依諾的肝素的制備和純化

1、費(fèi)用：50000元以上 5000-10000元 10000-50000元1000-3000元 1000-5000 1000-5000元 500元以下 類型：新產(chǎn)品開發(fā) 生產(chǎn)工藝改進(jìn) 檢測(cè)方法建立/改進(jìn) 設(shè)備性能考察 輔助性試驗(yàn) 其 它 試 驗(yàn) 江西浩然生物醫(yī)藥有限公司項(xiàng)目研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目名稱： HR-08技術(shù)研究 負(fù) 責(zé) 人： 起止時(shí)間： 項(xiàng)目編號(hào)： HR-08-1503002 目 錄內(nèi) 容頁碼一背景資料二立項(xiàng)目的三研究?jī)?nèi)容四資金預(yù)算五實(shí)驗(yàn)研究時(shí)間計(jì)劃一、 背景資料依諾肝素鈉(enoxaparin sodium，1)屬于低分子肝素，主要特征為分子中有一個(gè)4一烯吡喃糖醛酸結(jié)構(gòu)(圖1)。本品抗血栓作用

2、強(qiáng)、出血危險(xiǎn)性小，是目前抗凝血、抗血栓形成的主要治療藥物之一，肝素通過酶或化學(xué)的方法部分降解就可以獲得低分子肝素。低分子肝素因?yàn)榉肿恿枯^小，不易被IV因子中和，抗凝血效果和纖溶作用得以增強(qiáng)，而抗血小板，影響血小板功能，影響血液的凝固性，誘發(fā)出血的作用大為減弱，加之生物利用度高達(dá)98%，量效關(guān)系明確，抗凝效果易于預(yù)防，血漿半衰期較普通肝素長(zhǎng)2-3倍，同時(shí)具有快速和持續(xù)的抗血栓形成作用，改善血流動(dòng)力學(xué)。依諾肝素鈉由法國(guó)AVentis 公司研發(fā)，并與1993年申請(qǐng)專利。但該專利未涉及生成過程中酯化率，成環(huán)率及生產(chǎn)純化等關(guān)鍵工藝。采用該轉(zhuǎn)利生成的樣品無法達(dá)到歐洲藥典4.0版規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過控制上

3、述反應(yīng)條件，得到適合于工業(yè)生成的依諾肝素鈉工藝，所得的成品溶液顏色符合歐洲藥典4.0版要求，其余質(zhì)量指標(biāo)均符合歐洲藥典5.3版。二、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕R制備和純化的工藝技術(shù)參數(shù)，進(jìn)行工藝放大和工藝穩(wěn)定性研究。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：實(shí)驗(yàn)步驟：3.1成鹽：3.1.1 稱取06樣品（例如100g）用純化水(1000ml)溶解到10%溶液，邊加入邊攪拌，至均勻；稱取06樣品質(zhì)量2.5倍的芐索氯胺(250g)用純化水(1250ml)溶解至20%溶液；3.1.2將上述20%芐索氯胺溶液緩緩加入肝素鈉溶液中，邊加邊攪拌，加完后繼續(xù)攪拌0.5小時(shí)；3.1.3將反應(yīng)液離心收集沉淀（離心速率與時(shí)間根據(jù)離心機(jī)直徑調(diào)整，一般來

4、說離心上清越清越好，離心效果直接與回收率相關(guān)，一般選用沉降式離心機(jī)？；3.1.4將沉淀搗碎（盡量搗碎）加入1.1中肝素鈉質(zhì)量10倍量的純化水(1000ml)攪拌洗滌0.5小時(shí)，離心收集沉淀（離心速率與時(shí)間根據(jù)離心機(jī)直徑調(diào)整，一般來說離心上清越清越好，離心效果直接與回收率相關(guān)。）；3.1.5重復(fù)1.4操作；3.1.6將沉淀60烘干，烘干至水分接近0.5%（用鹵素水分測(cè)定儀110，6分鐘），得到成鹽物中間體。(300g左右)（回收率以起始06樣品質(zhì)量算，應(yīng)該在300%（290%-310%）左右，烘干過程要注意翻盤，最終成顆粒（顆粒直徑盡量小于1cm），烘干溫度要控制好，一定不要超過 60

5、 ）3.2 成酯：3.2.1將成鹽物中間體（300g）用5倍量的二氯甲烷（1500ml）溶解，邊加入邊攪拌，至均勻，溶解溫度36；3.2.2加入成鹽物（300g）1倍量的氯化芐(300ml)，邊攪拌邊加入，完全加入后攪拌反應(yīng)25小時(shí)，反應(yīng)溫度35-36；3.2.3加入反應(yīng)液體積2倍量(3600ml左右)的10%（m/v，即結(jié)晶乙酸鈉質(zhì)量與甲醇體積之比）乙酸鈉甲醇溶液至反應(yīng)液中，邊加入邊攪拌，完全加入后，將溫度控制在25攪拌反應(yīng)1個(gè)小時(shí)，離心收集沉淀（離心速率與時(shí)間根據(jù)離心機(jī)直徑調(diào)整，一般來說離心上清越清越好，離心效果直接與回收率相關(guān)。）；3.2.4加入反應(yīng)液0.5倍量（900ml左右

