。02468101214161820020406080100C oncentration of S ubstrate(um ol/L)Rate of Reaction(v)2.1.2 酶被底物飽和現(xiàn)象和“中間絡(luò)合物”假說 E + S ES E + P一級反應(yīng)SvEHenri的蔗糖水解實(shí)驗(yàn)保持酶濃度不變隨著底物濃度的增高, ES生成量多，反應(yīng)速率取決于ES濃度，而反應(yīng)速度不再成正比例加速；反應(yīng)為混合級反應(yīng)。02468101214161820020406080100C oncentration of S ubstrat

7、e(um ol/L)Rate of Reaction(v)v混合級ES E + S ES E + P02468101214161820020406080100C oncentration of S ubstrate(um ol/L)Rate of Reaction(v)Vmaxv零級反應(yīng)E當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到相當(dāng)高時(shí)，底物濃度對反應(yīng)速率影響變小，最后反應(yīng)速率與底物濃度無關(guān)，反應(yīng)達(dá)到最大速率 Vmax。只有酶的催化反應(yīng)具有這樣的飽和現(xiàn)象。 E + S ES E + P2.2 2.2 酶促反應(yīng)動力學(xué)酶促反應(yīng)動力學(xué) （1 1）米氏方程）米氏方程 1913年，德國化學(xué)家Michaelis和Menten根據(jù)中

8、間絡(luò)合物學(xué)說對酶促反應(yīng)的動力學(xué)進(jìn)行研究，推導(dǎo)出了表示整個(gè)反應(yīng)中底物濃度和反應(yīng)速度關(guān)系的著名公式，稱為米氏方程。V=Vmax SKm + SKm 米氏常數(shù)Vmax 最大反應(yīng)速度米氏方程米氏方程Michaelis和Menten根據(jù)中間復(fù)合物學(xué)說提出：E+SESE+Pl Briggs 和 Haldance對其進(jìn)行修正，提出了穩(wěn)態(tài)理論：E+SESE+P所謂穩(wěn)態(tài)是指反應(yīng)進(jìn)行一段時(shí)間以后，系統(tǒng)復(fù)合物ES的濃度由零增加到一定數(shù)值，在一定時(shí)間內(nèi)，盡管底物濃度和產(chǎn)物濃度在不斷變化，ES也在不斷生成和分解，但是當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中ES的生成速度和分解速度相等時(shí)候，ES濃度保持不變的反應(yīng)狀態(tài)成為穩(wěn)態(tài)，即 dES/dt=0簡

9、單起見，只考慮單底物和單產(chǎn)物的催化反應(yīng)。簡單起見，只考慮單底物和單產(chǎn)物的催化反應(yīng)。在反應(yīng)初期，在反應(yīng)初期，PP的濃度非常低，因此整個(gè)反應(yīng)可簡化為的濃度非常低，因此整個(gè)反應(yīng)可簡化為（2）米氏方程的推導(dǎo)(Michaelis-Menten) 根據(jù)中間絡(luò)合物學(xué)說，酶促反應(yīng)分兩步進(jìn)行:E+ SESE + PK1k2k3k4E+ SESK1k2ESE + Pk3k4E+ SESE + PK1k2k3l在整個(gè)酶促反應(yīng)中，反應(yīng)的限速步驟為在整個(gè)酶促反應(yīng)中，反應(yīng)的限速步驟為ESES分解生成分解生成EE和和PP的過程，因此反應(yīng)的初速度可以表示為的過程，因此反應(yīng)的初速度可以表示為l在反應(yīng)過程中，游離的酶濃度可以表示

10、為在反應(yīng)過程中，游離的酶濃度可以表示為l在反應(yīng)過程中，底物濃度在反應(yīng)過程中，底物濃度SS是遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酶濃度的是遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酶濃度的Et Et ，即，即SEt, SEt, 所以游離的底物濃度可以用所以游離的底物濃度可以用SS計(jì)算。計(jì)算。V = k3ES(EtES) Sk2+k3ES k1V=Vmax SKm + S當(dāng)反應(yīng)速度等于最大速度一半時(shí)當(dāng)反應(yīng)速度等于最大速度一半時(shí), ,即即V = 1/2 Vmax, Km = S V = 1/2 Vmax, Km = S 上式表示上式表示, ,米氏常數(shù)是反應(yīng)速度為米氏常數(shù)是反應(yīng)速度為最大值的一半時(shí)的底物濃度。最大值的一半時(shí)的底物濃度。因此因此, ,米氏常數(shù)的單位

