保鮮實驗方案

1、保鮮實驗第一部分 營養(yǎng)指標的測定1一般物理性狀測定1.1果徑 隨機取10個果實，用游標卡尺測定其縱、橫徑，最后取其平均值。1.2果重 隨機取10個果實，用電子天平測定其果重，最后取其平均值。1.3 可食率 隨機取10個果實稱重m，去除果肉后，再用電子天平精確稱量核重m1，可食率/%=（m-m1）/m×100% 1.4含水量 取稱量瓶，放入烘箱中以100-105烘干（至恒重），置干燥器中冷卻，稱重m0。稱取2g果實，精確質量m。將果實和稱量瓶放入烘箱中，于100-105烘2h。取出置于干燥器中冷卻后稱重m1。放回烘箱繼續(xù)烘0.5 h，冷卻稱重m2，直至兩次重量差不超過3mg為止。計算：

2、含水量/%=（m+ m0- m2）/ m×100% 1.5 可溶性固形物(TSS)阿貝折射儀 先用蒸餾水校正，取一滴汁液，用阿貝折光儀觀察、讀數，重復10次。2 營養(yǎng)品質的測定2.1 蛋白質含量的測定考馬斯亮藍法2.1.1原理 考馬斯亮藍G-250測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種?？捡R斯亮藍G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，當它與蛋白質結合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質-色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右的時間內達到平衡，完成反應十分迅速；其結合物在室溫下1h內保持穩(wěn)定。2.1.2 試劑配制：100gmL標準蛋白質溶液的配制：稱取10mg牛血清

3、白蛋白，用蒸餾水溶解并定容至100mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。考馬斯亮藍G250溶液：稱取100mg考馬斯亮藍G-250，溶于50mL 90乙醇中，加入85的磷酸100mL，最后用蒸餾水定容到1 000mL，于4保存。（考馬斯亮藍稱完后先加磷酸，然后用95%的酒精潤洗量取磷酸的量桶，再用蒸餾水洗磷酸和酒精的量桶，最后用磁力攪拌器攪拌后定容。）2.1.3標準曲線的繪制：取5支具塞試管，按表1數據配制后蓋塞，混勻反轉混合數次，30 min后在595nm下比色。以蛋白質濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標繪制標準曲線。表1 管號蛋白質標準液（mL)蒸餾水（mL)蛋白質含量（g）考馬斯亮藍G250溶液（mL）102.0

4、0420.51.525431.01.050441.50.575452.0010042.1.4樣品提取液測定：取1g果肉，研磨后用4層紗布過濾，定容到25mL。吸取2mL樣品提取液，放入具塞試管中加入4mL考馬斯亮藍G250溶液，充分混合，放置30 min后在595nm下比色，記錄吸光值，并根據線性方程式計算。2.2 有機酸的測定酸堿滴定法 2.2.1試劑配制0.1mol/LNaOH溶液配制：4gNaOH用蒸餾水溶解定容至1000mL。1%酚酞指示劑：稱取1g酚酞，用95%溶解定容至100mL。2.2.2 操作 稱取5g果肉研磨成勻漿，用少量蒸餾水將勻漿移入錐形瓶中， 7580水浴加熱0.5h，

5、期間搖動數次，冷卻后用4層紗布過濾，用蒸餾水定容至50mL。取濾液10mL于錐形瓶中，加入2滴1%酚酞指示劑。用0.1mol/LNaOH標準溶液滴定至淡粉色，持續(xù)30s不退色，記下NaOH溶液的體積。平行3次，取其平均值V。計算：有機酸/%= （V×C×192×50）/（m×10000） （3） 式中：V為樣品消耗NaOH溶液滴定的體積（mL）；C為NaOH溶液的濃度（mol/L）；m為楊梅果肉的質量（g）。192為檸檬酸的換算系數2.3 VC含量的測定2,6-二氯酚靛酚滴定法2.3.1試劑配制2%草酸溶液的配制: 準確稱取草酸10g，用蒸餾水定容至50

6、0mL。標準抗壞血酸溶液（0.2mg/mL）的配制:準確稱取20mg純抗壞血酸，溶于2%草酸溶液中，并定容至100mL，貯于棕色瓶中，冷藏，現(xiàn)配現(xiàn)用。2,6-二氯酚靛酚溶液的配制: 準確稱取50mg 2,6-二氯酚靛酚溶于50mL的熱水中，冷卻后加水定容至250mL，貯于棕色瓶中冷藏（4），約可保存一周。每次使用之前，以標準抗壞血酸溶液標定。2.3.2實驗步驟1) 2,6-二氯酚靛酚溶液的標定：準確吸取標準抗壞血酸溶液5mL置于錐形瓶中，加入5mL2%草酸，以2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至淡紅色，并保持30s不褪色，即達到滴定終點（平行三次）。由所用染料的體積計算出1mL染料相當于多少毫克抗壞血

