2020年(生物科技行業(yè))分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、生物科技行業(yè)） 分子生物 學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)動植物檢疫專業(yè)2012 ， 2分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)注意事項1 課前要提前預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，了解實(shí)驗(yàn)設(shè)計的原理，理清實(shí)驗(yàn)順序，制定實(shí)驗(yàn)方案（沒有 方案或方案不合理者不能進(jìn)入實(shí)驗(yàn)操作） 。2 由于實(shí)驗(yàn)內(nèi)容多，時間短，多數(shù)實(shí)驗(yàn)需要同時或穿插進(jìn)行，壹定要做好統(tǒng)籌安排。3 實(shí)驗(yàn)課中的所有單項實(shí)驗(yàn)都屬于壹個整體流程。實(shí)驗(yàn)時間安排上沒有上下午晚上等嚴(yán)格 的作息安排，壹切服從實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，必須在理論課上課期間完成。4 實(shí)驗(yàn)的每壹步都要詳細(xì)地記錄操作內(nèi)容、時間、步驟、結(jié)果等，以備查詢！5 對任何自己不熟悉的實(shí)驗(yàn)儀器都不要隨意操作（尤其是微量移液器！ ）。在操作的過程中 發(fā)

2、現(xiàn)任何意外的現(xiàn)象都要及時向任課教師匯報。6 寫作實(shí)驗(yàn)報告或?qū)嶒?yàn)論文壹定要文理通順、邏輯清晰、圖表說明詳細(xì)，討論分析透徹。7 在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不能大聲喧嘩。8 在實(shí)驗(yàn)的過程中制造的任何垃圾都要丟到垃圾筐里（或先放在自己的桌面壹角） ，嚴(yán)禁隨 地丟棄！特別注意對廢棄細(xì)菌的殺滅和有毒垃圾的定點(diǎn)投放。9 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后要把用過的器皿清洗后歸放整齊且清點(diǎn)數(shù)目，向教師匯報征得同意后方可離 開實(shí)驗(yàn)實(shí)。10 值日組的同學(xué)最后離開，等待清掃實(shí)驗(yàn)室的衛(wèi)生，關(guān)閉門窗水電。11 實(shí)驗(yàn)時損壞的任何物品都要及時申報。實(shí)驗(yàn)壹質(zhì)粒 DNA 的提取1目的 學(xué)會最常用的小量制備質(zhì)粒 DNA 的堿裂解方法。2原理根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒 DNA

3、 和線性 DNA 在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離。在 pH12.0 12.5 這個狹窄的范圍內(nèi)，線性 DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性。盡管在這項的條件下共價閉合環(huán) 狀質(zhì)粒 DNA 也會變性，但倆條互補(bǔ)鏈彼此互相盤繞，仍會緊密結(jié)合在壹起。當(dāng)加入 pH4.8 的乙酸鉀高鹽緩沖液使 pH 恢復(fù)中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒 DNA 復(fù)性快，而線性的染色體 DNA 復(fù)性緩慢，經(jīng)過離心和蛋白質(zhì)和大分子 RNA 壹起沉淀下去。3 器材超凈工作臺，接種環(huán)，酒精燈，臺式離心機(jī)，旋渦混合器，微量移液取樣器， 1.5ml 微 量離心管，恒溫?fù)u床，搖菌試管，雙面微量離心管架，試管架，標(biāo)簽紙，磁力攪拌機(jī)。4試劑pMD18-T-F

4、載體菌， LB 培養(yǎng)基 1000ml （含 100ug/ml 氨芐青霉素） ，葡萄糖 /Tris/EDTA（GTE） 溶液（溶液 I）， NaOH/SDS 溶液（溶液 II），KAc 溶液（ pH4.8 ）（溶液 III）， RNaseA ，95% 乙醇， 70% 乙醇， TEbuffer （ pH8.0 ）。5 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 氨芐青霉素儲存液（無菌水配制 5mg/ml ，分裝后 -20 C 保存），配制 LB 培養(yǎng)基（胰化蛋白 胨 10g ，酵母提取物 5g ，NaCl10g 加 200mLddwater 攪拌完全溶解， 用約 200 L5NNaOH 調(diào) pH 至 7.0 ，加 ddwater

