第八章分子標記及其應用

1、第八章 分子標記及其應用1) 分子標記的種類與特點1. 遺傳標記的種類與特點遺傳標記：指可以穩(wěn)定遺傳的、易于識別的特殊遺傳多態(tài)性形式。Minisatellites：小衛(wèi)星序列遺傳標記的種類與特點1）形態(tài)標記：肉眼可見的特征性狀，簡單實用，但數目少，受發(fā)育階段與環(huán)境影響。 2）細胞標記：染色體核型與帶型，受環(huán)境影響小，穩(wěn)定可靠，但耗時耗力，信息量不足。 3）生化標記：貯藏蛋白、同工酶等，信息量較大，取材方便，但不能反映基因組非編碼區(qū)信息，仍受發(fā)育階段與環(huán)境影響。 4）DNA分子標記：基因組DNA 水平的變異，理想的遺傳標記。2. DNA分子標記DNA分子標記：簡稱分子標記，指基因組DNA 水平上

2、的任何差異，來自缺失、插入、置換、顛換、重復等，通常以分子雜交或凝膠電泳圖譜的形式體現。2.1 分子標記的優(yōu)點1）數量多，遍及整個基因組，理論上檢測位點近乎無限；2）穩(wěn)定遺傳，不受環(huán)境、發(fā)育階段和是否表達等限制;3）多態(tài)性高，自然存在，無須專門創(chuàng)造；4）表現為“中性”，即不影響性狀的表達；5）許多為共顯性，能鑒別雜合與純合，提供完整的遺傳信息。 2.2 分子標記的類型分三大類: 1) 基于核酸分子雜交: 第一代，1980s, RFLP（Restriction fragment length polymorphism ），限制性片段長度多態(tài)性2) 基于PCR或限制酶切+PCR: 第二代，1990

3、s ,RAPD、AFLP、SSR、ISSR、 SCAR、STS等3) 基于DNA測序: 第三代，近年來SNP和EST,反轉錄轉座子等第三節(jié) 分子標記的應用1. RFLP標記RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)：限制性片段長度多態(tài)性，1980，Botstein?；驹恚翰煌蚪MDNA經特定限制酶消化后產生大小不等的片段，再經電泳分離、Southern 印跡雜交和檢測后，得到特異的RFLP 標記，它反映不同DNA對所用探針限制性酶切片段長度的多態(tài)性，實際是酶切位點的變化和分布情況。關鍵因素：限制酶：用一種酶切產生的多態(tài)性有限，常用68種

4、酶來篩選多態(tài)性。探針：常用單拷貝或低拷貝 gDNA或cDNA克隆，否則條帶模糊（smear），不易觀察。RFLP標記的優(yōu)缺點優(yōu)點：1）共顯性；2）存在于整個基因組，位點數不受限制，?？蓹z測到14個基因座；缺點：1）篩選多態(tài)性探針較困難，需一系列探針；2）DNA樣本量要求大，操作較繁雜，耗時費資，同位素污染，現已發(fā)展地高辛等標記。2. RAPD 標記RAPD (Random amplified polymorphic DNA)：隨機擴增多態(tài)性DNA。1990年提出?；驹? 單引物PCR標記 ；不同基因組DNA在隨機引物Arbitary primer （810bp）結合位點以及2個結合位點之間

5、的距離可能不同，導致擴增片段數目和長度不同，經電泳分離顯示出來，反映基因組相應區(qū)域DNA的多態(tài)性。步驟：退火溫度36左右，其余同普通PCR。 RAPD 標記的優(yōu)缺點優(yōu)點：1）簡單快速，模板用量少，無需同位素；2）無需基因組序列信息，引物通用；3）成本低。缺點：1）顯性標記，不能鑒別雜合子與純合子；2）穩(wěn)定性和重復性較差；受很多因素影響： 退火延伸溫度，模板濃度，Mg2+濃度，試劑污染，應舍重復3）序列不同但長度相同的片段共遷移，使多態(tài)性檢測受限制.只能分開片段長度不同的dna片段，對于長度相同但堿基組成不同的就分不出來3. AFLP標記AFLP (Amplified fragment leng