11、為米氏常數(shù)的單位為mol/Lmol/L。米氏方程曲線米氏常數(shù)（米氏常數(shù)（Km）的意義）的意義米氏常數(shù)（米氏常數(shù)（Km）的意義）的意義1、Km值是酶的特征常數(shù)之一，只跟酶的性質(zhì)有關(guān)，而與酶的濃度無值是酶的特征常數(shù)之一，只跟酶的性質(zhì)有關(guān)，而與酶的濃度無關(guān)關(guān); Km值作為常數(shù)只是對一定的底物、一定的值作為常數(shù)只是對一定的底物、一定的pH、一定的溫度條件而、一定的溫度條件而言，言，測定酶的測定酶的Km值可以作為鑒別酶的一種手段值可以作為鑒別酶的一種手段。多數(shù)酶的。多數(shù)酶的Km介于介于10-610-1 mol/L 之間。之間。2、 Km可以判斷酶的專一性和天然底物可以判斷酶的專一性和天然底物幾個(gè)底物就有

12、幾個(gè)幾個(gè)底物就有幾個(gè)Km值；值；Km最小的底物為最小的底物為最適底物最適底物。因此。因此1/Km可近似表示酶對底物的親和性可近似表示酶對底物的親和性V=Vmax SKm + S若已知某個(gè)酶的若已知某個(gè)酶的Km，就可以計(jì)算在某一底物濃度時(shí)，反應(yīng)，就可以計(jì)算在某一底物濃度時(shí)，反應(yīng)速率相當(dāng)于速率相當(dāng)于Vmax的百分比：的百分比：V=Vmax SKm + S例如，當(dāng)S=3Km時(shí)， V=0.75Vmax若若Km已知，任何底物濃度下被底物飽和的酶百分?jǐn)?shù)：已知，任何底物濃度下被底物飽和的酶百分?jǐn)?shù)：f =v/Vmax例如：過氧化氫酶Km值為0.025mol/L, 當(dāng)?shù)孜镞^氧化氫濃度為0.1mol/L 時(shí)，過氧

13、化氫酶被底物飽和的百分?jǐn)?shù)為80%Vmax和和k3（kcat）的意義）的意義當(dāng)S很大時(shí),v=vmax=k3EtK3 表示當(dāng)酶被底物飽和時(shí)每秒鐘每個(gè)酶分子轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)，這個(gè)常數(shù)又叫轉(zhuǎn)換數(shù)，稱為催化常數(shù)（kcat）， kcat越高，表示酶的催化活力越高，所以，Vmax=kcatEES E+Pk3kcat/Km 的意義的意義生理?xiàng)l件下，大多數(shù)酶并不被底物所飽和，體內(nèi) S/Km 介于0.011 之間。v=Vmax SKm+SVmax=kcatEtv=kcatEt SKm+S當(dāng)SKm時(shí)，自由酶濃度=Etv=kcatKmES比較不同酶或者同一種酶催化不同底物的催化效率2.3 作圖法測定作圖法測定Km和和

14、Vmax-4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v斜率斜率=Km/Vmax-1/Km1/Vmax作圖法測定作圖法測定Km和和Vmax雙倒數(shù)作圖法雙倒數(shù)作圖法將米氏方程取雙倒數(shù)：=v=Vmax SKm+S2.4 多底物酶促反應(yīng)動力學(xué) 大多數(shù)酶反應(yīng)包含一種以上的底物： A+BP+Q1) 序列反應(yīng)-有序反應(yīng)機(jī)理-需要NAD+或NADH+的脫氫酶的反應(yīng)屬于這種 B P E+A EA EAB EPQ EQ E+Q 2) 序列反應(yīng)-隨機(jī)機(jī)理： E+AEA B Q EPE+P EABEPQ E+BEB A P EQE+Q3) 乒乓反應(yīng)機(jī)理（轉(zhuǎn)氨酶的反應(yīng)屬于

