《細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》教學(xué)大綱 - 蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

1、細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)大綱課程編號(hào)： 課程名稱：細(xì)胞生物學(xué)小實(shí)驗(yàn)選修類型：必修課實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)： 36總學(xué)分：1考核方式：實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)報(bào)告考試開課時(shí)間：第四學(xué)期適合專業(yè)：生命學(xué)院全部專業(yè)實(shí)驗(yàn)教材：細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（第三版），王崇英、高清祥主編，2011，高等教育出版社一、本課程的性質(zhì)和任務(wù)本課程為生物學(xué)各專業(yè)的必修基礎(chǔ)課之一，主要從整體、顯微、分子水平觀察細(xì)胞的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)，將課堂講授的細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ)知識(shí)、基本概念和基本理論與實(shí)際相結(jié)合，同時(shí)進(jìn)行一些相對(duì)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)技術(shù)的操作，培養(yǎng)學(xué)生的相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作技能和初步獨(dú)立進(jìn)行科學(xué)研究的能力?？傮w來說包含三個(gè)部分：光學(xué)顯微鏡的使用、細(xì)胞器的定位與觀察及動(dòng)植物細(xì)胞染色

2、體行為。二、教學(xué)要求與教學(xué)方法1. 學(xué)生動(dòng)手觀察為主，老師講解注釋為輔。2. 實(shí)驗(yàn)從第二周開始，每次3學(xué)時(shí)，部分實(shí)驗(yàn)整合在一起完成。3. 要求1人1組，獨(dú)立完成。4. 要求分期實(shí)驗(yàn)報(bào)告，并入最終成績(jī)。三、教學(xué)學(xué)時(shí)分配和安排周 次實(shí) 驗(yàn) 內(nèi) 容學(xué) 時(shí)第1周普通光學(xué)顯微鏡與高爾基體、中心體的觀察3第2周液泡及線粒體的活體染色與觀察3第3周相差顯微鏡與細(xì)胞核的活體觀察3第4周熒光顯微鏡與葉綠體的活體觀察3第5周細(xì)胞骨架微管、微絲的熒光定位3第6周細(xì)胞的生死狀態(tài)鑒定與細(xì)胞凋亡3第7周小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)3第8周小鼠睪丸染色體標(biāo)本的制備3第9周植物根尖的壓片及有絲分裂過程觀察3第10周植物花藥的

3、壓片及減數(shù)分裂過程觀察3第11周植物花藥的壓片及減數(shù)分裂過程觀察3第12周報(bào)告基因的細(xì)胞水平觀察， 考試3四、教學(xué)內(nèi)容和要求實(shí)驗(yàn)一 普通光學(xué)顯微鏡的原理與使用目的要求 理解普通光學(xué)顯微鏡的機(jī)械系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成及其工作原理；熟練掌握普通光學(xué)顯微鏡的使用方法并進(jìn)行實(shí)際操作；了解高爾基體、中心體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和分布特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)原理 普通正置顯微鏡的構(gòu)造：機(jī)械部分、照明部分和光學(xué)放大。教學(xué)內(nèi)容 了解普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造，掌握顯微鏡的使用方法和保養(yǎng)措施；觀察和了解高爾基體、中心體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和分布特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)材料和用品 顯微鏡，玻片標(biāo)本，香柏油，混合液，棉花。實(shí)驗(yàn)二 液泡及線粒體的活體染色與觀察目的要求

4、觀察和了解活細(xì)胞內(nèi)液泡和線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與分布特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)原理 詹納斯綠（Janus green B）可專一性地對(duì)線粒體進(jìn)行活染,這是由于線粒體內(nèi)細(xì)胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)(即有色狀態(tài)),呈藍(lán)綠色。中性紅（neutral red）對(duì)液泡和溶酶體的染色具有專一性，將活細(xì)胞中的液泡和溶酶體染成紅色。教學(xué)內(nèi)容 用詹納斯綠對(duì)口腔細(xì)胞線粒體進(jìn)行活染并觀察；用中性紅對(duì)植物根尖液泡活染并觀察。實(shí)驗(yàn)材料和用品 植物根尖，顯微鏡，詹納斯綠B，中性紅染液。實(shí)驗(yàn)三 相差顯微鏡與細(xì)胞核的活體觀察目的要求 了解相差顯微鏡的成像原理，熟練掌握相差顯微鏡的操作，對(duì)同一視野下的活細(xì)胞進(jìn)行普通及相差顯微鏡下的