5、至 1L ，121 C20min 滅菌）；溶液 I（ 50mmol/L 葡萄糖， 25mmol/LTrisHClpH8.0 ，10mmol/LEDTApH8.0 ）；溶液 II（ 0.2mol/LNaOH ， 1%SDS ）； 溶液 III（ 60mL5mol/LKac ，加冰乙酸調(diào) pH4.8 ，補(bǔ) ddwater 至 100ml ），70% 乙醇（ -20 C 保存），TEbuffer （ 10mmol/LTrisHClpH8.0 ， 1mmol/LEDTApH8.0 ）；10mg/mLRNaseA （RNA 酶 A 溶于 10mmol/LTrisHClpH7.5 ， 15mmol/LNa

6、Cl 中）；搖菌試管洗凈且蓋上棉 花塞、 1.5ml 離心管裝入鋁制飯盒、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒， 壹起高壓滅菌 （ 121 C30min ）。6 操作步驟（1）在超凈工作臺中取 5mlLB （Amp + ），加入滅菌的搖菌管中。（ 2）從超低溫冰箱中取出保存 pMD-18T-F 的菌種（操作完后迅速把菌種放回超低溫冰柜 中，切不可將菌融化！ ），在超凈工作臺上用燒紅的接種環(huán)刮壹下，再把接種環(huán)于無菌 LB 培 養(yǎng)液（含 100ug/ml 氨芐青霉素）中攪拌壹下， 37 C 搖床中搖 20h 。（ 3）取 1.5ml 的菌液于 1.5ml 離心管中， 15000rpm 離心 1min ，棄上

7、清液 （盡量棄干凈） ， 留沉淀備用。4 ）在沉淀中加入 100 l 溶液 I，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻，室溫下靜置5min 。等待的同時，取壹個塑料盒，裝上適量的冰塊備用。 ）5 ）加入 200 l 溶液 II ，蓋上蓋后上下顛倒幾次混勻，插入冰中，放置5min 。6）加入 150 l 溶液 III ，蓋上蓋后上下顛倒幾次混勻，插入冰中，放置5min 。1.5ml 離心管中，（不7 ）15000rpm 離心 5min ，小心吸取 400 l 上清液于另壹個干凈的 要將白色沉淀物帶入！ ），加入 800 l95% 乙醇，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻，室溫下靜置 5min 。8 ) 15

8、000rpm離心 10min ，小心棄掉上清液，加入500 l70% 乙醇，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻。15000rpm 離心 10min ，小心棄掉上清液，盡量倒置棄干凈9 ）再加入 500l70% 乙醇， 蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻。15000rpm 離心 10min ，小心棄掉上清液，盡量倒置棄干凈10 ）離心管倒置于 37 C 培養(yǎng)箱中（或室溫）空氣干燥。 （管底的沉淀質(zhì)粒 DNA 用肉眼幾 乎見不見?。?。（11 ）pMD18-T-F 加入 30 l 無菌蒸餾水或 TE緩沖液，用記號筆標(biāo)記后放入冰箱中備用。 （12 ）在剩余的菌液中倒入少許 84 消毒液，待溶液變清亮后隨廢液和

9、剩余的冰塊壹起倒入 下水池。清理桌面，清洗儀器，撰寫實(shí)驗(yàn)報告7思考（1）影響本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素有哪些？實(shí)驗(yàn)二、質(zhì)粒 DNA 的酶切1目的學(xué)會用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒 DNA 。2原理II 型限制性內(nèi)切酶能識別雙鏈 DNA 內(nèi)部的特殊序列且在識別位點(diǎn)處將雙鏈切斷，形成粘性 末端或齊平末端，通過電用酶切后的 DNA 混合物能夠確認(rèn)和分離酶切片段。3 器材旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭， 1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，水 漂，恒溫水浴。4試劑pMD18-T-F 質(zhì)粒， EcoRI ， BamHI ，內(nèi)切酶緩沖液（ 10 ×）， 10 ×電泳加樣緩沖液5 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備配

