流感診斷Microsoft Word 文檔 (3)

1、流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則編輯詞條流行性感冒(簡稱流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，主要通過空氣飛沫傳播。流感病毒有甲、乙、丙三個型，其中甲型所引起的流感流行最為廣泛和嚴(yán)重，乙型常引起爆發(fā)，丙型則多引起小兒散發(fā)病型。在我國雖將該病歸屬于法定丙類傳染病，但一旦流行，傳播快、波及面廣，對人民健康及勞動生產(chǎn)力有很大影響，而且對年老體弱多病者及嬰幼兒的威脅較大。為貫徹執(zhí)行中華人民共和國傳染病防治法及中華人民共和國傳染病防治法實(shí)施辦法，特制定本標(biāo)準(zhǔn)。目錄1 簡介2 病原學(xué)診斷方法3 血清學(xué)診斷方法4 流感快速診斷方法1 簡介2 病原學(xué)

2、診斷方法3 血清學(xué)診斷方法4 流感快速診斷方法1 簡介編輯本段本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國衛(wèi)生部提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陶三菊。本標(biāo)準(zhǔn)由衛(wèi)生部委托技術(shù)歸口單位衛(wèi)生部傳染病防治監(jiān)督管理辦公室負(fù)責(zé)解釋。1, 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了流感的診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各級各類醫(yī)療、衛(wèi)生、保健機(jī)構(gòu)和人員對流感的診斷、報(bào)告和處理的應(yīng)用。2 ,診斷原則流感流行時一般根據(jù)臨床癥狀、結(jié)合流行病學(xué)可對病人作出初步診斷。如確定診斷則需要分離病毒陽性或病人雙份血清抗體，測定恢復(fù)期抗體較急性期增高4倍或以上。3 ,診斷標(biāo)準(zhǔn)3.1 ,流行病學(xué)史在流行季

3、節(jié)一個單位或地區(qū)同時出現(xiàn)大量上呼吸道感染病人；或近期內(nèi)本地區(qū)或鄰近地區(qū)上呼吸道感染病人明顯增多；或醫(yī)院門診上呼吸道感染病人明顯增多。 3.2 ,臨床癥狀3.2.1 ,出現(xiàn)急起畏寒、高熱、頭痛、頭暈、全身酸痛、乏力等中毒癥狀。3.2.2 ,可伴有咽痛、干咳、流鼻涕、流淚等呼吸道癥狀。3.2.3 ,少數(shù)病例有食欲減退，伴有腹痛、腹脹、嘔吐和腹瀉等消化道癥狀。3.3 ,實(shí)驗(yàn)室診斷3.3.1 ,血液化驗(yàn)檢查白細(xì)胞總數(shù)不高或偏低。3.3.2 ,從病人鼻咽分泌物分離到流感病毒(見附錄A)。3.3.3 ,恢復(fù)期病人血清中抗流感病毒抗體滴度比急性期有4倍或4倍以上升高(見附錄B)。3.3.4 ,直接

4、檢查呼吸道上皮細(xì)胞的流感病毒抗原陽性(見附錄C中C1)。3.3.5 ,標(biāo)本經(jīng)敏感細(xì)胞增殖1代后查抗原陽性(見附錄C中C2)。3.4 ,病例分類3.4.1 ,疑似病例具備3.1加3.2或3.1加3.2加3.3.1。3.4.2 ,確診病例疑似病例加3.3.2或3.3.3或3.3.4或3.3.5。4 , 處理原則4.1 ,早期隔離病人、對癥治療病人和防治合并癥早期發(fā)現(xiàn)病人、早期隔離病人是最重要的措施。對病人治療一般采用對癥治療。防治并發(fā)癥主要應(yīng)防止流感病毒性肺炎和細(xì)菌性肺炎，特別是對年老體弱者或伴有心血管、慢性呼吸道疾病者或嬰幼兒，流感本身或其合并癥可能引起死亡，應(yīng)特別注意加強(qiáng)治療護(hù)理。 