15、這類型） ： A P B Q E E順次式(sequential)乒乓式(ping-pong)當(dāng)P1, P2 = 0 時(shí)三、酶的抑制作用沒有引起酶的失活，但使酶的活性降低或喪失的現(xiàn)象，稱為酶的抑制作用；能夠引起酶的抑制作用的化合物則稱為抑制劑；抑制劑對酶的抑制作用具有選擇性；酶的抑制劑一般具備兩個(gè)方面的特點(diǎn)：l在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與底物分子狀態(tài)相似l能夠與酶的活性中心以非共價(jià)或共價(jià)的方式形成比較穩(wěn)定的復(fù)合體或結(jié)合物。l根據(jù)酶活性變化可分為可逆與不可逆二類 不可逆抑制作用：抑制劑與酶反應(yīng)中心的活性基團(tuán)以共價(jià)形式結(jié)合，引起酶活的永久性失活。如有機(jī)磷毒劑二異丙基氟磷酸酯。（詳見p373代表性抑制劑） 可逆抑

16、制作用：抑制劑與酶蛋白以非共價(jià)方式結(jié)合，引起酶活性暫時(shí)性喪失。抑制劑可以通過透析等方法被除去，并且能部分或全部恢復(fù)酶的活性。l根椐可逆抑制劑與酶結(jié)合情況可分為競爭性抑制、非競爭性抑制與反競爭性抑制三類。三、酶的抑制作用3.1 競爭性抑制l抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)與底物相似，因而能與底物竟?fàn)幣c酶活性中心結(jié)合。當(dāng)抑制劑與活性中心結(jié)合后，底物被排斥在反應(yīng)中心之外，其結(jié)果是酶促反應(yīng)被抑制了。l竟?fàn)幮砸种仆ǔ？梢酝ㄟ^增大底物濃度，提高底物濃度可以降低抑制作用。Vmax不變，不變，Km變大，雙倒數(shù)作圖與正常直線相交于縱軸變大，雙倒數(shù)作圖與正常直線相交于縱軸=競爭性米氏方程米氏方程=1+I/Ki3.2 非競爭性抑制

17、底物和抑制劑結(jié)構(gòu)上沒有共同之處，但酶可同時(shí)與底物及抑制劑結(jié)合形成三元復(fù)合物，但復(fù)合物不能進(jìn)一步分解為產(chǎn)物。由于這類物質(zhì)并不是與底物競爭與活性中心的結(jié)合，所以稱為非競爭性抑制劑。如某些金屬離子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能與酶分子的調(diào)控部位中的-SH基團(tuán)作用，改變酶的空間構(gòu)象，引起非競爭性抑制。加入非競爭性抑制劑后，加入非競爭性抑制劑后，Km 雖然不變，雖然不變，Vmax減小減小=非競爭性米氏方程米氏方程3.3 反競爭性抑制l酶只有在與底物結(jié)合后，才能與抑制劑結(jié)合，引起酶活性下降。l反競爭性抑制可用下式表示：=加入反競爭性抑制劑后，Km 、Vmax均減小，雙倒數(shù)作圖為一組平

18、行線。反競爭性米氏方程米氏方程I競爭性抑制反競爭性抑制非競爭性抑制競爭性抑制不改變Vmax，非競爭性抑制不改變Km，反競爭性抑制兩者均變?。桓偁幮砸种聘淖儥M截距(Km 變大)、非競爭性抑制改變縱截距（Vmax 變小）總結(jié)四、溫度對酶反應(yīng)的影響 1、酶的最適溫度：酶達(dá)到最大反應(yīng)速度時(shí)的溫度 最適溫度是酶的特征之一，但不是一個(gè)特征常數(shù)，它與反應(yīng)時(shí)間、溶液的離子強(qiáng)度、緩沖溶液種類有關(guān)102030405060708090020406080100Temperature OCRelative Activity (%)最適溫度2、溫度對酶促反應(yīng)的影響 溫度升高,酶促反應(yīng)速度加快；另一方面,溫度升高,酶的高級結(jié)構(gòu)將發(fā)生變化或變性，導(dǎo)致酶活性降低甚至喪失。因此酶的最適合溫度是二者平衡的結(jié)果.3、大部分酶在60C以上失活變性。一般動物酶的最適溫度在35-40C，植物酶的最適溫度在40-50C。少數(shù)酶能耐受高溫，如細(xì)菌耐高溫淀粉酶在93C時(shí)活力最大，牛胰核糖核酸酶在100C時(shí)仍不失活。4、酶在干燥情況下比在潮濕情況下耐受的溫度高，這一點(diǎn)可用于酶的保存。五、pH對酶反應(yīng)的影響1、最適pH：酶具有最大的催