miRNA的設計研究方法

1、科研中的 miRNA研究方法總結microRNA(miRNA) 是一類長度在 22nt 左右的內源非編碼小 RNA，廣泛存在于動物、植物、 病毒等多種有機體中。 1993 年， Lee 等人在秀麗新小桿線蟲 (C.elegans) 中發(fā)現了控制著線蟲 時序性發(fā)育的 lin-4 。2000 年， Reinhart 等發(fā)現了另一個具有轉錄后調節(jié)功能的小分子RNA：let-7 。隨后的幾年時間里，許多研究人員相繼發(fā)現了這類RNA，并將這些具有時空表達特異性的非編碼小分子 RNA命名為 microRNA(miRNA) 。從長的初級 miRNA(pri-miRNA) 到形成成熟的單鏈 miRNA到與靶標

2、 RNA結合，至少需要四步： 首先是由核糖核酸酶 Drosha 和 DGCR8組成的復合物將初始 miRNA 轉錄本( pri-miRNA )加工 成 miRNA前體( pre-miRNA )；接著由轉運蛋白 Exportin-5 和 Ran GTP酶將 miRNA從細胞核轉 運到細胞質中；第三步是由另一種核糖核酸酶 Drosha 將 miRNA前體剪切成成熟的 miRNA雙鏈， miRNA 雙鏈打開，其中一條進入到 RNA誘導的沉默 RISC 復合體( RISC)中，該復合體還包含 TarRNA結合蛋白( TRBP)；最終 RISC 復合體根據 miRNA與靶標 RNA的互補配對，對靶基因進

3、行 剪切，或者翻譯抑制。圖 1 miRNA 生物學調控過程(摘自文獻 8)miRNA通過作用于相應靶 mRN，A 參與細胞增殖、凋亡、分化、代謝、發(fā)育、腫瘤轉移等多 種生物學過程。預測超過 1/3 的人類基因都是保守的 miRNA靶基因。近些年，隨著科學研究的 進展，大量的 miRNA 已經被鑒定出來，截至目前發(fā)現的人的成熟的miRNA 有 2578 條，小鼠的有 1908 條。雖然 miRNA 的數量很多，但大多 miRNA的功能并不為人所知。因此，準確快速地 預測并鑒定 miRNA 的靶基因，對研究 miRNA的功能具有十分重要的意義。下面本篇文章將著重介紹一下在醫(yī)學科研領域中如何快速高效

4、的鑒定與人類疾病相關的miRNA及其功能研究方法。一、miRNA的定量檢測成熟 miRNA 的片段小，只有 21bp 左右，變異較大，在不同細胞中的表達差異較大，低表達的 miRNA為其定量檢測帶來了很大的困難和挑戰(zhàn)。盡管如此，隨著科學的進步，越來越多的miRNA 檢測方法被建立起來，極大程度的促進了miRNA 研究進展。下面介紹下在疾病研究中常用的五大miRNA定量檢測方法。Northern blotting: 是較為經典的檢測各組織和器官中RNA 的量和大小及估計其豐度的實驗方法。主要實驗步驟包括：完整的RNA的分離；根據 RNA的大小通過瓊脂糖凝膠電泳對 RNA進行分離；將 RNA 轉移

5、到固相支持物上，在轉移過程中，要保持RNA在凝膠中的相對分布；將RNA固定到固體支持物上；固相 RNA 與探針分子雜交；除去非特異結合到固相支持物上的探針 分子；對特異結合的探針分子的圖像進行檢測、捕獲和分析。優(yōu)點：高度靈敏，而且通過結合 RNA marker 可以檢測出 miRNA的片段大小，能夠排除實驗被其他小分子RNA污染的可能性性，但Northern blotting 對樣品的需求量較高，操作步驟繁瑣，不適用高通量分析。微陣列芯片技術( microarry )：也稱生物芯片、 DNA 芯片或者基因芯片技術，是一種平面的基 質載體，上面規(guī)則地、特異性地吸附著基因或基因的產物。當與熒光標記