5、4.2 ,預(yù)防措施一般采用綜合性預(yù)防措施，講究衛(wèi)生，注意體格鍛煉和營養(yǎng)，保持室內(nèi)空氣流通；對易感人群應(yīng)采取相對隔離措施，如避免接觸病人，不去公共場所等；對年老體弱者必要時可采用滅活疫苗接種或服用金剛烷胺等預(yù)防方法(但須注意金剛烷胺僅對防治甲型流感有效)。2 病原學(xué)診斷方法編輯本段A1 病毒分離從疑似流感病人呼吸道采集標(biāo)本分離病原體。A2 標(biāo)本的收集和處理A2.1 標(biāo)本收集時間應(yīng)于發(fā)病早期(13d內(nèi))越早越好。 A2.2 標(biāo)本收集方法常用棉拭子擦抹法或咽喉漱洗法。棉拭子擦抹法用于采集兒童標(biāo)本，采集時將滅菌棉拭子稍沾標(biāo)本收集液(pH7.27.6含20%40%滅菌肉湯的生理鹽水或

6、Hanks液或生理鹽水)，反復(fù)擦拭患者咽部數(shù)次，然后將此棉拭子放進(jìn)裝有上述收集液的試管中塞上棉塞。咽喉洗漱法用于采集成人標(biāo)本，采集時先讓患者咳嗽，然后用10mL左右的收集液反復(fù)洗漱咽喉部約1min，吐入管內(nèi)。如有條件，兒童標(biāo)本用負(fù)壓抽吸法抽取鼻咽分泌物，成人標(biāo)本用鼻咽洗液，可提高分離的陽性率。標(biāo)本采集后置冰壺(4)中盡快送實(shí)驗(yàn)室。A2.3 標(biāo)本的處理：用毛細(xì)吸管反復(fù)吹打標(biāo)本液(如為咽拭子標(biāo)本，先反復(fù)擠壓咽拭子后棄之)，將粘液打散，于4靜置510min，待自然沉淀后取3mL上清，按每毫升加青霉素1000單位和鏈霉素1000g，混勻置4處理24h即可接種。如標(biāo)本污染較重，可置4過夜處理。如預(yù)計(jì)標(biāo)本

7、在48h內(nèi)不能完成接種時，應(yīng)將標(biāo)本置低溫(最好-70)保存。A3 接種及培養(yǎng)法最常用雞胚培養(yǎng)法和組織培養(yǎng)法，有條件的亦可同時用兩種方法進(jìn)行病毒分離。A3.1 雞胚培養(yǎng)法：取911日齡雞胚，將處理過的標(biāo)本液經(jīng)羊膜腔和尿囊腔各接種0.2mL，每份標(biāo)本接種34只胚，置3335溫箱培養(yǎng)3d，然后將雞胚放置4冰箱過夜(或置20冰箱1h再置4數(shù)小時)可分別收獲尿液和羊水，并作初步血凝(其方法是用毛細(xì)吸管取12滴尿液或羊水，置大孔塑料板內(nèi)，再加入12滴1%雞紅細(xì)胞，搖勻后置室溫或43045min觀察結(jié)果，根據(jù)血球凝集程度的不同可分為+、+、+、+、±、)，如血凝為+時，再按系列倍比稀釋測定其血凝滴

8、度，如具有一定血凝滴度即可鑒定。如血凝陰性，可盲傳2代，如仍為陰性則棄之。A3.2 組織培養(yǎng)法：用0.2mL處理過的標(biāo)本液接種于長成單層的原代人胚腎(或猴腎或地鼠腎)，或狗腎傳代細(xì)胞(Madin Darby Canine Kidney，MDCK)，每份標(biāo)本接種4管，置37吸附12h后棄標(biāo)本液，再加入每毫升含2g胰酶的199維持液1mL，于33培養(yǎng)710d，并逐日觀察病變。從第三天開始每隔一天用0.4%雞或豚鼠紅細(xì)胞對培養(yǎng)管做紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)(試驗(yàn)前無菌法收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液)，如陰性則用已收獲的上清液盲目傳代，如陽性則測定上清液的血凝滴度。如標(biāo)本第1代紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)陰性，可用收獲的全部上清液混合進(jìn)

9、行盲傳2代，仍為陰性則棄之。A4 新分離株的鑒定新分離流感病毒可用血凝抑制、補(bǔ)體結(jié)合、中和以及血細(xì)胞吸附抑制等試驗(yàn)方法進(jìn)行鑒定。最常用和最簡單的方法是血凝抑制試驗(yàn)，必要時采用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)。A4.1 血凝抑制試驗(yàn)：用當(dāng)前流行的甲3、甲1及乙型流感病毒代表株的免疫血清與新分離流感病毒做血凝抑制試驗(yàn)，觀察新分離株能否被免疫血清所抑制。血凝抑制試驗(yàn)方法見附錄B。A4.2 紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)：取紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)陽性的組織培養(yǎng)管和正常細(xì)胞對照管，用Hanks液洗細(xì)胞2次，加入經(jīng)霍亂濾液(RDE)處理(110)的免疫血清0.2mL，再加入Hanks0.6mL，室溫作用30min后，再加入0.4%雞(或豚鼠)紅

