方法學驗證指導原則

1、一、 準確度準確度系指采用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，一般用回收率（ ）表示。準確度應在規(guī)定的范圍內(nèi)測定。1 .化學藥含量測定方法的準確度原料藥采用對照品進行測定，或用本法所得結果與已知準確度的另一個方法 測定的結果進行比較。制劑可在處方量空白輔料中，加入已知量被測物對照品進 行測定。如不能得到制劑輔料的全部組分，可向待測制劑中加人已知量的被測物 對 照品進行測定，或用所建立方法的測定結果與已知準確度的另一種方法測定 結果進行比較。準確度也可由所測定的精密度、線性和專屬性推算出來。2 .化學藥雜質(zhì)定量測定的準確度可向原料藥或制劑處方量空白輔料中加人已知量雜質(zhì)進行測定。如不能得到

2、雜質(zhì)或降解產(chǎn)物對照品，可用所建立方法測定的結果與另一成熟的方法進行比較，如藥典標準方法或經(jīng)過驗證的方法。在不能測得雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的校正因 子或不能測得對主成分的相對校正因子的情況下，可用不加校正因子的主成分自身對照法計算雜質(zhì)含量。應明確表明單個雜質(zhì)和雜質(zhì)總量相當于主成分的重量比 （%）或面積比（ ）。3 .中藥化學成分測定方法的準確度可用對照品進行加樣回收率測定，即向已知被測成分含量的供試品中再精密 加人一定量的被測成分對照品，依法測定。用實測值與供試品中含有量之差， 除 以加入對照品量計算回收率。在加樣回收試驗中須注意對照品的加人量與供試品 中被測成分含有量之和必須在標準曲線線性范圍之內(nèi)；加

3、入對照品的量要適當， 過小則引起較大的相對誤差 ，過大則干擾成分相對減少，真實性差 ?；厥章剩?= （C - A ） /S X 100%式中：A為供試品所含被測成分量；B為加入對照品量； C為實測值。4 .校正因子的準確度對色譜方法而言，絕對（或定量 ）校正因子是指單位面積的色譜峰代表的 待測物質(zhì)的量。待測定物質(zhì)與所選定的參照物質(zhì)的絕對校正因子之比，即為相對校正因子。相對校正因子計算法常應用于化學藥有關物質(zhì)的測定、中藥材及其復方制劑中多指標成分的測定。校正因子的表示方法很多，本指導原則中的校正因子是指氣相色譜法和高效液相色譜法中的相對重量校正因子。相對校正因子可采用替代物（對照品）和被替代物（

4、待測物）標準曲線斜比值進行比較獲得；采用 紫 外吸收檢測器時，可將替代物（對照品）和被替代物（待測物）在規(guī)定波長 和溶劑條件下的吸收系數(shù)比值進行比較，計算獲得。5 .數(shù)據(jù)要求在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度（相當于 100%濃度水平）的供試品，用至少測 定6份樣品的結果進行評價；或設計3種不同濃度，每種濃度分別制備3份供試 品溶液進行測定，用9份樣品的測定結果進行評價。對于化學藥品，一般中間濃 度加入量與所取供試品中待測定成分量之比控制在1 : 1左右，建議高中、低濃度對照品加入量與所取供試品中待測定成分量之比控制在1.2 : 1, 1 : 1 ,0.8 : 1左右，應報告已知加入量的回收率（）,或測

5、定結果平均值與真實值之差及其 相對標準偏差或置信區(qū)間（置信度一般為 95% ）。對于中藥，一般中間濃度加人 量與所取供試品中待測定成分量之比控制在1 : 1左右，建議高、中、低濃度對照品加人量與所取供試品中待測定成分量之比控制在1 .5: 1,1 : 1, 0.5 : 1左右，應報告供試品取樣量、供試品中含有量、對照品加入量、測定結果和回收 率（）計算值，以及回收率（ ）的相對標準偏差（RSD% ）或置信區(qū)間。 對于校正因子，應報告測定方法 、測定結果和RSD% o在基質(zhì)復雜、組分含量 低于0.01%及多成分等分析中，回收率限度可適當放寬。二、精密度精密度系指在規(guī)定的條件下，同一份均勻供試品，