6、過的樣本雜交后，相應位 置熒光信號的強弱即可反映對應基因表達的豐度。其優(yōu)點是能夠同時檢測多個樣本的表達量，實現 miRNA的高通量分析。但芯片檢測技術對miRNA的純度質量要求較高，現行的 RNA提取為了獲取高質量了 RNA，往往會在純化過程丟失掉許多小分子RNA，影響一些低表達 RNA 的檢測。另外芯片技術的一個突出的缺點就是信息質量的穩(wěn)定性和可重復性較差。這些方面都需要改進。原位雜交： 該技術可以更為直觀的顯示出 miRNA 的表達情況，可直接觀測到 miRNA的表達時間， 表達分布范圍，具體位置等，不僅可以檢測不同細胞系單個細胞中的 miRNA 表達，還可在不經分類 和分離的情況下，比較

7、不同細胞系中miRNA的表達水平。但 miRNA分子太小，要對傳統(tǒng)的原位雜交技術進一步改進，增加雜交的親和性，結合牢固性，以防止洗脫過程中的丟失，造成結果不準確。RT-PCR： 與雜交方法相比， PCR方法可以高度靈敏的檢測出低表達的miRNA，并適合于高通量篩選。由于 miRNA 分子片段小，研究者們通過對其反轉錄引物進行特異性設計使得RT-PCR定量檢測 miRNA成為可能，根據所用引物的不同可以將其分為兩大類，一類是Oligo d(T) 特異的 RT引物，miRNA在反轉錄前需要對其 3'末端加多聚尾 Poly(A) ，再使用 Oligo-Universal Tag 通用逆轉錄引

8、 物進行逆轉錄反應，最終生成 miRNA對應的 cDNA第一鏈。莖環(huán)結構的 RT 引物由可以自身呈莖環(huán)狀 的特異序列加上 6 個到 8 個 miRNA3'端反相互補堿基組成，一條 miRNA序列對應一個特異的莖環(huán)結 構的反轉錄引物。兩者相比，前者引物設計容易且檢測通量高，但檢測靈敏度和特異性比后者低。 熒光定量 PCR根據所用熒光來源不同可以分為SYBR Green染料法和 TagMan探針法。miRNA 深度測序： 該技術能夠直接對樣本中特定大小的miRNA分子進行高通量測序，可以在無需任何miRNA 序列信息的前提下研究 miRNA的表達譜，并發(fā)現和鑒定新 miRNA 分子。新一代

9、測序最常使用的 3 種平臺是 Illumina 的基因組分析儀、 Roche454基因組測序儀以及 AB Life Technologies的 SOLiD系統(tǒng)。因為 miRNA的序列較短，較多應用于miRNA檢測的新一代測序技術平臺為Illumina 基因組分析儀和 ABLife Technologies 的 SOLiD系統(tǒng)。 Illumina 基因組分析儀具有所需樣品少，數據誤差小，操作流程簡單 等特點。 SOLiD系統(tǒng)的讀長為 35nt ，且準確度最高，單次運行所得的數據量最大，特別適用于miRNA的研究。而 Roche454基因組測序儀測序讀長可達 400500堿基，而 miRNA序列長

10、度僅為 22堿基，所以該測序儀 常用于新物種的基因組測序和轉錄組測序，極少應用于miRNA測序。二、miRNA的靶基因尋找研究表明，一個基因可以受多個 miRNA調控，而一種 miRNA 又可以參與調控多個靶基因，據預 測，至少有 30%的人類基因是 miRNA 的靶基因。這就足以顯示出 miRNA群體的重要性。而在人類疾 病中多不同程度的表現出大量 miRNA 的上調和下調，這也足以顯示 miRNA在疾病發(fā)生過程中占據著 非常重要的作用。而探討 miRNA 的功能作用中最重要的一步就是高效準確的尋找到其所調控的靶基 因。目前尋找靶基因主要是從以下兩個方面入手。1生物信息學方法miRNA 靶基

11、因的預測主要是根據生物信息學的方式進行，主要是根據以下幾個方面進行預測： miRNA與靶基因結合位點的互補性； miRNA靶位點在不同物種之間的保守性； miRNA-mRNA結 合的熱穩(wěn)定性； miRNA靶位點處不應有復雜二級結構； miRNA 5端與靶基因的結合能力強于3端。除以上幾個基本原則外， 不同的預測方法還會根據各自總結的規(guī)律對算法進行不同的限制與 優(yōu)化。目前比較常用的靶基因預測軟件有：miRanda、 TargetScan 、 PicTar 、 miRWalk、 miRanda、miRDB等，其中在 miRWalk 中可以查找到已經被研究證實的 miRNA 的靶基因，也可以查找與某