10、細(xì)胞0.2mL，置室溫30min后于普通光學(xué)顯微鏡下觀察有無血球吸附。如果血細(xì)胞吸附被所用免疫血清所抑制，表明所分離的病毒與所用免疫血清型別相一致或接近。A4.3 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)：如果用已知的甲型(甲3、甲1)或乙型或丙型流感病毒免疫血清對新分離病毒的血凝均不能抑制，則應(yīng)考慮可能為甲型流感病毒的新亞型，可用針對甲型、乙型流感病毒核蛋白的免疫血清作補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)定型。3 血清學(xué)診斷方法編輯本段B1 血凝抑制試驗(yàn)方法B1.1 原理一些動物紅細(xì)胞(如雞、豚鼠等)以及人“O”型血紅細(xì)胞上有流感病毒受體，遇流感病毒可產(chǎn)生紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，簡稱血凝。若將特異性抗體與流感病毒(血凝素)預(yù)先作用后再加入紅

11、細(xì)胞則不產(chǎn)生凝集，稱為血凝抑制現(xiàn)象。用定量血凝素與不同稀釋度血清抗體作用后，能完全抑制血凝的最高稀釋度，即為血凝抑制抗體效價(jià)。 B1.2 主要材料大孔塑料板，1mL吸管或1mL移液器。B1.3 雙份血清收集及處理急性期血清于發(fā)病3d內(nèi)采取，恢復(fù)期血清于發(fā)病后24周采取。取0.1mL已分離的血清加入0.9(或0.4)mL霍亂濾液(RDE)(即110或15稀釋)搖勻，于37水浴中過夜，以去除血清中的非特異性抑制素，次日置56水浴50min以滅活多余的RDE。B1.4 流感病毒血凝素制備流感病毒接種雞胚后48h收獲的尿囊液，加入1/10000硫柳汞防腐。為了延遲尿鹽沉淀可先用無菌生理鹽水做

12、等量稀釋，置4備用。B1.5 雞紅細(xì)胞懸液的制備從靜脈或心臟抽取正常健康雞血，保存于阿氏(Alsevr's)液中，置4保存。用前以生理鹽水洗3次，末次經(jīng)2000r/min離心10min，將紅細(xì)胞用生理鹽水配成1%濃度。B1.6 血凝素滴定將流感病毒血凝素在大孔塑料板內(nèi)用生理鹽水從15開始做系列倍比稀釋，每孔0.25mL再加入等量1%雞紅細(xì)胞，搖勻，置室溫或43045min后觀察結(jié)果，以出現(xiàn)十十血凝的血凝素最高稀釋度為其血凝效價(jià)，即為1個血凝單位，實(shí)驗(yàn)時采用4個血凝素單位，例如血凝素效價(jià)為1320，為1個單位，4個單位即為180稀釋。正式實(shí)驗(yàn)前經(jīng)校對取4個血凝單位用于實(shí)驗(yàn)。B1.7 血凝

13、抑制試驗(yàn)步驟B1.7.1 將上述已處理的待檢血清(110或15)再用生理鹽水做系列倍比稀釋，每孔加0.25mL。B1.7.2 加入等量已配好的4個單位血凝素。B1.7.3 每孔加入0.25mL 1%雞紅細(xì)胞，搖勻置室溫或43045min。B1.8 結(jié)果觀察觀察結(jié)果時將血凝板傾斜數(shù)十秒鐘，待陰性孔內(nèi)紅細(xì)胞自由下滑呈淚滴狀時讀結(jié)果。以出現(xiàn)完全抑制的血清最高稀釋度的倒數(shù)為抗體的效價(jià)。在檢測患者雙份血清時需在同一次試驗(yàn)中進(jìn)行，并以恢復(fù)期血清抗體效價(jià)較急性期抗體效價(jià)升高4倍或4倍以上為陽性。B2 型特異性補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)B2.1 原理甲、乙、丙三個型流感病毒各具有特異的可溶性抗原(核蛋白抗原)，甲型流感病毒