6、經(jīng)多次取樣測定所得結果 之間的接近程度。精密度一般用偏差、標準偏差或相對標準偏差表示。在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結果的精密度稱為重復性；在同一個實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設備測定結果之間的精密度，稱為中間精密度； 在不同實驗室由不同分析人員測定結果 之間的精密度，稱為重現(xiàn)性。含量測定和雜質(zhì)的定量測定應考察方法的精密度。1 .重復性在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度（相當于 100%濃度水平的供試品，用至少測定 6份的結果進行評價；或設計3種不同濃度，每種濃度分別制備 3份供試品溶液 進行測定，用9份樣品的測定結果進行評價。采用9份測定結果進行評價時，對于化學藥，一般中間濃度加入量與

7、所取供試品中待測定成分量之比控制在1:1左右，建議高、中、低濃度對照品加入量與所取供試品中待測定成分量之比控制在1.2 : 1,1 : 1, 0.8 : 1左右，對于中藥，一般中間濃度加入量與所取供試品 中待測定 成分量之比控制在1 : 1左右，建議高、中、低濃度對照品加入量與所 取供試品中待測定成分量之比控制在1.5 : 1, 1 : 1, 0.5 : 1左右。2 .中間精密度考察隨機變動因素如不同日期、不同分析人員、不同儀器對精密度的影響， 應設計方案進行中間精密度試驗。3 .重現(xiàn)性國家藥品質(zhì)量標準采用的分析方法， 應進行重現(xiàn)性試驗，如通過不同實驗室 檢驗獲得重現(xiàn)性結果。協(xié)同檢驗的目的、過

8、程和重現(xiàn)性結果均應記載在起草說明中。應注意重現(xiàn)性試驗用樣品質(zhì)量的一致性及貯存運輸中的環(huán)境對該一致性的 影 響，以免影響重現(xiàn)性結果。4 .數(shù)據(jù)要求均應報告偏差、標準偏差、相對標準偏差或置信區(qū)間。在基質(zhì)復雜、含量低于0.01%及多成分等分析中，精密度接受 范圍可適當放寬。三、 專屬性專屬性系指在其他成分（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）存在下，采用的析方法 能正確測定被測物的能力。鑒別反應、雜質(zhì)檢查和含量測定方法，均應考察其專 屬性。如方法專屬性不強，應采用多種不同原理的方法予以補充。1 .鑒別反應應能區(qū)分可能共存的物質(zhì)或結構相似化合物。不含被測成分的供試品，以及 結構相似或組分中的有關化合物，應均呈陰

9、性反應。2 .含量測定和雜質(zhì)測定采用色譜法和其他分離方法，應附代表性圖譜，以說明方法的專屬性，并應 標明各成分在圖中的位置，色譜法中的分離度應符合要求。在雜質(zhì)對照品可獲得的情況下，對于含量測定，試樣中可加入雜質(zhì)或輔料,考察測定結果是否受干擾，并可與未加雜質(zhì)或輔料的試樣比較測定結果。 對于雜 質(zhì)檢查，也可向試樣中加入一定量的雜質(zhì)，考察各成分包括雜質(zhì)之間能否得到分 離。在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，可將含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣進行 測定，與另一個經(jīng)驗證了的方法或藥典方法 比較結果。也可用強光照射、高溫、 高濕、酸（堿）水解或氧化等方法進行加速破壞，以研究可能存在的降解產(chǎn)物和降 解途徑對含量測定