10、制 TAE電泳緩沖液 （50 儲存液），1000 溴化乙錠儲存液 （0.5mg/ml ），10 加樣緩沖液，1.5ml 離心管裝入鋁制飯盒（滅菌） 、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）6 操作步驟（ 1）混合下列溶液于壹個無菌的1.5ml 微量離心管中：pMD18-T-FDNA（ 或 pUCm-T-F）6 L10 ×酶切緩沖液（用 EcoRI 的緩沖液） 2Lddwater30 LEcoRI1 LBamHI1 L總體積 40 L（ 2）先準(zhǔn)備壹個冰盒且放入壹定量的冰塊。從-20 冰柜中取出限制性內(nèi)切酶，立即插入冰塊中。（ 3）用壹只手的手指捏在盛放酶的微量離心管的上部（以免手指的給酶

11、液加溫），另壹只手持微量移液器，小心翼翼地吸取 1 L限制性內(nèi)切酶。（4 ）在酶切樣品混合液中加入限制性內(nèi)切酶后（立即把內(nèi)切酶原液送回冰柜?。?，輕輕震動微量離心管使管中的溶液混勻。再在離心機(jī)中 1000rpm 離心 10 秒。取出后插到水漂的孔 中，在推薦的最適酶切溫度水浴中溫育 1-3h （壹般是 37 ）。（5）酶切后取少量酶切產(chǎn)物和合適的已知分子量的DNA （如先前的 PCR 產(chǎn)物）對比電泳，以確認(rèn)切下的片斷是否為自己想要的片斷。（6）酶切后的質(zhì)粒能夠回收備用。（7）清理桌面垃圾，清洗實(shí)驗(yàn)儀器。撰寫實(shí)驗(yàn)報告。7思考（1）酶切反應(yīng)混合物的體積是否對酶切效果有影響？為什么？（ 2）如何估計

12、DNA 用量和酶的用量？（3）在吸取內(nèi)切酶的時候如何操作才能別免浪費(fèi)？實(shí)驗(yàn)三、質(zhì)粒 DNA 的 PCR 擴(kuò)增1目的學(xué)會 PCR 操作的基本技術(shù)。2原理是將待擴(kuò)增的 DNA 模板加熱變性，和其倆側(cè)互補(bǔ)的寡聚核苷酸引物復(fù)性，然后經(jīng)過耐熱的DNA 聚合酶延伸。再進(jìn)入下壹輪變性復(fù)性延伸的循環(huán)， n 次循環(huán)后 DNA 可被擴(kuò)增（1+X ） n倍。其中 <25nt 的引物退火溫度 Tm=2 （A+T ）+4 （G+C ）。3 器材旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭， 0.2mlPCR 微量管，雙面微量離心管架， PCR 儀，臺式離心機(jī)，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)，水漂，恒溫水浴。4試劑3U/ lTaqD

13、NA聚合酶， PCR 緩沖液（ 10 ×，MgCl 2free ）， 25mMMgCl 2，dNTP ，引物， 模板質(zhì)粒 pMD18-T-F ，無菌 ddwater 。5 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備dNTP 混合液（每種 25mM ），TAE 電泳緩沖液， 1000 溴化乙錠儲存液（ 0.5mg/ml ），10 加樣緩沖液， 1.5ml 離心管裝入鋁制飯盒（滅菌） 、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌） 。 合成的引物：Senseprimer5'-GGATCCGCGCAATCTGTTCCTTATGGC-3' Antisenseprimer5'-GAATTCTTGTGCAGCTGC

14、TTGTACGTTG-3' 目的基因模板質(zhì)粒：已經(jīng)克隆在 pMD18-T-F 載體上的 781bpNDV-F 基因。 待擴(kuò)增的 F 片段長度： 837bp 。6 操作步驟（1）在 0.2mlPCR 微量離心管中配制 50 l反應(yīng)體系。 ddwater32 l10 ×PCRbuffer （不含 MgCl 2） 5l 25mMMgCl 23 l2.5mmol/LdNTP4 l （每d種NTP 終濃度 0.2mM ）10 mol/LPrimer1212.l5 （ 25pmoles ）10 mol/Lprimer22 l（ 12.5 25pmoles ） 模板質(zhì)粒 1 l（1