7、酸。準確吸取10mL 2%草酸作空白對照，按上述方法滴定。2) 樣品提取：稱取5g果肉于研缽中，加入20mL 2%草酸，研磨成勻漿。用四層紗布過濾，紗布可用少量2%草酸洗滌幾次，取其濾液，并定容至50mL。3) 樣品滴定：準確吸取濾液三份，每份10mL，分別放入3個錐形瓶內，滴定方法同上。計算：1mL染料樣相當于維生素C的量(mg/mL) T=C×V0V1-V2式中：c為抗壞血酸的濃度（0.2mg/mL）； V0為抗壞血酸的體積（5ml）； V1為滴定抗壞血酸所用染料的體積（mL）； V2為空白滴定所用染料的體積（mL）；式中：VA為滴定樣品所耗用的染料的平均毫升數； VB為滴定空白

8、對照所耗用的染料的平均毫升數； C為樣品提取液的總毫升數；D為滴定時所取的樣品提取液毫升數；T為1mL染料樣相當于維生素C的量（mg/mL）；W為待測樣品的重量（g）。第二部分 生理指標測定1 感官指標 記錄果實貯藏期間的外觀品質：包括果皮顏色、硬度、和腐爛率，好果率和失重率統(tǒng)計1.1好果率的測定好果率=(好果數/檢查總果數)×100%。（注意：當爛斑面積大于1 cm2時，則認定該果實為腐爛果。）1.2硬度（硬度儀）：人工：4.15.0為較硬，3.14.0為硬，2.13.0為軟，1.12.0為較軟，01為很軟。1.3失重率的測定：貯藏前稱取果實重量m0，貯藏期間每次取固定的果實稱重m

9、1，失重克數即為m0-m1；失重率=(m0-m1) /m0×100%。2質膜相對透性的測定 取果實5g，切碎稱重m，放入燒杯中，加蒸餾水50mL，用電導率儀測定其電導值（L0），浸提10min再測電導值（L1），再將燒杯放置電爐上煮沸，冷卻后測電導值（L2）.質膜相對透性(%)=( L1-L0)×100/(L2×m)。平行3次，最后求出平均值。2丙二醛（MDA）含量測定2.1 原理 丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的最終分解產物，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。丙二醛(MDA)是常用的膜脂過氧化指標，在酸性和高溫度條件下，可以與硫代巴比妥酸(TBA)反應生成紅棕

10、色的三甲川(3，5，5三甲基惡唑-2，4。二酮)，其最大吸收波長在532nm。但是測定植物組織中MDA時受多種物質的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與TBA顯色反應產物的最大吸收波長在450nm，但532nm處也有吸收，因此測定植物組織中MDATBA反應物質含量時一定要排除可溶性糖的干擾。 2.2 試劑配制10%TCA（三氯乙酸）：50gTCA定容至500mL。（有腐蝕性）0.6% TBA（硫代巴比妥酸）：稱取0.6gTBA，用0.1mol/LNaOH溶解，再用在10%TCA定容至100mL。2.3操作 稱取果肉1g，加入2 mL l0% TCA(三氯乙酸)和少量石英砂，研磨至勻漿，再加8 m

11、L TCA進一步研磨，用4層紗布過濾。吸取濾液3mL（對照加2mL蒸餾水），加入3mL 0.6% TBA溶液，混勻于沸水浴上反應15 min，迅速冷卻后再離心4000r/min 10min。取上清液測定532、600和450nm波長下的吸光度。計算：MDA濃度C(mol/L )=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450，MDA含量（mol/g）= MDA濃度C(mol/L )×提取液體積(mL)/樣品鮮重(g)3呼吸強度的測定：將紅外二氧化碳分析儀的接口插入密閉容器的通氣口，形成閉路循環(huán)，當儀器數字顯示穩(wěn)定時、時，記錄容器內CO2含量C0(%)，取果實5個，稱重，置密閉

12、容器中平衡1h，用紅外二氧化碳分析儀測定密閉容器中CO2含量C（%）(讀取儀器顯示數字的最大值），根據測定結果計算其呼吸強度，結果以mg/（kg·h）表示。 (C- C0)×V×d×1000 樣品呼吸速率（CO2 mg/kg·h) W×T 式中：C：果實呼吸后呼吸室中CO2濃度(%)；d：常溫條件下的CO2的密度(g/cm3)；C0：未置果實時呼吸室中CO2濃度(%)；W：果實的重量(kg)；V：呼吸室的體積(cm3)；T：果實呼吸時間(h)。2酶活性測定2.1苯丙氨酸解氨酶（PAL）2.1.1 原理 苯丙氨酸解氨酶（phenylal