6、）的甲醇，邊攪拌邊加入，至完全加入后，攪拌洗滌沉淀1個(gè)小時(shí)，離心收集沉淀（離心速率與時(shí)間根據(jù)離心機(jī)直徑調(diào)整，一般來說離心上清越清越好，離心效果直接與回收率相關(guān)。）3.2.5重復(fù)2.4；3.2.6將沉淀60真空烘干，烘干至干燥失重接近5%，得成酯物中間體。（120-150g左右）（ 烘干過程中注意翻盤，便于控制干燥失重，成酯物收率（相對(duì)于成鹽物）為40-50%）3.3 降解，純化：3.3.1將成酯物（120-150g左右，下面的計(jì)算按照135g計(jì)算）用20倍量（m/v）純化水（2700ml，根據(jù)成酯物質(zhì)量調(diào)整）溶解，邊加入邊攪拌，溶解溫度56，完全溶解加入原料肝素鈉重量0.08倍量的氫

7、氧化鈉（8g）（可以先用少量純化水溶解），邊加入邊攪拌，至均勻，反應(yīng)溫度56，完全加入后繼續(xù)攪拌降解80分鐘；3.3.2降解完畢，快速用6N鹽酸調(diào)溶液pH值至中性（pH試紙檢測(cè)即可），用澄清板過濾；3.3.3濾液加入溶液體積（2700ml）0.5%的過氧化氫（30%濃度）(13.5ml)，邊加入邊攪拌，完全加入后用20%氫氧化鈉調(diào)溶液pH值至10（pH試紙檢測(cè)即可），混勻后靜置氧化24小時(shí)（過程中每?jī)蓚€(gè)小時(shí)調(diào)節(jié)pH值10左右），氧化溫度27；3.3.4加入溶液體積（2700ml）2%的氯化鈉(54g)溶解，邊加入邊攪拌，至均勻，然后緩慢加入4倍量甲醇（10800ml左右），邊加入邊攪拌，至均勻

8、，靜置（一般靜置時(shí)間在半小時(shí)至一小時(shí)以內(nèi)），抽走上清。（如果中控可在此處，中控只需控分子量，如果不符合要求則繼續(xù)4倍量甲醇）3.3.5離心收集沉淀（130g-150g,下面按照140g計(jì)算）（離心速率與時(shí)間根據(jù)離心機(jī)直徑調(diào)整，一般來說離心上清越清越好，離心效果直接與回收率相關(guān)。）；（如果中控可在此處，中控只需控分子量，如果不符合要求，則繼續(xù)4倍量甲醇。3. 3.6將沉淀（140g）用純化水（700ml）溶解至20%濃度，加入溶液體積（700ml）1.0%的過氧化氫（7ml），20%氫氧化鈉調(diào)溶液pH值10（pH試紙檢測(cè)即可），混勻后靜置氧化氧化24小時(shí)（過程中每?jī)蓚€(gè)小時(shí)調(diào)節(jié)pH值10左右），氧

9、化溫度27；3.3.7用澄清板過濾，6N鹽酸調(diào)pH中性（pH試紙檢測(cè)即可）；3.3.8加入溶液體積（700ml）2%的氯化鈉（14g）溶解，邊加入邊攪拌，至均勻，然后緩慢加入4倍量甲醇（2800ml），邊加入邊攪拌，至均勻，靜置（一般靜置時(shí)間在半小時(shí)至一小時(shí)以內(nèi)），抽走上清；3.3.9離心收集沉淀（130g左右，要求沉淀中甲醇含量要低，便于凍干控制殘留），（離心速率與時(shí)間根據(jù)離心機(jī)直徑調(diào)整，一般來說離心上清越清越好，離心效果直接與回收率相關(guān)）。將沉淀（130g左右）用純化水（650ml）溶解至20%濃度；3.3.10調(diào)溶液pH7.0左右（用ph計(jì)調(diào)節(jié)，此pH關(guān)系最終產(chǎn)品pH項(xiàng)檢測(cè)是否合格，調(diào)節(jié)

10、要稍微準(zhǔn)確些），用0.22微米濾膜或?yàn)V芯過濾，凍干（20kg06樣品用10平米凍干機(jī)）。（ 回收率以起始06樣品質(zhì)量算在65%左右）4. 備注：凍干母液是20%濃度的溶液，即0.22微米濾膜或?yàn)V芯過濾后的溶液。5.6. （實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1 肝素芐索氯銨鹽的合成：取肝素鈉xg， 加水5xml溶解；取芐索氯銨2.5xg溶于水l 0x ml中，攪拌下將其緩慢加至肝素鈉溶液中過濾。濾餅用水洗滌，烘干，得肝素芐索氯銨鹽3.12x g。2 肝素芐基酯的合成：取肝素芐索氯銨鹽3xg，加二氯甲烷15xml攪拌溶解后， 緩慢滴加氯芐3.15x ml，35"C反應(yīng)25h。反應(yīng)畢加溶有醋酸鈉1.8x

11、g的甲醇18x ml，待沉淀析出后，過濾。濾餅用甲醇洗滌，干燥，得肝素芐基酯l.05x g。3 堿性條件下解聚：取肝素芐基酯3x g，溶于水90x ml中，加熱至62 ，加入氫氧化鈉0.45x g，攪拌解聚1h。反應(yīng)完畢，冷卻，用鹽酸調(diào)至pH 60，加氯化鈉90g使其終濃度為10。邊攪拌邊加甲醇0.27x L，析出沉淀，過濾。濾餅用甲醇洗滌，減壓干燥，得黃褐色1粗品2x g.4 純化：取1粗品2.3x g，加水溶解得5 溶液，加入活性炭，攪拌，過濾，濾液減壓濃縮至濃度為25(wv)。將1濃縮液上非極性大孔聚苯乙烯吸附樹脂柱，用水洗脫，收集目標(biāo)峰。收集液(約46x m1)中加入3倍體積乙醇沉淀1，過濾，濾餅加適量水溶解后冷凍干燥，得1成品1.88x g?？偸章?/p>