15、5;10 -3 pmoles ） 3U/ lTaq 酶 1l（3u ） 總體積 50 l（ 2）根據(jù)廠商的操作手冊設(shè)置 PCR 儀的循環(huán)程序： 94 5min 94 1min 60 1min 72 1min50s goto 29times 72 10min （3）PCR 結(jié)束后，取 10 l產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。觀察膠上是否有預(yù)計的主要產(chǎn)物帶。 （4）清理桌面，撰寫實(shí)驗(yàn)報告。7思考（1）復(fù)性溫度如何確定？（ 2）為什么要在最后延伸 10min ？（ 3）是否有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物（或引物二聚體），如何才能消除？實(shí)驗(yàn)四、 DNA 電泳鑒定1目的學(xué)會常用的 DNA 瓊脂糖凝膠電泳、 。2原理DNA

16、雙螺旋分子骨架倆側(cè)帶有含負(fù)電荷的磷酸根，在電場中會向正極方向移動。不同長度的 DNA 由于受到凝膠介質(zhì)的阻力不同，表現(xiàn)為不同的遷移率而被分開。3 器材電泳儀，水平凝膠電泳槽和梳子及其制膠模塊， 250ml 三角瓶，微波爐，臺式離心機(jī)， 旋渦混合器，凝膠成像系統(tǒng)，分光光度計，微量移液取樣器， 1.5ml 離心管，雙面微量離心 管架，試管架等。4試劑pMD18-T-F 載體， TAE電泳緩沖液， 1000 溴化乙錠儲存液，電泳級瓊脂糖粉， 10 加樣緩 沖液（或 6 加樣緩沖液）， DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)（ DNAHindIII:23130 ，9420 ，6560 ，4360 ， 2320 ，2030

17、 ，560 ，130bp ）。5 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備配制 TAE 電泳緩沖液（ 50 儲存液， pH 約 8.5 ： Tris 堿 242g ， 57.1ml 冰乙酸， 37.2gNa 2EDTA.2H 2O ，ddwater 定容至 1L ），1000 溴化乙錠儲存液（ 0.5mg/ml ：50mg 溴化乙錠溶于 100mLddwater ，4 C 避光儲存） ， 10 加樣緩沖液（ 20%Ficoll400 ， 0.1mol/LNa 2EDTApH8.0 ，1.0%SDS ，0.25% 溴酚藍(lán)）；6 加樣緩沖液 （0.25% 溴酚藍(lán)， 40% 蔗糖水溶液） ； 1.5ml 離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）

18、 、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌） 。 6 操作步驟（ 1）稱取 0.5g 瓊脂糖粉，放入三角瓶，加入 50mlTAE 電泳緩沖液 （1 ），放入微波爐中燒 開（ 1min ）。 50ml 正好倒倆塊小膠。（ 2 ）注意觀察燒瓶中的瓊脂糖粉末，待完全熔化后停止微波爐（切不可讓膠溶液溢出到微 波爐中?。?。（ 3）戴上線手套，從微波爐中取出三角瓶，置桌面上冷卻致不燙手（約50-60 C）。（ 4 ）把梳子插到凝膠灌制模具的正確位置后緩緩倒入膠溶液。膠溶液倒至和模具的矮邊緣 相平即可，不要把膠溶液溢到外面。在桌面上靜置 10-20 分鐘待膠完全凝固。 （剩下的膠溶 液封口后留待以后再熔化使用） 。（ 5 ）在水平電泳槽中加滿1 TAE 電泳緩沖液。根據(jù)電泳槽的長度把電泳儀的電壓調(diào)至170V（10V/cm） ，注意正負(fù)電極的位置連接正確。（ 6）待膠完全凝固后（ 15-20 分鐘），小心拔出梳子。用手指捏住模具倆