14、各亞型均具有相同的可溶性抗原，與乙型或丙型的可溶性抗原完全不同，因此可利用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)來區(qū)別它們。當(dāng)流感病毒出現(xiàn)很大的變異或出現(xiàn)新亞型而引起大流行時，由于來不及充分掌握新分離毒株的性狀，常需同時采用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)對新毒株進(jìn)行血清學(xué)診斷。 B2.2 型特異免疫血清制備B2.2.1 免疫用抗原甲型為PR8株和乙型為Lee株均為小鼠適應(yīng)株。于乙醚麻醉下鼻腔感染1216g小鼠，每鼠0.05mL，待感染后35d大部分小鼠發(fā)病、部分死亡時，解剖小鼠。取肺研磨并用生理鹽水制成10%的懸液，低速離心去除粗塊，取上清鼠肺懸液即為免疫用抗原。B2.2.2 免疫血清制備選體重300500g的健

15、康豚鼠，免前采血35mL，分離血清分裝凍存留作對照。豚鼠用乙醚輕度麻醉，鼻腔滴入上述鼠肺懸液抗原0.5mL，共免疫34次，每次間隔一周，在末次免疫的同時，由腹腔注射鼠肺懸液2mL，一周后試血，如果對同型尿膜抗原的血清效價(jià)超過180，而與異型抗原無交叉反應(yīng)，立即采血分離血清分裝凍存于低溫(-20以下)。試驗(yàn)前血清于56水浴滅活30min。B2.3 可溶性抗原的制備用甲、乙型流感病毒或新分離病毒按常規(guī)接種和收獲尿囊液，如尿液血凝在140以上時，收獲其尿囊膜，將尿囊膜用鹽水洗一次，用無菌剪刀將膜剪成數(shù)小塊放入試管中，每個雞胚的尿囊膜加1mL無菌生理鹽水，凍化三次，末次化后以3000r/min離心15

16、min，吸出上清即為可溶性抗原，加入110000的硫柳汞防腐，置4冰箱至少可用一個月。B2.4 雙份血清采集收集病人急性期(發(fā)病3d內(nèi))和恢復(fù)期(發(fā)病1030d后)的血清。血清于試驗(yàn)前5630min滅活。B2.5 1%綿羊紅細(xì)胞懸液制備、溶血素、補(bǔ)體的制備和滴定按常規(guī)方法。B2.6 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)步驟按常規(guī)進(jìn)行。B2.7 結(jié)果判定B2.7.1 被檢病毒尿膜抗原與甲型(或乙型)流感病毒免疫血清呈陽性反應(yīng)則可診斷為甲型(或乙型)流感病毒，如甲、乙均為陰性時，應(yīng)考慮丙型流感病毒或其他病毒。B2.7.2 雙份血清對甲型(或乙型)抗原有4倍或4倍以上升高，即可診斷為甲型(或乙型)流感病毒感染。B2.7.3

17、 正常人群補(bǔ)體結(jié)合抗體滴度一般在116以下，如單份恢復(fù)期血清抗體在132以上時，結(jié)合臨床癥狀可作診斷的參考。B2.7.4 人群血清抗體水平調(diào)查中，補(bǔ)體結(jié)合抗體在132以上者可作為新近感染流感的證據(jù)。B3 神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)B3.1 原理胎球蛋白(Fetuin)底物經(jīng)流感病毒的神經(jīng)氨酸酶作用后，使N乙酰神經(jīng)氨酸游離出來，經(jīng)過碘酸鹽的氧化作用將N乙酰神經(jīng)氨酸轉(zhuǎn)化為甲醛內(nèi)酮酸，后者經(jīng)硫代巴比妥酸作用形成生色團(tuán)，用有機(jī)溶劑提取生色團(tuán)，并在分光光度計(jì)上比色。利用上述反應(yīng)可測知流感病毒的神經(jīng)氨酸酶活性，反應(yīng)的顏色越深酶活性越強(qiáng)。并可選擇用于神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)劑量。神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)是將標(biāo)化好劑量的神