12、種疾 病相關的 miRNA等。雖然靶基因預測軟件很多，但其預測特異性和敏感度還有待改善，一個軟件針對一個miRNA 通常可以預測出上千條靶基因，這就為后續(xù)的實驗驗證帶來了許多困難，雖然我們可以結合多個軟件 進行 miRNA 的靶基因預測，但在取幾個軟件預測結果的交集時也忽略了許多真實的靶基因，在這兩 者之間的權衡就需要我們研究者去綜合參考其他方面的因素來抉擇。比如，我們可以結合DAVID 軟件對所選靶基因進行 GO分析或通路分析，來針對某一特定功能方面進行靶基因的選擇。預測方法網址檢索范圍算法特點miRanda/人 ， 果 蠅， 斑馬魚序列匹配， 雙

13、鏈結合自由能， 物種間保守 性TargetScan/TargetScanS/人 ， 小 鼠， 大鼠， 狗提出“ miRNA種子區(qū)”的概念RNAhybridhttp:/bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/哺乳動物快速準確計算 miRNA-mRN二A 聚體自由能DIANA- microT/人 ， 小 鼠，大 鼠， 果 蠅考慮 miRNA調控單個靶位點的情況PicTar/脊椎動物區(qū)分“完全匹配種

14、子區(qū)”與“不完全匹配種子區(qū)”RNA22na22.html哺乳動物不考慮保守性， 由mRN入A 手預測相關 miRNA2 生物學實驗方法由于計算機模擬在預測 miRNA靶基因時存在一定的局限性，因此很多醫(yī)學科研人員也希望能夠利用 生物學實驗方法直觀地尋找 miRNA靶基因。(1) 從 mRNA水平尋找 miRNA靶基因一種方法是將 miRNA模擬物或過表達載體轉染至細胞中，使得miRNA在細胞中過表達， 之后利用基因芯片分析 mRN的A 變化以找出相應 miRNA的靶基因。此外， Beitzinger 等人利用 AGO蛋白家族既能結合 miRNA又能結合 mRN的A 特性，分別使用 AGO-1和

15、 AGO-2蛋白的單克隆抗體在人類細胞中進行免疫共沉淀， 得到與 AGO-1和 AGO-2蛋白結合的 mRNA各 600條， 并通過克隆測序對這些 mRNA進行鑒定。同時從與 AGO-1 蛋白結合的 mRNA中隨機挑選 6 條進行熒光素酶報告基因檢測，發(fā)現其中有 5條都是 miRNA的靶基因。Easow等人也是利用純化 miRNP來分析 miRNA的靶基因。他們利用基因芯片分析了miRNP結合的 mRNA后發(fā)現，大量計算機預測的 miRNA靶基因得到了富集，同時為了分析單個miRNA的靶基因， 對野生型果蠅和 miR-1缺失果蠅的 miRNP結合mRNA進行了分析，得到并利用實驗方法鑒定miR

16、-1調節(jié)的 mRN，A為 miRNA靶基因的尋找提供了新的思路。最近， Liu 等 人在研究 Mir-16 家族的功能時建立了一種針對 miRNA靶基因的反向 篩選法。首先，確定了感興趣的基因ccnd1，將它的 3UTR構建到熒光素酶報告載體中，之后與構建的miRNA表達文庫共轉染 HepG2細胞，得到熒光值明顯下降的 miRNA，再將得到的 miRNA在體內驗證其功能， 最終得到 Mir-16 家族能夠調節(jié) CCND基1 因。該方法的關鍵在于，利用了自行構建的miRNA表達文庫，能夠方便同時研究多條 miRNA，通過體外實驗對候選 miRNA進行初步篩選，從而快速地鑒定一條mRN所A 對應的