6、th polymorphism)：擴增片段長度多態(tài)性，1992 年提出，RFLP與PCR相結合的產物?；驹? 基因組DNA限制酶切（1種為常見6堿基切點，另1種為4堿基稀有識別位點，常為EcoRI（6）/MseI（4） ），酶切后DNA片段連接雙鏈人工接頭（1418bp，核心順序+限制酶識別序列，隨機設計 ），以接頭和相鄰的限制酶位點作為引物結合位點，進行 雙引物PCR擴增，產物用高分辨力測序膠分離。此多態(tài)性主要來自引物3端選擇性核苷酸的變化。AFLP關鍵技術：引物的設計與組合。引物由三部分組成:1) 5端與人工接頭互補;2) 中間部分與限制酶識別位點互補;3) 3端為13個選擇性核苷酸。

7、AFLP 圖譜常用23個選擇性堿基，每個泳道50100條帶AFLP標記的優(yōu)缺點優(yōu)點：1）兼具PCR的高效性與RFLP的準確性；2）常擴增50100條帶，多態(tài)性高，信息量大；3）通過設計不同接頭就可得到不同的引物，無需基因組序列信息。缺點: 1）步驟多，流程長，重復性不夠好；2）需放射性同位素或熒光素等標記引物，但目前已發(fā)展銀染技術；3）顯性標記。4. SSR標記SSR（simple sequence repeat）：簡單序列重復，也稱微衛(wèi)星 (microsatelite) DNA，真核基因組中普遍存在，隨機分布，主要位于非編碼區(qū)；重復單元25 bp，串聯重復1060次，多態(tài)性主要來自串聯重復次

8、數的不同。SSR標記的原理: 不同基因型某一特定位點的SSR長度不同, 但其側翼序列往往是保守的單一序列，據此側翼序列設計雙引物，經PCR擴增即可得到長度不同的SSR片段，產物經PAGE或高濃度瓊脂糖凝膠電泳，即可顯示不同基因型在此位點的多態(tài)性。注：一般檢測的是單一位點的復等位基因，農作物中多數SSR位點的復等位基因數多達十幾甚至幾十個，多態(tài)性高。SSR側翼序列的獲得：（作為設計引物的模板）一般程序：1）建立基因組DNA的質粒文庫；2）根據預得到的SSR類型設計并合成探針，如預獲得(AT)n/(TA)n，則合成(AT)n探針；3）用探針篩庫，獲得陽性克??；4）對陽性克隆DNA插入序列進行測序。

9、SSR標記的優(yōu)缺點優(yōu)點：1) 序列短， 多數小于200bp，易擴增；2) 有高度多態(tài)性，信息量大；3) 共顯性。缺點： 須獲得側翼序列設計引物，步驟多、費用高； 引物具有物種特異性。 5. SNP標記SNP (single nucleotide polymorphism)：單核苷酸多態(tài)性，指不同基因組DNA中某一特定位置上單個核苷酸的差異，包括單堿基的轉換、顛換、插入和缺失等，而且其在群體中出現的頻率大于1%（如低于1%，則視為點突變，不可能作為標記）。SNP的分布與遺傳效應1）分布于編碼區(qū)：即cSNP，功能性變異，可能會影響蛋白產物的氨基酸序列和功能。2）分布于非編碼區(qū)：即調節(jié)區(qū)/基因周邊S

10、NPs，可能影響基因的表達水平。SNP是決定人類疾病易感性和藥物反應差異的主要因素，有些疾病和性狀與SNP有關，如人鐮刀型細胞貧血癥。SNP的檢測方法：有近百種，包括雜交法、熔解法、電泳法、酶學法、化學法、物理法、測序法（最直接）以及它們的組合方法，綜合利用納米材料技術、多重PCR技術、各種熒光探針設計技術和各種熒光標記技術等。DNA芯片技術在高通量檢測SNP方面顯示出獨特的優(yōu)勢，最理想、最具有發(fā)展?jié)摿?，但仍存在成本高、重復性不夠好等問題。 SNP標記的優(yōu)缺點優(yōu)點：是覆蓋全基因組、標記數量最大，多態(tài)性最高的標記，缺點：SNP技術主要建立在基因組測序基礎之上，尚難在未測序生物上應用。6. ISS