5、觀察比較。實(shí)驗(yàn)原理 相差顯微鏡能觀察到透明樣品的細(xì)節(jié)，適用于對(duì)活體細(xì)胞生活狀態(tài)下的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、增殖情況及細(xì)微結(jié)構(gòu)的觀察。教學(xué)內(nèi)容 熟悉相差顯微鏡的結(jié)構(gòu)和使用方法；用相差顯微鏡觀察未染色的洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞核特征。實(shí)驗(yàn)材料和用品 洋蔥，相差顯微鏡。實(shí)驗(yàn)四 熒光顯微鏡與葉綠體的活體觀察目的要求 了解熒光顯微鏡的成像原理，熟練掌握熒光顯微鏡的操作。在熒光顯微鏡下觀察植物葉綠體的自發(fā)熒光。實(shí)驗(yàn)原理 熒光顯微鏡利用物質(zhì)發(fā)出的熒光來成像。細(xì)胞的有些物質(zhì)成分不經(jīng)過染色就能發(fā)出熒光，稱為自發(fā)熒光，如植物細(xì)胞的葉綠素。教學(xué)內(nèi)容 熟悉熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)和使用方法；用熒光顯微鏡觀察綠色植物葉片的葉綠體分布和特

6、征。實(shí)驗(yàn)材料和用品 植物葉片，熒光顯微鏡。實(shí)驗(yàn)五 細(xì)胞骨架微管、微絲的熒光定位目的要求 掌握微管的間接免疫熒光顯微技術(shù)和微絲直接熒光標(biāo)記定位的原理和方法；觀察微管和微絲在培養(yǎng)細(xì)胞中的形態(tài)及分布方式。實(shí)驗(yàn)原理 本實(shí)驗(yàn)采用人的微管蛋白單克隆抗體作為第一抗體與細(xì)胞內(nèi)的微管蛋白結(jié)合，再使用FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗與一抗結(jié)合，最終在熒光顯微鏡下即可觀察到微管的存在狀態(tài)。鬼筆環(huán)肽（phalloidin）與聚合的微絲具有強(qiáng)親和力，可抑制微絲的解聚，使微絲保持穩(wěn)定狀態(tài)。因此用熒光標(biāo)記物標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色在熒光顯微鏡下可以清晰的顯示細(xì)胞內(nèi)微絲的分布。教學(xué)內(nèi)容 用抗體標(biāo)記培養(yǎng)細(xì)胞的微管、用鬼筆環(huán)肽對(duì)微絲進(jìn)行染

7、色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞骨架。實(shí)驗(yàn)材料和用品細(xì)胞爬片，CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，熒光顯微鏡，微量加樣器，小鼠抗人tubulin的單克隆抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗小鼠的熒光二抗，鬼筆環(huán)肽。實(shí)驗(yàn)六 細(xì)胞的生死狀態(tài)鑒定與細(xì)胞凋亡目的要求 掌握鑒定細(xì)胞生活狀態(tài)的不同染色方法及細(xì)胞的狀態(tài)特征，了解凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。實(shí)驗(yàn)原理 臺(tái)盼藍(lán)是一種陰離子型染料，不能透過完整的細(xì)胞膜，所以經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后只能使死細(xì)胞著色，而活細(xì)胞不被著色。吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙染法也可鑒別死活細(xì)胞。AO能透過質(zhì)膜完整的細(xì)胞，嵌入細(xì)胞核DNA，使之發(fā)出明亮的綠色熒光；EB僅能透過質(zhì)膜受損的細(xì)胞，嵌入核DNA，發(fā)橘紅色熒光。

8、細(xì)胞凋亡時(shí)發(fā)生獨(dú)特的形態(tài)變化，主要表現(xiàn)在：細(xì)胞體積縮小，染色質(zhì)凝集并邊緣化，細(xì)胞膜完整，但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，凋亡晚期可見膜泡從細(xì)胞表面脫落形成凋亡小體。教學(xué)內(nèi)容 用不同染料對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞的染色區(qū)別。用經(jīng)藥物誘導(dǎo)發(fā)生凋亡的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。實(shí)驗(yàn)材料和用品 HL-60細(xì)胞，普通顯微鏡，熒光顯微鏡，離心機(jī)，微量移液器，臺(tái)盼藍(lán)、吖啶橙、溴化乙錠染液。實(shí)驗(yàn)七 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)目的要求 掌握小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外吞噬異物能力的測(cè)定方法；觀察機(jī)體的非特異性免疫現(xiàn)象；掌握小白鼠腹腔注射給藥和小白鼠腹腔巨噬細(xì)胞分離方法。實(shí)驗(yàn)原理 侵入機(jī)體的病原微生物或其它異物能招引組織中的巨