13、anineammonialyase，PAL）催化苯丙氨酸的脫氨反應，使NH3釋放出來形成反式肉桂酸。此酶的在植物體內次生物質（如木質素等）代謝中起重要作用。根據其產物，反式肉桂酸在290nm處吸光度的變化可以測定該酶的活性2.1.2 試劑配制0.1mol/L pH9.0硼酸緩沖液: 6.18g硼酸，加950mL H2O溶解，然后用1.0 mol/L NaOH調PH至9.0，補加H2O至1000mL即可使用。0.02mol/L苯丙氨酸溶液：稱取0.3304gL-苯丙氨酸溶于100ml 0.1mol/L硼酸緩沖液中，pH9.0。2.1.3操作 稱取果肉5g，加0.1g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、少許

14、石英砂，冰浴研磨成勻漿。加入5mL pH9.0硼酸緩沖液，4，12000r/min離心5min，上清液為酶粗提取液。取1mL酶粗提取液，加2mL 0.02mol/L苯丙氨酸溶液，加入2mL pH9.0硼酸緩沖液，室溫反應30min，加入50L濃鹽酸終止反應。每隔1min測定290nm處吸光值，共測4min。以吸光值變化0.01為1個酶活力單位U，酶活力表示為U/（min·g）。樣品PAL活性U/(min*g）=(A*Vt)/(0.01V1*t*m)=（25*A）/（0.3*m）U:吸光值變化0.01為一個酶活力單位Vt：酶提取液總體積（ml）V1:測定時用酶提取液體積（ml）t:反應

15、時間（min）m:樣品質量（g）2.2過氧化物酶(POD) 稱取果肉5g，加0.1g PVP、少許石英砂，冰浴研磨成勻漿。加入5mL pH6.0磷酸緩沖液，4，12000r/min離心5min，上清液為酶粗提取液。取1mL酶粗提取液，加入4mL反應液（pH 6.0磷酸緩沖液50mL，體積分數30%過氧化氫28L，愈創(chuàng)木酚19L），室溫反應30min，加入50L濃鹽酸終止反應。每隔1min測定470nm處吸光值，共測4min，以吸光值變化0.01為1個酶活力單位U，酶活力表示為U/（min·g）。樣品POD活性U/(min*g）=(A*Vt)/(0.01V1*t*m)=（25*A）/（

16、0.3*m）U:吸光值變化0.01為一個酶活力單位Vt：酶提取液總體積（ml）V1:測定時用酶提取液體積（ml）t:反應時間（min）m:樣品質量（g）2.2.1原理 POD是植物體內普遍存在的、活性較高的一種氧化還原酶，它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等生理過程和生化代謝過程都有密切關系，在果蔬生長發(fā)育、成熟衰老、病原菌感染、貯藏加工條件改變時，其活性不斷發(fā)生變化。 在有過氧化氫存在下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質，該物質在470 nm 處有最大吸收，可用分光光度計測量 470 nm 的吸光度變化測定過氧化物酶活性。 2.2.2試劑配制 1、1/15 M、pH 6.0 磷酸

17、緩沖液（提取緩沖液）： A液：1/15 M Na2HPO4溶液，取2.3876 g Na2HPO4 溶解定容于100mL； B液：1/15 M NaH2PO4溶液，取20.801 g NaH2PO4溶解定容于1000mL； 取 A液100mL 與 B 液900mL搖勻混合。 2、0.1mmol/L、pH 5.5 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液： A液：0.2M 醋酸溶液：量取 11.55mL 冰醋酸，加蒸餾水稀釋至 1000mL； B液： 0.2M 醋酸鈉溶液：稱取16.4g 無水醋酸鈉（或27.2 g 三水合醋酸鈉），加蒸餾水溶解后定容至 1000mL； 取68 mL A液與 432 mL B液混合，

18、調節(jié)pH至5.5，加蒸餾水稀釋至1000mL。 3、0.08 H2O2溶液： 取 30過氧化氫 2.67ml 稀釋到 100ml 混勻后即成母液，可放置于冰箱內保存3 天，臨用時再從母液取 10ml 稀釋到100ml 即為工作液； 4、 0.1 鄰甲氧基酚溶液（愈創(chuàng)木酚）：取 0.1g 鄰甲氧基酚溶于100ml 蒸餾水中；或配制 25mmol/L 愈創(chuàng)木酚溶液：取 320 微升愈創(chuàng)木酚，用 pH 5.0 醋酸緩沖溶液稀釋至100mL。 2.2.4操作 粗酶液提取：取樣品 1 克，加入適量 pH 6.0 磷酸緩沖液研磨成勻漿，轉入25ml 容量瓶，用 pH 6.0 磷酸緩沖液定容至刻度，混勻，用