11、RISSR：（inter-simple sequence repeat, ISSR）：區(qū)間-簡單重復序列。以加錨SSR寡聚核苷酸作引物，對位于反向排列的SSR之間的DNA序列進行擴增，而不是擴增SSR本身，反映SSR區(qū)間多態(tài)性。ISSR引物設計：簡單，無需知道DNA序列，長度1618bp，由14bp組成的串聯重復和幾個非重復的錨定堿基組成，用以擴增兩側具有反向排列SSR的一段DNA序列，只有與錨定堿基互補的位點才被靶定，提高了擴增的轉一性。單引物PCR標記。7. SCARSCAR（sequence characterized amplification region）：特異序列擴增區(qū)域標記。在

12、對基因組DNA做了RAPD分析后，將目標RAPD片段克隆并進行末端測序；再根據2端序列設計特異引物，即前10個堿基應包括原來的RAPD引物；用此引物對基因組DNA再擴增，即可將與原來RAPD片段相對應的單一位點鑒別出來。8. STSSTS（sequence-tagged sites）：序列標簽位點/序標位，是對以特異引物序列進行 PCR擴增的一類分子標記的總稱，用來擴增、分析基因組中特定區(qū)域的多態(tài)性 第三節(jié) 分子標記的應用1. 分子遺傳圖譜的構建經典遺傳圖譜：通過遺傳重組分析，將基因或形態(tài)、生理和生化等常規(guī)標記在染色體上線性排列；標記數量少，圖距大，飽和度低，應用價值有限。分子標記遺傳圖譜：構

13、建原理同上，利用DNA分子標記作圖，高密度圖譜。已構建擬南芥、水稻、小麥、玉米、大豆等高密度分子遺傳圖譜，極大地促進了基因定位與克隆、物理圖譜的構建和分子標記輔助選擇育種等。2. 基因定位與克隆2.1 基因定位質量性狀基因定位：常用近等基因系 (NIL，near isogenic lines )分析法和分離集團混合分析法 (BSA，Bulked segregation anlysis)。近等基因系：是指兩個或多個形態(tài)上相似，遺傳背景相同或相近，只在個別染色體區(qū)段上存在差異的遺傳材料，通過雜交和回交獲得。數量性狀基因座（QTL，quantitative trait loci ）定位：實質上是確定

14、數量性狀位點基因與分子標記間的連鎖關系，QTL作圖。定位方法：1）單一標記定位法（single marker analysis）：利用某個標記與某個QTL的連鎖關系，雜交后代出現兩者之間的同分離現象，標記的不同基因型在數量性狀的分布、均值和方差上存在差異，檢驗差異確定是否與QTL連鎖2）區(qū)間定位法（interval mapping ，IM）： 利用染色體上一個QTL兩側的一對標記，建立個體數量性狀測量值對雙側標記基因型指示變量的線性回歸關系，根據回歸關系是否顯著確定QTL的存在，位置和效應。通過上述方法，篩選與目標基因緊密連鎖的分子標記，進行快速基因定位。2. 2 基因圖位克隆首先鑒定與目的基

15、因緊密連鎖的分子標記（通常要求在1cM之內），然后由這些標記去篩選大片段DNA文庫(YACs或BACs)，鑒定出與標記有關的克隆，繼之以亞克隆和染色體步查等獲得含目的基因的克隆，再輔之以轉化和互補測驗加以確證。（見前面第7章內容）圖位克隆的基本流程：1）構建遺傳圖譜：目的基因初步定位分子標記；2）構建物理圖譜：局部區(qū)域的精細作圖，目的基因精細定位 (kb/cM)；3）構建基因組文庫：BAC、YAC、Cosmid等；4）染色體步行或登陸：獲得候選克隆 探針；5）篩選基因文庫：獲得目的克??；6）鑒定目的基因。3. 遺傳多樣性與親緣關系研究遺傳多樣性: 主要指種內不同居群之間或同一居群不同個體之間的遺傳變異的總和。在植物種質資源的遺傳多樣性與起源演化研究中，根據不同類型資源間DNA片段的差異，計算出遺傳距離或相似系數，構建系譜關系聚類圖，揭示親緣關系。4. 比較基因組研究比較基因組學：主要是利用近緣物種間的同源分子標記，在相關物種間進行遺傳或物理作圖，比較這些標記在不同物種基因組中的分布特點，揭示染色體上基因及其排列順序的相同（共線性）或相似性（同線性），從而對基因組結構和起源等進行進化分析。例如，水稻、小麥、玉米等存在高度保守的基因組同線性（序列、拷貝數、順序）。 5. 分子標記輔助選擇分子標記輔助選擇（MAS）：將分子標記應用于雜交育種后代的選擇，即選