9、噬細(xì)胞，后者細(xì)胞膜凹陷伸出偽足包圍異物，并發(fā)生胞吞作用形成吞噬泡，繼而巨噬細(xì)胞質(zhì)中的溶酶體與吞噬泡融合，消化分解異物。教學(xué)內(nèi)容 首先給小鼠腹腔提前注射含有臺(tái)盼藍(lán)染料的淀粉肉湯，隔天再腹腔注射雞紅細(xì)胞作為異物顆粒，斷椎脫臼處死小鼠并剪開腹腔吸取腹腔液進(jìn)行吞噬觀察。實(shí)驗(yàn)材料和用品 小鼠，1%雞紅細(xì)胞，6淀粉肉湯，4臺(tái)盼藍(lán)(Trypan blue)，：顯微鏡、注射器、滴管、剪刀、鑷子。實(shí)驗(yàn)八 小鼠睪丸染色體標(biāo)本的制備目的要求 掌握動(dòng)物生殖細(xì)胞減數(shù)分裂過程及各個(gè)時(shí)期形態(tài)特點(diǎn)，掌握小鼠睪丸減數(shù)分裂標(biāo)本的制備過程。實(shí)驗(yàn)原理 睪丸是雄性生殖細(xì)胞發(fā)育和成熟的部位，是產(chǎn)生精子的器官。睪丸內(nèi)的曲細(xì)精管從外到內(nèi)分布

10、有精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞以及成熟的精子。取睪丸將曲細(xì)精管內(nèi)的細(xì)胞沖出后固定，然后制片染色，可以觀察到動(dòng)物生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的不同時(shí)相。教學(xué)內(nèi)容 斷椎脫臼處死小鼠并剪開腹腔取睪丸，破碎離心制細(xì)胞懸液，滴片Giemsa染色后進(jìn)行不同類型生殖細(xì)胞的觀察，包括精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精細(xì)胞和精子。實(shí)驗(yàn)材料和用品 雄性小鼠， Giemsa染液，顯微鏡，離心機(jī)，水浴鍋，酒精燈。實(shí)驗(yàn)九 植物根尖的壓片及有絲分裂過程觀察目的要求 學(xué)習(xí)并掌握常規(guī)壓片法制備植物染色體標(biāo)本的基本原理和方法；觀察植物細(xì)胞有絲分裂過程中染色體的形態(tài)特征及染色體動(dòng)態(tài)行為變化。實(shí)驗(yàn)原理 有絲分裂(mit

11、osis)是高等真核生物細(xì)胞分裂的主要方式。其特點(diǎn)是細(xì)胞通過有絲分裂裝置或紡錘體將遺傳物質(zhì)精確地等分到兩個(gè)子細(xì)胞中去，以保證細(xì)胞在增殖的過程中保持遺傳穩(wěn)定。傳統(tǒng)上，人們將有絲分裂過程劃分為前期、前中期、中期、后期、末期和胞質(zhì)分裂6個(gè)時(shí)期。前5個(gè)時(shí)期是一個(gè)先后連續(xù)的核分裂過程，胞質(zhì)分裂則相對(duì)獨(dú)立。教學(xué)內(nèi)容 取植物生長(zhǎng)旺盛的分生組織，如根尖、莖尖、愈傷組織等，經(jīng)過水解軟化細(xì)胞壁后進(jìn)行壓片、或經(jīng)過酶解和低滲處理制成細(xì)胞懸液進(jìn)行滴片，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)的有絲分裂圖像。實(shí)驗(yàn)材料和用品 青稞根尖，混合酶液，卡寶品紅染色液，顯微鏡。實(shí)驗(yàn)十 植物花藥的壓片及減數(shù)分裂過程觀察 目的要求 掌握制備植物細(xì)

12、胞減數(shù)分裂標(biāo)本的壓片技術(shù)；了解高等植物細(xì)胞減數(shù)分裂過程，觀察染色體的動(dòng)態(tài)變化；學(xué)會(huì)區(qū)分植物細(xì)胞減數(shù)分裂的各個(gè)不同時(shí)期。實(shí)驗(yàn)原理 減數(shù)分裂（meiosis）在遺傳上具有重要意義，在分裂過程中包含有同源染色體的配對(duì)、交換、分離和非同源染色體的自由組合，是生物遺傳和變異的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候采集植物的花蕾，擠出花粉母細(xì)胞后直接染色并壓片后制成減數(shù)分裂標(biāo)本，在顯微鏡下觀察可以看到花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的各個(gè)時(shí)期，研究染色體在形態(tài)和數(shù)量上的動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn)。教學(xué)內(nèi)容 用百合花藥切片對(duì)減數(shù)分裂各個(gè)時(shí)期的形態(tài)特點(diǎn)進(jìn)行講解；采集不同植物的花蕾，擠出花粉母細(xì)胞進(jìn)行固定和染色，顯微鏡下進(jìn)行減數(shù)分裂各個(gè)時(shí)期的觀察，掌握時(shí)期觀察。實(shí)驗(yàn)材料和用品 百合花藥切片，開花植物花蕾，卡寶品紅顏色液，顯微鏡。實(shí)驗(yàn)十一 報(bào)告基因的細(xì)胞水平檢測(cè)目的要求 熟悉GUS報(bào)告基因的技術(shù)原理，了解其在細(xì)胞水平上的原位檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)原理 GUS基因存