19、 4 層紗布過濾，濾液裝入離心管中，于 4，8000rpm 離心 10min，收集上清即得粗酶液，冷藏保存。 酶活測量：把1ml pH 5.0 醋酸緩沖溶液、 1ml 粗酶液 （如酶活性過高可稀釋） 、1ml 0.1鄰甲氧基酚溶液加入到 10ml具塞刻度試管中，混勻，置于 30 水浴中 5 分鐘左右，使其溫度達到平衡，加入 1ml 0.08H2O2溶液，加入時立即開始計時，搖勻并迅速倒入比色皿于470nm比色，在反應1min時記錄 OD 值。 參比液用1ml水代替0.08H2O2。 POD酶活性表示方式：以 OD 值直接表示其相對活性，單位為 OD470nm/min gFW 。 注意：加入過氧

20、化氫后要迅速比色，如不能在 1min時讀數，可采用下列方式：在反應混合液中加入過氧化氫后后，立即開啟秒表記錄時間，于分光光度計上測量波長 470 nm 下的吸光度值，每隔 1min 讀數一次，共記錄4min。 以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，即以 O.D 470nm/min gFW表示之。 也可以用每 min 內O.D 470變化0.01 為1 個過氧化物酶活性單位（u）表示。 過氧化物酶活性 u/g.min=OD470×VT W× Vs×0.01× t 式中： OD470反應時間內吸光度的變化。 W 樣品重，g。 VT 提取酶液總體積， mL。 V

21、s 測定時取用酶液體積, mL。 t 反應時間，min2.3多酚氧化酶PPO稱取果肉5g，加0.1g PVP、少許石英砂，冰浴研磨成勻漿。加入5mL pH6.8磷酸緩沖液，4，12000r/min離心5min，上清液即為酶粗提取液。取2mL pH6.8磷酸緩沖液、2mL的0.10mol/L兒茶酚溶液、1mL酶粗提液，室溫反應30min，加入50L濃鹽酸終止反應。每隔1min測定420nm處吸光值，共測4min，以吸光值變化0.01為1個酶活力單位U，酶活力表示為U/（min·g）。樣品PPO活性U/(min*g）=(A*Vt)/(0.01V1*t*m)=（25*A）/（0.3*m）U

22、:吸光值變化0.01為一個酶活力單位Vt：酶提取液總體積（ml）V1:測定時用酶提取液體積（ml）t:反應時間（min）m:樣品質量（g）2.3.1原理 多酚氧化酶是一種含酮的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化為醌，醌有顏色，可用分光光度計測量其吸光度變化測定多酚氧化酶活性，本實驗以鄰苯二酚為底物，其氧化產物在 420nm 具有最大光吸收。 2.3.2試劑配制pH6.0 磷酸緩沖液：同過氧化物酶活性測定中的配制方法。 0.2%鄰苯二酚：稱取 0.2g 鄰苯二酚，溶于磷酸緩沖液，稀釋到 100ml，裝于棕色瓶，冷藏，備用。 2.3.3操作2.3.3.1酶液的制備 取果蔬樣品5g（視樣品酶活性而定），

23、用預冷的 pH6.0 磷酸緩沖液研磨，并定容 25ml，4 層紗布過濾，濾液離心（5000r/min、10min、4） ，上清即為粗酶液，5下保存，24 小時內分析完畢。 2.3.3.2PPO 酶活測定 將 4ml 0.2%鄰苯二酚加入 10ml 具塞刻度試管中，在 30水浴平衡 10 分鐘，加入 1ml 粗酶液計時并搖勻，立即于 420nm 波長處比色，在反應 15s 時開始記錄 OD 值，作為初始值，然后每隔 1min 記錄一次，連續(xù)測定，至少獲取 6個點的數據。（重復 3 次取平均值） 參比液用1ml 蒸餾水代替酶液。 記錄吸光值，制作 OD420隨時間變化曲線，根據曲線的初始線性部分（

24、從時間I 到時間F）計算每分鐘吸光度變化值OD420。 OD420= （OD420F- OD420I）/（tF -tI） 式中 OD420每分鐘反應混合液吸光度變化值； OD420F反應混合液吸光度終止值； O.D420I反應混合液吸光度初始值； tF 反應終止時間，min； tI 反應初始時間，min。 以每克果蔬樣品每分鐘吸光度變化值增加 1 為 1 個活性單位，單位是OD420/min.g.計算公式： U=(OD420×V )/ (Vs×m) 式中 V樣品提取液總體積，mL； Vs測定時所取樣品提取液的體積，mL； m樣品質量，g。 2.4過氧化氫酶CAT測定2.4.1 原理 H2O2在 240nm 波長下有強吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反