18、經(jīng)氨酸酶(即一定稀釋度的流感病毒尿囊液)和系列稀釋的被檢血清和正常血清起孵育，測知血清作用于神經(jīng)氨酸酶活性的抑制效價(jià)，并計(jì)算出血清的神經(jīng)氨酸酶抑制滴度。B3.2 器材及試劑B3.2.1 小試管、10mL吸管及分光光度計(jì)等。B3.2.2 磷酸緩沖液(PBS pH5.9)及生理鹽水。B3.2.3 胎球蛋白底物液：450500mg冰凍干燥的胎球蛋白加蒸餾水10mL，溶解后置4保存，每周新配。B3.2.4 過碘酸鈉溶液：稱4.8g過碘酸鈉(NaIO(下標(biāo)始)4(下標(biāo)終)溶于38mL蒸餾水中，加62mL正磷酸(濃)，充分混合，置于棕色磨口瓶中，室溫保存。B3.2.5 砷試劑：稱10g砷酸鈉(NaAsO(

19、下標(biāo)始)2(下標(biāo)終)和7.1g無水硫酸鈉溶于100mL蒸餾水中，加0.3mL濃硫酸，置于帶玻璃塞的瓶中，置4保存。B3.2.6 硫代巴比妥酸試劑：稱1.2g硫代巴比妥酸和14.2g無水硫酸鈉加入200mL蒸餾水中，在煮沸的水浴中加熱溶解，每周新配。B3.2.7 酸化丁醇試劑：于100mL正丁醇中加入5mL濃鹽酸，置棕色帶玻璃塞的瓶中，室溫保存。B3.3 神經(jīng)氨酸酶活性測定B3.3.1 病毒用生理鹽水做系列倍比稀釋(12132)分裝小試管，每管0.1mL。標(biāo)準(zhǔn)病毒和未知病毒的神經(jīng)氨酸酶應(yīng)在同一試驗(yàn)中測定。B3.3.2 每管補(bǔ)充加入0.1mL生理鹽水，再加入0.1mL用pH5.9 PBS配制的胎球

20、蛋白底物，對照管用鹽水代替病毒，充分混合后置37水浴作用18h。B3.3.3 從水浴中取出試管在室溫冷卻，每管加入0.1mL的過碘酸鹽試劑，充分混合，室溫靜置20min(時間要準(zhǔn))。B3.3.4 每管加入1mL砷試劑，由于碘的釋放出現(xiàn)棕色，搖動試管待棕色消失。B3.3.5 每管加入2.5mL硫代巴比妥試劑，并充分混合(該試劑需在煮沸溶解后加入)，用棉塞將管口堵緊。B3.3.6 立刻將試管置于煮沸的水浴中，煮沸10min，可見紅色出現(xiàn)，即為神經(jīng)氨酸酶活性的表現(xiàn)，顏色越深酶活性越高。B3.3.7 將試管置冰水中冷卻后去掉棉塞，加入4mL丁醇試劑，換上干凈橡皮塞，用手劇烈搖動試管，提取顏色使其轉(zhuǎn)到有

21、機(jī)物(丁醇)相。B3.3.8 以1500r/min離心510min使丁醇層清亮透明，小心地吸出上層的丁醇，放入干凈的試管中待檢。B3.3.9 將上述受檢樣品由高稀釋度到低稀釋度依次傾入透光池中，其中第一個透光池加入無病毒的對照管液，將分光光度計(jì)波長調(diào)至549nm，將對照管調(diào)至零，然后依次讀取每個稀釋度樣品的光密度。B3.3.10 酶單位的計(jì)算：酶活性測定時光密度為0.450.85的病毒稀釋度作為一個酶單位。B3.4 神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)B3.4.1 按上述方法測定酶活性，選用1個酶單位的病毒稀釋度(即酶活性測定時光密度為0.450.85的病毒稀釋度)，每管加入0.1mL。B3.4.2 受檢血清做

22、系列倍比稀釋，每管病毒加入不同稀釋度血清0.1mL，血清對照管是以最低稀釋度血清加生理鹽水代替病毒，37水浴作用1h。以同法做正常血清對照組。B3.4.3 每管加入pH5.9 PBS配制的胎球蛋白0.1mL，充分搖勻，置37水浴中孵育18h。B3.4.4 自水浴中取出試管，按B3.3.3.B3.3.7逐步加入前述各種試劑。B3.4.5 測定光密度時應(yīng)從低稀釋度血清管至高稀釋度血清管，檢測方法同B3.3.9。B3.5 神經(jīng)氨酸酶抑制抗體滴度的計(jì)算法B3.5.1 根據(jù)抗血清和正常血清兩組試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，求得每組血清同一稀釋度的光密度之商數(shù)，即為經(jīng)血清作用后所余之酶活性的百分?jǐn)?shù)。血清稀釋度越高，殘留