10、和雜質(zhì)測定的影響。 含量測定方法應比對兩種方法的結果， 雜 質(zhì)檢查應比對檢出的雜質(zhì)個數(shù)，必要時可采用光二極管陣列檢測和質(zhì)譜檢測， 進 行峰純度檢查。四、檢測限檢測限系指試樣中被測物能被檢測出的最低量。 藥品的鑒別試驗和雜質(zhì)檢查 方法，均應通過測試確定方法的檢測限。檢測限僅作為限度試驗指標和定性鑒別 的依據(jù)，沒有定量意義。常用的方法如下。1 .直觀法用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。2 .信噪比法用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把巳知低濃度試樣測出的信號與空白樣 品測出的信號進行比較，計算出能被可靠地 檢測出的被測物質(zhì)最低濃度或量。 一般以信噪比為3 :1或2 : 1時相

11、應濃度或注人儀器的量確定檢測限。3 .數(shù)據(jù)要求上述計算方法獲得的檢測限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進行驗證。應附測定圖譜，說明試驗過程和檢測限結果。五、 定量限定量限系指試樣中被測物能被定量測定的最低量，其測定結果應符合準確度 和精密度要求。對微量或痕量藥物分析、定 量測定藥物雜質(zhì)和降解產(chǎn)物時，應 確定方法的定量限。常用的方法如下 。1 .直觀法用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地定量測定的最低濃度或量。2 .信噪比法用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣 品測出的信號進行比較，計算出能被可靠地 定量的被測物質(zhì)的最低濃度或量。 一般以信噪比為10 :1時相應濃度或注入儀器

12、的量確定定量限。3 .數(shù)據(jù)要求上述計算方法獲得的定量限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進行驗證。應附測定圖譜，說明測試過程和定量限結果，包括準確度和精密度驗證數(shù)據(jù)。六、線性線性系指在設計的范圍內(nèi)，測定響應值與試樣中被測物濃度呈比例關系的程 度。應在規(guī)定的范圍內(nèi)測定線性關系。可用同一對照品貯備液經(jīng)精密稀釋， 或分 別精密稱取對照品，制備一系列對照品溶液的方法進行測定，至少制備5份不同濃度的對照品溶液。以測得的響應信號對被測物的濃度作圖，觀察是否呈線性， 再用最小二乘法進行線性回歸。必要時，響應信號可經(jīng)數(shù)學轉(zhuǎn)換，再進行線性回 歸計算?；蛘呖刹捎妹枋鰸舛软憫P系的非線性模型。數(shù)據(jù)要求：應列出回歸方程、相關系數(shù)

13、和線性圖（或其他數(shù)學模型）。七、范圍范圍系指分析方法能達到一定精密度、準確度和線性要求時的高低限濃度或 量的區(qū)間。范圍應根據(jù)分析方法的具體應用及其線性、準確度、精密度結果和要求確定。 原料藥和制劑含量測定，范圍一般為測定濃度的80%? 120% ;制劑含量均勻度檢查，范圍一般為測定濃度的 70%? 130%,特殊劑型，如氣霧劑和噴霧劑，范 圍可適當放寬；溶出度或釋放度中的溶出量測定，范圍一般為限度的 =30%,如 規(guī)定了限度范圍，則應為下限的-20%至上限的+20% ;雜質(zhì)測定，范圍應根據(jù)初 步實際測定數(shù)據(jù)，擬訂為規(guī)定限度的20%。如果含量測定與雜質(zhì)檢查同時進行， 用峰面積歸一化法進行計算，則線性范圍應為雜質(zhì)規(guī)定限度的-20%至含量限度（或上限的+20%）。在中藥分析中，范圍應根據(jù)分析方法的具體應用和線性 、準確度、精密度 結果及要求確定。對于有毒的、具特殊功效或藥理作用的成分， 其驗證范圍應大 于被限定含量的區(qū)間。校正因子測定時，范圍一般應根據(jù)其應用對象的測定范圍確定。八、耐用性耐用性系指在測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度，為所 建立的方法用于日常檢驗提供依據(jù)。開始研究分析方法時，就應考慮其耐用性。如果測定條件要求苛刻，則應在方法中寫明，并注明可以接受變動的