17、多條 miRNA。(2) 從蛋白質水平尋找 miRNA靶基因Selbach 和 Baek兩個研究組分別利用蛋白質組學的研究方法，建立了從蛋白質水平尋找miRNA靶基因的新方法。兩個課題組分別將成熟miRNA雙鏈轉染 HeLa細胞，利用細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標記技術(stableisotope labeling with amino acids in cell culture)，將轉染了成熟 miRNA雙鏈的細胞和正常細胞分別培養(yǎng)于含輕 / 重型穩(wěn)定同位素標記必需氨基酸的培養(yǎng)基中，經過若干次細胞倍增后，穩(wěn)定同位素按 照序列特異的方式完全摻入到新合成的蛋白質中，通過比較標記前后同一肽段的質譜峰值變化實

18、現對蛋白質的精確定量。在檢測了 20005000個蛋白后，兩個研究組分別發(fā)現，轉染一條miRNA后有幾百個蛋白的表達水平發(fā)生了改變，許多改變在mRNA水平上不能得到體現。蛋白質組學相關研究方法的引入，使得人們可以從蛋白質水平上尋找 miRNA的靶基因， 從而提高了靶基因的檢出率。三、miRNA 靶基因的驗證與 miRNA 靶基因的預測方法相比，對miRNA 靶基因進行實驗驗證的方法并不多， 目前還沒有一個快速、簡便、高通量的鑒定方法。最直接的鑒定方法是， 利用熒光定量 PCR及 Western blot 方法分別檢測轉染或敲低 miRNA后細胞中 mRNA水平及蛋白水平的變化，從而確定miRN

19、A 與靶基因的對應關系。這種方法能夠直接鑒定出miRNA的靶基因， 準確度高但不能鑒定 miRNA的靶位點。轉染或敲低 miRNA： 方式主要有兩種，一種是構建 miRNA過表達載體的穩(wěn)定表達系統(tǒng)，一種是 人工合成 miRNA類似物的瞬時表達方式。 miRNA 的過表達載體中有插入成熟 miRNA、pre-miRNA 及 pri-miRNA 序列三種形式。其中 pri-miRNA （含側翼序列）的方式由于保留了每個 microRNA 獨自的 原始天然雙臂結構，效果更好，是應用最為廣泛的方法。 microRNA 過表達系統(tǒng)中有 CMV啟動子（ II 型啟動子）和 H1啟動子（ III 型啟動子）

20、兩種方式供選擇。 III 型啟動子（ H1、U6 等）具有表達效 率高、有效的確定終止位置等優(yōu)點，成為首選。 II 型啟動子適用于 pri-miRNA 序列中有連續(xù)的 5 個 T- 導致 III 型啟動子（ CMV、Ubi 等）終止轉錄的情況。載體系統(tǒng)也分多種，包括慢病毒載體、腺病 毒載體、質粒載體等。瞬時過表達方式主要是經過人工化學修飾的運用化學方法合成的雙鏈RNA，能模擬細胞中內源性成熟 miRNA的高水平表達，以增強內源性 miRNA的調控作用，進行功能獲得性 研究。只需直接轉染進入細胞，即可檢測功能變化，快速，方便。miRNA 靶位點鑒定： 目前最為常用的 miRNA靶位點鑒定方法是熒

21、光素酶報告基因法。其基本原 理是首先構建熒光素酶表達載體，將希望鑒定的 miRNA 靶基因的 3UTR 構建到熒光素酶基因的 3UTR中，之后將構建好的載體轉染細胞并改變細胞中相應miRNA的表達水平，最后檢測熒光素酶的表達情況以分析轉染 3UTR中是否含有 miRNA的靶位點。近幾年來，對 miRNA 的研究已經成為醫(yī)學科研領域中的一個重要方向。越來越多的研究揭示出 其在疾病的發(fā)生及發(fā)展中處于重要地位，另外，它在疾病診斷、治療及預后提示方面的作用也被有 關研究所證實。在目前很多課題研究都會涉及 miRNA 領域，而了解 miRNA基本研究思路及方法是研 究中不可缺少的一步。在設計課題方案時，我們要靈活選擇運用這些研究方法，以便使我們的研究 方案更加新穎、合理、嚴謹。參考文獻1. 王芳， 余佳 & 張俊武 . 小 RNA (MicroRNA) 研究方法 . Chinese Journal