23、的酶活性也越高，找出50%酶活性前后兩個血清稀釋度及其相應(yīng)的酶活性百分?jǐn)?shù)，按公式計(jì)算出血清神經(jīng)氨酸酶抑制抗體滴度。B3.5.2 計(jì)算公式式中：A血清神經(jīng)氨酸酶抑制抗體效價(jià)倒數(shù)；B(下標(biāo)始)1(下標(biāo)終)酶活性高于50%的血清稀釋度倒數(shù)；B(下標(biāo)始)2(下標(biāo)終)酶活性低于50%的血清稀釋度倒數(shù)；C(下標(biāo)始)1(下標(biāo)終)高于50%的酶活性的百分?jǐn)?shù)；C(下標(biāo)始)2(下標(biāo)終)低于50%的酶活性的百分?jǐn)?shù)；50常數(shù)。B3.5.3 計(jì)算舉例先計(jì)算血清作用后的酶活性：然后將對數(shù)稀釋度換算為幾何稀釋度：例如10(上標(biāo)始)3(上標(biāo)終)換算為1/1000，10(上標(biāo)始)3.5(上標(biāo)終)換算為1/3200。最后代入公式

24、：此抗血清的神經(jīng)氨酸酶抑制效價(jià)為11440。4 流感快速診斷方法編輯本段C1 直接檢查呼吸道脫落上皮細(xì)胞內(nèi)抗原C1.1 原理由于流感病毒的主要感染部位是在呼吸道上皮細(xì)胞，因此在病人呼吸道標(biāo)本的脫落細(xì)胞中含有流感病毒抗原，通過直接檢查脫落上皮細(xì)胞內(nèi)抗原即可診斷。檢查方法可采用免疫熒光法，一般于34h內(nèi)即可完成，而且可以直接定型。C1.2 標(biāo)本的收集和制片兒童標(biāo)本最好采用負(fù)壓抽吸法收集呼吸道分泌物，成人標(biāo)本最好采用鼻咽洗液。可將每份標(biāo)本分為兩份，一份低溫凍存?zhèn)渥鞑《痉蛛x，一份用pH7.2磷酸緩沖液(PBS)，將粘液吹打散，1500r/min離心15min去除上清，細(xì)胞沉淀用PBS洗12次

25、，末次離心后棄上清，加入適量pH7.2 PBS使細(xì)胞重懸，滴加于帶圈的玻璃片上，自然干燥，冷丙酮固定10min。C1.3 間接免疫熒光法C1.3.1 用10%新鮮羊或牛血清封閉標(biāo)本片，置濕盒中于3730min。C1.3.2 分別加入適當(dāng)稀釋度的抗甲型和乙型流感型特異性單克隆抗體，置濕盒中于37放置1h。在PBS中洗兩次，共10min。C1.3.3 加適當(dāng)稀釋度的兔抗鼠熒光素結(jié)合物置371h。在PBS中洗三次，共10min，末次用蒸餾水過一下。C1.3.4 于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，觀察到三個以上胞漿內(nèi)或胞核內(nèi)熒光陽性細(xì)胞即可判為陽性。C2 標(biāo)本經(jīng)敏感細(xì)胞增殖1代后查抗原C2.1 原理病人呼吸道標(biāo)本經(jīng)接種敏感細(xì)胞(狗腎傳代細(xì)胞MDCK)增殖13d后，將細(xì)胞消化分散制成抗原片，再用免疫熒光法或免疫酶染法檢查細(xì)胞內(nèi)抗原。由于標(biāo)本中的病毒在敏感細(xì)胞增殖后查抗原，能明顯提高其診斷的敏感性，可在細(xì)胞病變出現(xiàn)以前查到抗原，可以直接定型，而且比常規(guī)雞胚分離病毒法要快得多，一般2472h即可診斷。檢查方法可采用間接免疫酶染法(C2.5)或間接免疫熒光法(C2.4)C2.2 標(biāo)本的收集及處理兒童標(biāo)本可采用咽拭子，最好采用負(fù)壓抽吸法；成人標(biāo)本可采用咽漱液，最好采用鼻咽洗